专利名称：一种适合聚合酶链反应的真菌单孢子或多孢子的破壁方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术，具体地说，涉及一种对真菌孢子的破壁方法，适合于动植物检疫、农业生产、植物保护、真菌研究等部门使用。
对真菌孢子的破壁，目前国内外采取两类方法，即化学方法和物理方法。化学方法要使用一些溶菌酶或其它化学试剂，其缺点在于1、需要大量真菌孢子或培养的真菌；2、需要除去多余的溶菌酶和其它化学试剂，因此容易造成DNA的丢失；3、操作复杂，所需时间较长；4、价格较为昂贵。物理方法包括液氮研磨法、超声波破壁法及玻片挤压法，缺点在于前两种需要大量的真菌孢子，而后者所需的真菌孢子量虽较少，但是破壁后DNA容易黏附在玻片上、移液枪的唇头中，难于完全转移到反应液中，造成DNA的丢失，因此难于或无法进行聚合酶链反应(简称PCR)。另外，动植物检疫部门、农业生产部门、植物保护、真菌研究部门等单位往往在进出境或田间的样品中获取的孢子量极少，含量极低，有时甚至仅有1个、几个或几十个孢子，因此，现有的方法不能满足动植物检疫检测部门、农业生产部门、植物保护部门及真菌科研部门对真菌破壁以进行PCR反应以及其它分子检测手段的需要。
本发明的目的意在克服上述现有技术的不足，提出一种简单、快速、方便、避免造成DNA丢失和降解、适合进行聚合酶链反应(PCR)的真菌单孢子或多孢子破壁方法。
实现上述目的的技术方案一种适合聚合酶链反应的真菌单孢子或多孢子的破壁方法，包括如下步骤1)从病组织或菌瘿或洗涤液或从培养物配成的孢子悬浮液中取得单个或多个真菌孢子，并直接放置在聚合酶链反应的反应管中；2)用破壁针对放置在聚合酶链反应的反应管中的单个或多个真菌孢子破壁，使孢子的内含物DNA释放出来；3)将聚合酶链反应的反应液直接加于聚合酶链反应的反应管中，充分震荡离心，使孢子的内含物DNA混入反应液中。
从病组织或菌瘿中直接挑起孢子的方法包括如下步骤1)取发病的组织或菌瘿，用针刺破发病部位或菌瘿；2)用针挑取病原菌---真菌孢子，将这些孢子展布于培养皿或玻片上；3)在显微镜或解剖镜下，用针将单个或多个孢子挑起，直接放置于专门用于聚合酶链反应的反应管中。
从洗涤液中吸取孢子的方法包括如下步骤1)取待检测样品，加入水，充分震荡，使真菌孢子从样品中进入到水洗液中；2)将水洗液过筛或过纱布，取过筛或过纱布后的水洗液进行离心，弃上清液，取沉淀；
3)加少量水将沉淀稀释；4)取稀释的沉淀液滴在玻片上；5)在显微镜或解剖镜下，用毛细管吸取稀释液中带有的单孢子或多孢子；6)将毛细管吸取的孢子注入到专门用于聚合酶链反应的反应管中，在室温下自然凉干。
从培养物配成的孢子悬浮液中获取孢子的方法包括如下步骤1)用针挑起带有真菌孢子的培养物，置于灭过菌的无菌水中配成孢子悬浮液；2)将孢子悬浮液滴在灭过菌的玻片上，自然凉干；3)在显微镜或解剖镜下，用针将单个或多个孢子挑起，直接放置于专门用于聚合酶链反应的反应管中。
一种适合聚合酶链反应的真菌单孢子或多孢子的破壁方法，包括如下步骤1)从病组织或菌瘿或洗涤液或从培养物配成的孢子悬浮液中取得单个或多个真菌孢子，并直接放置在聚合酶链反应的反应管的管盖中；2)用破壁针对放置在聚合酶链反应的反应管的管盖中的单个或多个真菌孢子破壁，使孢子的内含物DNA释放出来；3)将聚合酶链反应的反应液直接加于聚合酶链反应的反应管的管盖中，盖上聚合酶链反应管的管盖，充分震荡离心，使孢子的内含物DNA混入聚合酶链反应的反应液中。
放置单个或多个孢子的聚合酶链反应的反应管用聚合酶链反应的反应管的管盖代替。
