专利名称：一种研究药物和血清蛋白之间相互作用的方法及其专用的微流控芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物筛选技术，特别提供了一种研究药物和血清蛋白之间 相互作用的方法及其专用的微流控芯片。
背景技术：
进入血液里的药物，大多数会同血清蛋白发生可逆的结合反应。这一 结合反应极大地影响了药物在体内的输送、分布、新陈代谢、排泄等性质。 更为重要的是，这一反应直接决定了该药物的治疗效果，因为只有游离的 药物才能发挥药理作用。只有药物的游离浓度控制在合适的范围内才能取 得理想的治疗效果。如果药物同血清蛋白的结合比比较高，不但会降低药 物的有效浓度，抑制药物的疗效，还会延长药物的半衰期，增强药物的毒 性。相反，如果药物同血清蛋白的结合比比较低，则限制了药物进入受体 部位的能力，也不能取得良好的药理作用。因而研究药物和血清蛋白的结 合反应，掌握它们的结合程度，可以筛选出具有不利结合性质的药物。 目前，研究药物和蛋白质相互作用的方法比较多，主要有以下几种。1、文献1 J. P. Life Sci. 1988,43,2103-2115,平衡透析法。此方法是将药 物与血清蛋白质的混合物，放入只能透过药物等小分子，而蛋白等大分子不能透过的透析袋里。然后将此透析袋浸入在一个已知体积的、药物浓度 (1/K左右，结合常数)的溶液里。平衡一段时间后，通过测定透析袋外溶液中药物的浓度来确定K和n (结合位点数)值。该方法操作简单，仪器设 备也不复杂，目前被确认为研究药物和血清蛋白的相互作用的基准方法。 但该方法存在样品消耗大、平衡时间太长、体积变化、非特异性吸附等缺 点。 一个简单的实验通常需要几天甚至几周才能完成。2、 文献2J.Pharm.Sci.l981，70，146-150，超滤方法。超滤也是应用比较 广泛的用来研究药物和蛋白质之间相互作用的技术。该技术避免了稀释影 响和体积变化。但存在着因非特异性吸附和泄露引起的误差。3、 文献3J.Chromatogr.B1999，725，113-137，亲和色谱法。亲和色谱法的 作法是将蛋白质固定在基质上，注入含有药物的缓冲液之后，进行特异性 或非特异性洗脱。通过分析洗脱曲线，测定药物和血清蛋白的结合常数。 该方法只能测定结合常数值，不能得到结合位点数值。蛋白的固定限制了 其折叠能力，降低了蛋白的活性，并且蛋白柱价格昂贵。这种方法所需样 品量也比较大，分析时间长，通常需要几个星期甚至几个月。4、 文献4Y.S.Ding, X. F. Zhu， Chromatographic 1999， 343-346，毛细 管电泳法。此方法是将蛋白和药物混和孵育后，进行电泳分离，通过药物 或者蛋白的峰高或峰面积变化来确定药物和蛋白是否有结合以及它们的结 合常数和结合位点数。此方法具有较高的分离效率，分析速度快，样品用 量少以及能够在生理条件下操作等优点。但该方法的重复性不是很好。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高分离效率、快速、高灵敏度、样品用量 少、可在生理条件下操作的研究药物和血清蛋白相互作用的方法，及其专用的多功能微流控芯片。本发明提供了一种用于研究药物和蛋白相互作用的多功能微流控芯 片，其特征在于芯片有三个单元构成第一个单元为一个单T型的基本分离单元，用于基准物质的分析，来 校正检测信号。第二个单元为多个串连的T型基本分离单元，用于绘制检测对象的工 作曲线。第二个分离单元的上端与第一个分离单元的下游直接相连。第三个单元也为多个串连的T型基本分离单元，用于测定混合物中检测对象的游离浓度，来判断有无结合及测定相应的参数。第三个分离单元 的上端与第二个分离单元的下游直接相连。本发明所提供的多功能微流控芯片，为了节约费用以及便于控制，三 个单元公用一个监测点。徼通道的宽度和深度在10-100微米范围内。 第二个、第三个分离单元的基本分离单元最好为6-10个。 基于上述多功能微流控芯片，本发明还提供了一种研究药物和血清蛋 白相互作用的方法。该方法的基本特征在于以下过程首先将基准物质、检测对象(蛋白或者药物)的不同浓度溶液、按不 同比例混合的药物和蛋白的混合物分别放入第一个、第二个、第三个单元 的相应的样品池中。然后对第一个单元的储液池、缓冲液、废液池施加电 压，进行进样、，分离操作。