专利名称：一种无需聚合酶链式反应的点突变方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种无需聚合酶链式反应的点突变方法及其试剂盒。
背景技术：
随着后基因组时代的到来，基因功能的研究成为生命科学研究的热点。基因定点突变技术已成为研究基因功能、改造基因和载体修饰的基本手段和有力工具。它的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活性或者动力学特性，以及药物研发、基因治疗等方面。基因定点突变技术最初以单链DNA作为模板，然而单链的制备费时且在技术上较困难，随后这种技术得到不断改进，已发展成为能够对双链质粒DNA分子进行操作，并且形成了许多产品。
目前定点突变产品可以分为两类。一类是利用PCR(聚合酶链式反应)的方法。它的设计原理如下首先利用一对包含突变碱基的引物与质粒模板退火；然后，用DNA聚合酶合成突变链；最后消化模板链，PCR扩增得到含点突变的质粒。此类点突变方法的试剂盒例如，Quikchangesite-directed mutagenesiskit，Quikchange multi site-directedmutagenesis kit(Stratagene，USA)；GeneTailer mutagenesis kit(Invitrogen，USA)等等。该方法能快速引入突变点，但是这种方法由于PCR过程的低保真性，碱基错配(一般来说，每400个碱基有一个错配的)会引入其它不需要的点突变；并且这种点突变方法要受到载体大小的限制(＜8Kb)。
另一类常用的点突变方法是利用T4 DNA聚合酶或T7 DNA聚合酶合成突变链，并进一步采用单酶切位点消除法(可使用的试剂盒有Transformer site-directed mutagenesis Kit(Clontech，USA))，抗生素选择法(可使用的试剂盒有GeneEditor in vitro site-directedmutagenesis system，Altered Sites II mammalian mutagenesis system(Promega，USA))，或尿嘧啶脱糖苷酶选择法消化模板链(可使用的试剂盒有Muta-Gene in vitro mutagenesis kits(Bio-Rad，USA)，Mutan-Ksite-directed mutagenesis systems(Panvera，USA))，整个过程不需要PCR。这种无需PCR的点突变方法具体原理介绍如下1.利用单酶切位点消除法定点突变系统的原理该方法需要根据准备突变的质粒自行设计两条引物(同一方向，对同一单链模板)，一条引物包含计划定点突变的序列，另一条引物包含质粒上某一个单酶切位点，在单酶切位点中引入突变。首先，两条引物与同一条模板链退火，用T4 DNA聚合酶聚合延伸，两段包含突变位点的延伸产物经T4 DNA连接酶连接成环，并和模板链组成带有两处错配的杂和环。然后，对反应产物进行单酶切后，直接转化错配修复缺陷株，在该宿主菌中，质粒复制时错配碱基不被修复。原来的双链质粒模板被切开而不能转化，而杂合质粒由于一条链上单酶切位点引入突变而不被切开，仍保持环状，质粒得以转化。接着，转化子的杂合双链在E.coli的复制过程中分开，再经过一轮提质粒、单酶切、转化，最后得到纯合的突变质粒。最后，再用该酶切割，未发生突变的链被识别并切割成线性DNA分子，用这种方法可以筛选得到突变质粒。
但是，这种方法过程复杂，需要经过酶切，转化，再经过提质粒、单酶切、转化才能实现；并且所用的酶切位点在质粒上必须是只有一个，这种单酶切位点的选择有时较困难，这也限制了该种方法的应用。