用破壁针对单个或多个真菌孢子破壁的方法是1)将带有孢子的聚合酶链反应的反应管置于载玻片上；2)在显微镜或解剖镜下，用破壁针的针头直接挤压聚合酶链反应的反应管中的孢子，促使孢子壁破裂，或者直接刺破孢子，使孢子的内含物DNA释放出来。
适合聚合酶链反应的真菌单孢子或多孢子的破壁方法的破壁针，由手柄和针头组成，针头固定在手柄上。
破壁针的针头经90度的弯曲杆固定在手柄上。
破壁针的针头是具有光滑平面的针头。
采用上述技术方案，本发明突出的技术进步在于1、实现对单个或多个真菌孢子进行破壁，且真菌孢子破壁后的DNA可以直接全部用于PCR反应，不会造成DNA的丢失和降解通过直接将真菌孢子放置于聚合酶链反应的反应管内(简称PCR管)，用带有光滑平面的特制针挤压或刺破孢子，克服了现有化学方法和物理方法先在其它地方将孢子破裂，再将破裂的孢子转移到PCR反应管中或者有的方法要经过一系列程序先从破裂的孢子中抽提DNA，再把这些DNA配成合适的浓度，再进行PCR反应的缺点，采用本发明不会造成DNA的丢失和降解。2、由于本发明不需要对真菌进行分离培养，缩短了真菌的检测时间，使过去对需要分离培养的真菌用7-20天才能进行PCR检测，现在直接利用孢子进行PCR检测只需要3-5个小时，检测速度至少提高30倍。3、由于采用带有光滑平面的特制针挤压或刺破孢子，可以对单个或多个孢子进行破壁，不会造成DNA的损失。因而，克服了现有技术需要大量真菌孢子才能对真菌进行PCR检测的缺点。采用本发明，能对实际检疫过程中所发现的少量真菌孢子尤其是一个真菌孢子进行分子生物学鉴定或检测，其意义特别重大。4、由于本发明具有操作简便、快速、重复性好、DNA不丢失、不降解等优点，可广泛应用于动植物检疫、农业生产、植物保护和真菌研究等部门，进行各种类型的PCR检测、DNA序列测定、DNA片段分析(AFLP、RAPD等)、分子系统发育分析、基因扫描(Gene-Scan)等方面的研究，对未来真菌的检测可望带来一场技术革命。
下面通过实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明
图1是一种真菌孢子破壁针结构示意图。
实施例一种适合聚合酶链反应的真菌单孢子或多孢子的破壁方法，包括如下步骤1)从病组织或菌瘿或洗涤液或从培养物配成的孢子悬浮液中取得真菌单个孢子A、从病组织或菌瘿中直接挑起孢子取发病的组织或菌瘿，用针刺破发病部位或菌瘿，再用针挑取其中的少许真菌孢子，将这些孢子轻轻展布于培养皿或载玻片上，接着在低倍显微镜下或体视显微镜下观测孢子是否分散开，然后用针将单个或多个孢子挑起，直接放置于专门用于聚合酶链反应的反应管(PCR管)的管盖中。
B、从洗涤液中吸取孢子取检测样品，加入水，充分震荡，过筛或过纱布，取过筛或过纱布后的洗涤液进行离心，弃上清液，取沉淀，之后对沉淀加少量水进行稀释，再取稀释的沉淀液滴在载玻片或凹玻片上，在低倍显微镜或解剖镜下进行检查，对发现其中带有的单孢子或多孢子，用毛细管吸取，注入到专门用于聚合酶链反应的反应管(PCR管)的管盖中，在室内自然凉干。
C、从培养物配成的孢子悬浮液中获取孢子用针挑起培养物，置于灭过菌的无菌水中配成孢子悬浮液，将悬浮液滴在灭过菌的盖玻片上，自然凉干，接着在低倍显微镜下或体视显微镜下观测孢子是否散开，然后用针将单个或多个孢子挑起，直接放置于专门用于聚合酶链反应的反应管(PCR管)的管盖中部。
2)用破壁针对真菌单个或多个孢子进行破壁如图1所示，适合聚合酶链反应的真菌单孢子或多孢子的破壁方法的破壁针由手柄1和针头1组成，针头2微膨大，表面平滑，针头2经90度的弯曲杆固定在手柄1上。