当基准物质的峰出现后，依次对第二个、第三 个单元的各个基本分离单元的样品池、缓冲池、废液池施加电压，使样品进行进样、分离的操作。在上述的操作中，维持相同的进样时间、进样场强和分离场强。但对使用的场强无特殊要求，只要在该场强下能够获得检 测对象的较好峰形，即可。以基准物质校正检测信号下，根据第二个单元 的数据，绘制浓度-峰高或者峰面积工作曲线，然后以次为依据测定第三个 单元中各混合物中检测对象的游离浓度，从而得到结合常数和结合位点数 值。本发明所用的基本分离单元为简单的，带有3个储液池的T型单元。 短通道为样品通道，长通道为分离通道，储液池中放样品的一段为样品通 道的进样端，分离通道上下游端的为装有缓冲液的缓冲池、废液池。 微流控芯片技术是当前仪器分析的研究热门和重点，其主要以分析化学和 生物化学为基础，利用微机电加工技术，在硅、玻璃、石英、高聚物表面 加工出10-100微米的微通道网络，主要以电渗流和电泳流为驱动力，通过 改变驱动电压，控制流体在微通道网络中的流动方向和速率，从而实现对 目标分析物的采样、稀释、富集、萃取、混合、反应、分离、检测等。但 是到目前为止，微流控芯片用于研究药物和血清蛋白相互作用报道非常之 少。本发明创造性地设计了用于药物筛选的多功能微流控芯片，可实现通 过一次在线分析得到结合常数和结合位点数值，这点还未见报道。整个实 验可以在几分钟内完成，样品消耗在微升级。本发明与平衡透析、亲和色 谱、超滤、亲和电泳等已经用于药物蛋白相互作用的研究方法比，具有快 速、灵敏、高分离效率、样品用量少等优势。总之，本发明可在一块小小 的槊料或玻璃片上，非常短的时间内完成药物和血清蛋白之间相互作用的 研究，具有很髙的灵敏度和低的检测限。
图1为本发明的结构原理图；图2为实施例1中的人血清白蛋白的工作曲线；图3为实施例1中的人血清白蛋白和肝素混合前后的电泳谱图；图4为实施例2中的人血清白蛋白的工作曲线；图5为实施例2中的人血清白蛋白和不同浓度的卟啉混合的电泳谱图。
具体实施例方式如图1所示首先将基准物质、检测对象(蛋白或者药物)的不同浓 度溶液、按不同比例混合的药物和蛋白的混合物分别放入第一个、第二个、 第三个单元的相应的样品池中。然后对第一个单元的储液池、缓冲液、废 液池施加电压，进行进样、分离操作。控制进样时间，使基准物质呈尖峰 或平台峰。采用同样条件依次处理其他样品。根据第二个单元中检测对象 的峰髙或峰面积，绘制出相应的工作曲线。再根据第三个单元中检测对象 游离浓度的变化，判断药物和蛋白之间有无结合，并求出相应的结合常数 和结合位点数。实施例l肝素是一种高硫酸化的线形多聚糖。肝素具有多种生物活性，如抗凝、 抗炎、抗病毒、抗血栓和抗脂血等。肝素临床上主要用作抗凝剂，也可用 作抗血栓和抗脂血。本实施例主要研究肝素和血清蛋白之间的相互作用。 采用罗丹名B作为基准物质。使用的玻璃芯片的微通道的宽度为50微米， 深度为15微米。将罗丹名B、人血清白蛋白(1.36-21.77UM)、人血清白蛋白和不同浓度的肝素混合液(21.77WM人血清白蛋白和125.49， 250.98， 376.50， 501.96， and 627,45 U M的肝素)分别放入第一、第二、第三个单元 的样品池中。在第一个单元的样品池和废液池加上电压，维持场强在 300V/cm，进样19s后，在缓冲池和废液池上加上电压，维持场强在500 V/cm,进行分离。当罗丹名B完全通过检测点形成平台峰后，在同样的条 件下依次对各个基本分离单元的样品进行相同的操作。结果如图2、 3所示。 从图3中可以看出，与肝素混合后的人血清白蛋白的峰明显降低，并且有 展宽的趋势。这表明肝素和人血清白蛋白之间存在相互作用。从这个实验 得到的结合常数和结合位点数值与文献相符。整个测定过程在15分钟内完 成，其他的分析技术根本无法在如此短的时间内完成整个分析过程。 实施例2本实施例类似于实施例1，研究的也是肝素和血清蛋白之间的相互作 用。区别在于1、 使用的玻璃芯片的微通道的尺寸不同，宽度为70微米，深度为20 微米。2、 进样场强为500V/cm，进样时间为lls。3、 分离场强为800V/cm。本实施例所观察到的实验现象与实施例1的现象吻合，所测得的结合常数和结合位点数值也与实施例1的测量值相符。但因为使用了比实施例1高的场强，整个测定过程的时间縮短至1 1分钟。 实施例3卟啉在临床上用作光动力学治疗癌症的光敏剂。