2.利用抗生素选择法定点突变系统的原理这种方法的基本原理同上，该方法需要根据准备突变的质粒自行设计两条引物(同一方向，对同一单链模板)，一条引物包含计划定点突变的序列，另一条引物包含激活质粒上一个抗生素基因的序列。首先，两条引物与同一条模板链退火，用T4 DNA聚合酶聚合延伸，两段包含突变位点的延伸产物经T4 DNA连接酶连接成环，并和模板链组成带有两处错配的杂和环。然后，直接转化错配修复缺陷株，并用相应的抗生素筛选包含突变的克隆。该方法与上述方法的不同之处在于通过引物突变抗生素基因，利用对抗生素的抗性和敏感性，在体内筛选突变质粒和非突变质粒。根据这种原理Promega公司开发了点突变系统(Altered Sites IImammalian mutagenesis system)。Altered Sites II突变系统适用于含有失活的氨变抗生素抗性基因特定的pALTER载体系列，其包含两种类型的抗生素抗性(氯霉素乙酰转移酶基因和β内乙酰氨酶的基因)，可完成多轮突变，而无需亚克隆。每次突变反应，仅一个基因是有功能的。这种系统的核心是用引物突变抗生素基因，通过抗性基因转换筛选突变质粒和非突变质粒。与Altered Sites II系统不同，GeneEditor利用改变β内乙酰氨酶对底物的特异性选择来筛选突变质粒和非突变质粒。β内乙酰氨酶对青霉素及其类似物具有抗性。通过突变编码β内乙酰氨酶的基因来改变酶对底物的特异性选择。含有突变的细胞对青霉素类似物的抗性增加，变化的抗性是突变链选择的基础。该系统的优点是任何包含氨变青霉素抗性的载体都可以应用这种突变系统；具有高的突变效率。但是该方法也需要进行两次转化，为了提高突变效率，第一次需转化到错配修复的缺陷型菌株，因此受到宿主菌的限制。
3.利用尿嘧啶脱糖苷酶选择法定点突变系统的原理该方法的基本原理是，在突变之前将模板转化到尿苷三磷酸和尿嘧啶脱糖苷酶双缺陷的菌株中生长，因此从中制备的DNA模板含有尿嘧啶碱基。该方法包括如下步骤首先将含突变的引物退火到这种模板DNA链上，T4 DNA聚合酶或T7DNA聚合酶聚合合成突变链；然后，将其转化到含尿嘧啶脱糖苷酶大肠杆菌菌株，含尿嘧啶的野生型模板链在尿嘧啶脱糖苷酶的作用下降解，新合成的链不含尿嘧啶所以不会被降解而在宿主体内复制。该方法同样具有高保真性、高突变率。它不同于单酶切位点消除法的一个主要优点是不受模板特殊序列的要求，该方法的缺点在于模板制备时对宿主菌的要求，宿主菌必须是尿苷三磷酸和尿嘧啶脱糖苷酶双缺陷的菌株。
利用T4或T7 DNA聚合酶的方法具有高保真和不受载体大小的限制的优点，所以可以克服PCR方法的缺点。但是这些方法操作繁琐费时，需要多次转化和鉴定克隆，难以适应高通量的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用聚合酶和连接酶，经两次变性，退火，和聚合，完成定点突变的方法，并提供了该方法的试剂盒。本发明的方法可克服现有点突变方法中步骤繁琐，操作费时的缺陷；将此方法做成试剂盒，将大大方便使用者，为基因功能，蛋白结构和功能的研究提供良好的技术平台。
本发明的设计原理(见图1)先将质粒模板变性解链成两条单链；用包含有突变碱基的寡核苷酸引物与质粒单链靶基因退火，利用聚合酶延伸，连接酶连接得到含有一条突变链的杂合环状质粒DNA；将该单链突变的质粒变性，解链成两条单链；以突变链为模板的通用引物(或称选择引物)，与突变链退火，聚合酶延伸，合成另一条突变链，得到双链上有对应点突变位点的双链突变质粒；最后用DpnI限制性内切酶消化去除非突变模板。因为DpnI酶识别甲基化的酶切位点(DpnI酶切位点在每256碱基中出现一次)，而来源于大肠杆菌的质粒大都含有该酶识别的甲基化位点。利用该酶的这种特点，可使其中不包含突变的质粒和单链突变的质粒被酶切为线性，无法在感受态细胞中转化。而双链突变质粒是由去甲基化碱基合成的，不会被DpnI所酶切，该质粒转化感受态细胞后经扩增即可得到大量的突变双链质粒。
本发明的方法包括如下步骤(见图1)1)质粒模板变性，含点突变的引物与模板退火；2)加入DNA聚合酶和DNA连接酶，用来合成突变链，并封闭切口；3)第二步变性，加入选择引物并与步骤2)得到的突变链退火；4)用DNA聚合酶聚合，合成另一条突变链；5)在步骤4)的产物中加入DpnI限制性内切酶，消化去除非突变模板。
优选步骤1)中引物和模板的摩尔比为(50-1000)1；优选步骤2)或4)中的DNA聚合酶为T4或T7 DNA聚合酶，进一步优选DNA连接酶为T4 DNA连接酶；还可在步骤2)中加入T4 DNA多核苷酸激酶；优选步骤4)之后还包括用连接酶封闭切口。
T4 DNA多核苷酸激酶是用来磷酸化引物的5’端，因为如果使用5’端未磷酸化的引物，聚合后5’端核苷酸缺少磷酸基则不能通过DNA连接酶来形成闭环。
“选择引物”也可称作通用引物，它的特点是和相对于突变引物退火的另一条链退火，即可与合成的突变链退火。
步骤4)完成聚合后，可以继续进行酶连封闭缺口，形成闭环；也可以不需要酶连，因为转化到大肠杆菌后，可以利用大肠杆菌体内的酶系统，发生磷酸化和连接。
本发明方法的试剂盒包括溶液1双链质粒DNA退火缓冲液；溶液2合成缓冲液；溶液3DNA聚合酶溶液；溶液4DNA连接酶溶液；溶液5T4 DNA多聚核苷酸激酶溶液；溶液6DpnI酶溶液；溶液7对照载体及引物。
溶液1双链质粒DNA退火缓冲液是指实现引物和质粒DNA退火的缓冲液，溶液1优选含10mM Tris-HCl pH8.0和1mM EDTA的溶液，或含100mM Tris-HCl pH7.5、100mM MgCl2和100mM DTT的溶液溶液2合成缓冲液是指适用于聚合酶聚合以及DNA连接酶连接的缓冲液，溶液2优选为100mM Tris-HCl pH7.5，100mM MgCl2，100mMDTT，1mM ATP和25ug/ml BSA组成的溶液溶液3DNA聚合酶溶液，优选为T4 DNA聚合酶或T7 DNA聚合酶溶液.
溶液4DNA连接酶溶液，优选为T4 DNA连接酶溶液.
本发明的优点由于无需PCR，使得该突变过程高保真，不会引入其它额外的突变；并且该方法价格低廉，采用的都是常规试剂；由于无需多步转化和鉴定克隆，因此该方法省时，快速，操作简单；并且该方法不受载体和宿主菌的限制。
图1为本发明的点突变方法设计原理示意图其中1质粒模板2为含突变位点的引物3为突变位点4为单链突变的质粒5为选择引物6为双链突变的质粒具体实施方式
材料质粒pCMV/myc/cyto/GFP(5.8 Kb，Invitrogen，USA)dNTPs(Invitrogen，USA)，引物(SBS基因公司合成)。T4 DNA聚合酶(Promega，USA)；T7 DNA聚合酶(New England BioLabs)；T4 DNA连接酶(Promega，USA)。10×合成缓冲液(100mM Tris-HCl(pH7.5)100mM MgCl2100mMDTT 1mM ATP 25ug/ml BSA)；Dpn I(Promega，USA)，T4 DNA多核苷酸激酶(Promega，USA)。退火缓冲液1(10mM Tris-HCl(pH8.0)1mMEDTA)；退火缓冲液2(100mM Tris-HCl(pH7.5)，100mM MgCl2，100mMDTT)。
引物设计原理以pCMV/myc/cyto/GFP为模板，突变GFP基因。
以pCMV/myc/cyto/GFP中正义链为模板设计突变引物，以其反义链设计另一条引物(我们称之为选择引物)(下表)。引物设计时突变点位于引物中间，突变点两侧大约15个核苷酸，GC含量大于50％，且5’和3’以C或G结尾。
实施例1引物(5’端经磷酸化)与模板的摩尔比例为100∶11.第一步模板变性及引物与模板退火模板500ng突变引物1 130ng退火缓冲液1 2μlH2O20-X反应条件上述混合物在100℃反应5分钟；迅速冰浴5分钟；室温30分钟，得到退火混合物。
X表示除了H2O以外的其它溶液体积之和(下面各实施例X同此解释).