研究表明血清白蛋白可以作为卟啉的内源载体实现光动力学治疗癌症。为了加深理解作用机理， 卟啉和血清白蛋白之间的相互作用常数无疑是十分重要的参数。本实施例 研究了卟啉和人血清白蛋白之间的相互作用。使用的玻璃芯片的微通道的宽度为60微米，深度为18微米。除采用荧光素钠作为基准物质和进样时 间改为5s外，其他操作类似实施例1。图4、 5给出了实验结果。从图5中， 可以看出随着卟啉浓度的增加，血清白蛋白的峰逐渐降低。这表明了卟啉和 血清白蛋白之间存在结合反应。所求得的结合常数及结合位点数与文献相 符。整个分析过程在5分钟内完成。 实施例4本实施例类似于实施例3 ,研究了卟啉和人血清白蛋白之间的相互作 用。区别在于1、 使用的玻璃芯片的微通道的尺寸不同，宽度为40微米，深度为15 微米。2、 进样场强为600V/cm，进样时间为2.5s。3、 分离场强为900V/cm。本实施例所观察到的实验现象与实施例3的现象吻合，所测得的结合 常数和结合位点数值也与实施例3的测量值相符。但因为使用了比实施例 3高的场强，整个測定过程的时间縮短至2分钟。注在以上两个实施例中，使用了PH7.4的磷酸缓冲液。
权利要求
1. 一种用于研究药物和血清蛋白质之间相互作用的多功能微流控芯片，其特征在于芯片由三个单元组成第一个单元为一个单T型的基本分离单元；第二个单元为多个串联的单T型的基本分离单元；第三个单元为多个串连的单T型的基本分离单元；第二个、第三个单元的上游端分别与前一个单元的下游端相连。
2、 按照权利要求1所述用于研究药物和血清蛋白质之间相互作用的多 功能微流控芯片，其特征在于所述的三个单元的下游端公用一个检测口。
3、 按照权利要求1所述用于研究药物和血清蛋白质之间相互作用的多 功能微流控芯片，其特征在于三个单元公用一个缓冲池、 一个废液池。
4、 按照权利要求书1或2的用于研究药物和血清蛋白质之间相互作用 的多功能微流控芯片，其特征在于所述的第二个、第三个单元的基本分离 单元为6 — 1 0个。
5、 一种研究药物和血清蛋白质之间相互作用的方法，其特征在于 ——使用专用的多功能微流控芯片，该多功能微流控芯片由三个单元组成第一个单元为一个单T型的基本分离单元； 第二个单元为多个串联的单T型的基本分离单元； 第三个单元为多个串连的单T型的基本分离单元； 第二个、第三个单元的上游端分别与前一个单元的下游端相连；过程如下将基准物质、检测对象蛋白或者药物的不同浓度溶液、按不同比例混合 的药物和蛋白的混合物分别放入第一个、第二个、第三个单元的相应的样 品池中；然后对第一个单元的储液池、缓冲液、废液池施加电压，进行进 样、分离操作；当基准物质的峰出现后，依次对第二个、第三个单元的各 个基本分离单元的样品池、缓冲池、废液池施加电压，使各个样品在相同 的场强下进行进样、分离的操作；以基准物质校正检测信号下，根据第二 个单元的数据，绘制浓度-峰高或者浓度-峰面积工作曲线，然后以此曲线为 依据测定第三个单元中各混合物中检测对象的游离浓度，从而得到结合常 数和结合位点数。
6. 按照权利要求书5所述的药物和血清蛋白质之间相互作用的研究方 法，其特征在于所有的样品都在相同的场强下，进行进样和分离。
7. 按照权利要求书5所述的药物和血清蛋白质之间相互作用的研究方 法，其特征在于所有样品的进样时间都相同。
全文摘要
一种用于研究血清蛋白和药物相互作用的多功能微流控芯片，由三个单元组成。每个单元的分离通道上游端与上一个单元的下游端相连。研究过程如下将基准物质、不同浓度的检测对象、按不同比例混合的药物和蛋白的溶液分别放入第一个、第二个、第三个单元的样品池中。依次对各个样品池中的样品进行同场强下的进样、分离等电泳操作。以基准物质来校正检测信号，根据第二单元的数据绘制工作曲线，根据第三单元的数据得到结合常数和结合位点数。本发明可以在蚀刻有宽度和深度在10-100微米范围内的微通道的槊料或玻璃片上，在极短的时间内通过一次在线分析，完成药物和蛋白相之间互作用的研究。整个实验可以在几分钟内完成，样品消耗在微升级。此外，本发明具有很高的灵敏度和低的检测限。
文档编号G01N33/68GK101266250SQ200710010588
公开日2008年9月17日 申请日期2007年3月14日 优先权日2007年3月14日
发明者刘晓君, 戴忠鹏, 林炳承, 秦建华 申请人:中国科学院大连化学物理研究所