2.突变链合成及切口连接退火混合物 20μl10×合成缓冲液 3μlT4 DNA聚合酶 1μlT4 DNA连接酶 1μl
10mM dNTPs 1.5μlH2O 3.5μl冰浴5分钟，室温5分钟，37℃，水浴2小时。
3.第二步变性和退火在上述步骤2的产物中加入选择引物100ng，100℃反应5分钟；迅速冰浴5分钟；室温放置30分钟，得到变性混合物。
4.第二步聚合变性混合物 31μlT4 DNA聚合酶 1μl10×合成缓冲液 1μlH2O 7μl冰浴5分钟；室温5分钟；37℃水浴2小时。
5.非突变模板的消化在步骤4得到的产物中加入DpnI 10units，37℃水浴1小时。
6.用纯化柱纯化(Promega company，Wizard PCR purificationsystem)，得到纯化产物。
7.转化转化1.纯化产物加50μl感受态细胞(Top 10)冰浴30分钟。
2. 42℃热击45秒，立即置于冰浴2分钟。
3.加无氨变的LB培养基950μl，在37℃225转培养1小时。
4. 4000转离心30秒。去上清，留100μl涂板。
5.置于烘箱37℃培养16小时。
6.随机挑选克隆，测序。
实施例2两个点突变引物(5’端经磷酸化)与模板的摩尔比为200∶11.第一步模板变性及引物与模板退火模板500ng突变引物1 260ng突变引物2 260ng退火缓冲液2 2μl
H2O 20-X100℃ 5分钟；迅速冰浴5分钟；室温30分钟，得到退火混合物。
步骤2，3，4，5，6和7同实施例1.
实施例3引物(5’端经磷酸化)与模板的摩尔比为100∶11.第一步模板变性及引物退火模板模板 500ng突变引物1130ng退火缓冲液1 2μlH2O 20-X100℃ 5分钟；迅速冰浴5分钟；室温30分钟，得到退火混合物。
2.DNA聚合及切口连接退火混合物 20μl10×合成缓冲液 3μlT7 DNA聚合酶 1μlT4 DNA连接酶 1μl10mM dNTPs 1.5μlH2O 3.5μl冰浴5分钟，室温5分钟，37℃，水浴30分钟。
3.第二步变性和退火加入选择引物100ng，100℃ 5分钟；迅速冰浴5分钟；室温30分钟，得到变性混合物。
4.第二步聚合变性混合物 31μlT7 DNA Polymerase1μl10×合成缓冲液 1μlT4 DNA连接酶 1μlH2O 6μl
冰浴5分钟；室温5分钟；37℃水浴30分钟。
5.非突变模板的消化在步骤4得到的产物中加入DpnI 10 units，37℃水浴1小时。
6.用纯化柱纯化(Promega company，Wizard PCR purificationsystem)7.转化同实施例1。
实施例4引物(引物5’端未磷酸化)与模板的摩尔比为1000∶11.第一步模板变性及引物与模板退火模板 500ng突变引物11300ng退火缓冲液1 2μlH2O 20-X100℃ 5分钟；迅速冰浴5分钟；室温30分钟，得到退火混合物。
2.突变链合成及切口连接退火混合物20μl10×合成缓冲液3μlT4 DNA聚合酶 1μlT4 DNA连接酶 1μlT4 DNA多核苷酸激酶1μl10mM dNTP 1.5μlH2O 2.5μl冰浴5分钟，室温5分钟，37℃，水浴2小时。
3.第二步变性和退火加入选择引物100ng，100℃ 5分钟；迅速冰浴5分钟；室温30分钟，得到变性混合物。
4.第二步聚合变性混合物31μlT4 DNA聚合酶 1μl
10×合成缓冲液1μlH2O 7μl冰浴5分钟；室温5分钟；37℃水浴2小时。
5.非突变模板的消化在步骤4得到的产物中加入DpnI 10units，37℃水浴1小时。
6.用纯化柱纯化(Promega company，Wizard PCR purificationsystem)7.转化(同实施例1)实施例5引物(引物5’端未磷酸化)与模板的摩尔比为100∶11.第一步模板变性及引物与模板退火模板500ng突变引物1 130ng退火缓冲液2 2μlH2O20-X100℃ 5分钟；迅速冰浴5分钟；室温30分钟，得到退火混合物。
2.突变链合成及切口连接退火混合物 20μl10×合成缓冲液 3μlT7 DNA聚合酶1μlT4 DNA连接酶1μlT4 DNA多核苷酸激酶 1μl10mM dNTP 1.5μlH2O2.5μl冰浴5分钟，室温5分钟，37℃，水浴30分钟。
3.第二步变性和退火加入选择引物100ng，100℃5分钟；迅速冰浴5分钟；室温30分钟，得到变性混合物。
4.第二步聚合变性混合物 31μl
T7 DNA聚合酶1μl10×合成缓冲液 1μlH2O7μl冰浴5分钟；室温5分钟；37℃水浴2小时。
5.非突变模板的消化在步骤4得到的产物中加入DpnI 10units，37℃水浴1小时。
6.用纯化柱纯化(Promega company，Wizard PCR purificationsystem)7.转化(同实施例1)
权利要求
1.一种无需聚合酶链式反应的点突变方法，包括如下步骤1)质粒模板变性，含点突变的引物与模板退火；2)加入DNA聚合酶和DNA连接酶，用来合成突变链，连接酶封闭突变链的切口；3)第二步变性，加入选择引物并与步骤2)得到的突变链退火，得到变性混合物；4)在步骤3)得到的变性混合物中加入DNA聚合酶，聚合得到另一条突变链；5)在步骤4)的产物中加入DpnI限制性内切酶，消化去除非突变模板。
2.根据权利要求1所述的无需聚合酶链式反应的点突变方法，其特征在于步骤1)中引物和模板的摩尔比为(50-1000)∶1。
3.根据权利要求1所述的无需聚合酶链式反应的点突变方法，其特征在于步骤2)中的DNA聚合酶为T4或T7 DNA聚合酶。
4.根据权利要求1所述的无需聚合酶链式反应的点突变方法，其特征在于步骤4)中的DNA聚合酶为T4或T7 DNA聚合酶。
5.根据权利要求1所述的无需聚合酶链式反应的点突变方法，其特征在于在步骤2)中加入T4 DNA多核苷酸激酶。
6.根据权利要求1所述的无需聚合酶链式反应的点突变方法，其特征在于步骤4)之后还包括用DNA连接酶封闭切口。
7.根据权利要求1或6所述的无需聚合酶链式反应的点突变方法，其特征在于所述的DNA连接酶为T4 DNA连接酶。
8.一种无需聚合酶链式反应的点突变试剂盒，包括溶液(1)双链质粒DNA退火缓冲液；溶液(2)合成缓冲液；溶液(3)DNA聚合酶溶液；溶液(4)DNA连接酶溶液；溶液(5)T4 DNA多聚核苷酸激酶溶液；溶液(6)DpnI酶溶液，溶液(7)对照载体及引物。
9.根据权利要求8所述的无需聚合酶链式反应的点突变试剂盒，其特征在于溶液(1)双链质粒DNA退火缓冲液为含10mM Tris-HCl pH 8.0和1mM EDTA的溶液，或含100mM Tris-HCl pH 7.5、100mM MgCl2和100mM DTT的溶液。
10.根据权利要求8所述的无需聚合酶链式反应的点突变试剂盒，其特征在于溶液(2)合成缓冲液为100mM Tris-HCl pH 7.5，100mMMgCl2，100mM DTT，1mM ATP和25ug/ml BSA组成的溶液。
11.根据权利要求8所述的无需聚合酶链式反应的点突变试剂盒，其特征在于溶液(3)为T4 DNA聚合酶或T7 DNA聚合酶溶液。
12.根据权利要求8所述的无需聚合酶链式反应的点突变试剂盒，其特征在于溶液(4)为T4 DNA连接酶溶液。
全文摘要
本发明涉及一种无需聚合酶链式反应的点突变方法及其试剂盒。该方法先将质粒模板变性，含点突变的引物与模板退火；然后加入DNA聚合酶和DNA连接酶，用来合成突变链，并封闭切口；接着进行第二步变性，加入选择引物并与突变链退火；用聚合酶聚合，合成另一条突变链；最后在产物中加入DpnI限制性内切酶，消化去除非突变模板。该方法由于无需PCR，使得该突变过程高保真，不会引入其它额外的突变；并且该方法价格低廉，省时，快速，操作简单。
文档编号C12Q1/68GK1519326SQ0310467
公开日2004年8月11日 申请日期2003年2月21日 优先权日2003年1月30日
发明者黄大卫, 辛文 申请人:中国科学院动物研究所