破壁时，将带有孢子的PCR管置于载玻片上，在低倍显微镜下用光滑平面的破壁针头2直接轻轻挤压PCR管盖中的孢子，促使孢子壁破裂，或者直接刺破孢子，使孢子的内含物DNA释放出来，此时，在管盖中会留下水渍状的痕迹。
3)破壁孢子DNA进入PCR反应混和液中，进行PCR反应
将由Taq聚合酶、缓冲液、镁离子、引物和四种碱基配成的常规PCR反应液直接加于PCR管盖内，盖上PCR管，充分震荡并离心，使孢子的内含物DNA完全进入到PCR管中并混合于反应液中，然后即可用常规方法进行PCR反应。
在本实施例中，也可以不将单个或多个真菌孢子直接放置在聚合酶链反应的反应管的管盖中进行破壁，而是将单个或多个真菌孢子直接放置在聚合酶链反应的反应管中进行破壁，破壁后，再加入聚合酶链反应液并使孢子的内含物DNA混入反应液中；也可以不用具有光滑平面的针头的破壁针压破或刺破孢子，而是用具有尖锐针头的破壁针刺破孢子。另外，显微镜也可以用解剖镜代替。
权利要求
1.一种适合聚合酶链反应的真菌单孢子或多孢子的破壁方法，其特征在于包括如下步骤1)从病组织或菌瘿或洗涤液或从培养物配成的孢子悬浮液中取得单个或多个真菌孢子，并直接放置在聚合酶链反应的反应管中；2)用破壁针对放置在聚合酶链反应的反应管中的单个或多个真菌孢子破壁，使孢子的内含物DNA释放出来；3)将聚合酶链反应的反应液直接加于聚合酶链反应的反应管中，充分震荡离心，使孢子的内含物DNA混入反应液中。
2.根据权利要求1所述的一种适合聚合酶链反应的真菌单孢子或多孢子的破壁方法，其特征在于从病组织或菌瘿中直接挑起孢子的方法包括如下步骤1)取发病的组织或菌瘿，用针刺破发病部位或菌瘿；2)用针挑取真菌孢子，将这些孢子展布于培养皿或玻片上；3)在显微镜或解剖镜下，用针将单个或多个孢子挑起，直接放置于专门用于聚合酶链反应的反应管中。
3.根据权利要求1所述的一种适合聚合酶链反应的真菌单孢子或多孢子的破壁方法，其特征在于从洗涤液中吸取孢子的方法包括如下步骤1)取待检测样品，加入无菌水，充分震荡，使真菌孢子从样品中进入到水洗液中；2)将水洗液过筛网或过纱布，取过筛或过纱布后的水洗液进行离心，弃上清液，取沉淀；3)加少量水将沉淀稀释；4)取稀释的沉淀液滴在玻片上；5)在显微镜或解剖镜下，用毛细管吸取稀释液中带有的单孢子或多孢子；6)将毛细管吸取的孢子注入到专门用于聚合酶链反应的反应管中，在室温下自然凉干。
4.根据权利要求1所述的一种适合聚合酶链反应的真菌单孢子或多孢子的破壁方法，其特征在于从培养物配成的孢子悬浮液中获取孢子的方法包括如下步骤1)用针挑起带有真菌孢子的培养物，置于灭过菌的无菌水中配成孢子悬浮液；2)将孢子悬浮液滴在灭过菌的玻片上，自然凉干；3)在显微镜或解剖镜下，用针将单个或多个孢子挑起，直接放置于专门用于聚合酶链反应的反应管中。
5.根据权利要求1所述的一种适合聚合酶链反应的真菌单孢子或多孢子的破壁方法，其特征在于1)从病组织或菌瘿或洗涤液或从培养物配成的孢子悬浮液中取得单个或多个真菌孢子，并直接放置在聚合酶链反应的反应管的管盖中；2)用破壁针对放置在聚合酶链反应的反应管的管盖中的单个或多个真菌孢子破壁，使孢子的内含物DNA释放出来；3)将聚合酶链反应的反应液直接加于聚合酶链反应的反应管的管盖中，盖上聚合酶链反应管的管盖，充分震荡离心，使孢子的内含物DNA混入聚合酶链反应的反应液中。
6.根据权利要求2、3或4所述的一种适合聚合酶链反应的真菌单孢子或多孢子的破壁方法，其特征在于放置单个或多个孢子的聚合酶链反应的反应管用聚合酶链反应的反应管的管盖代替。
7.根据权利要求1或5所述的一种适合聚合酶链反应的真菌单孢子或多孢子的破壁方法，其特征在于用破壁针对单个或多个真菌孢子破壁的方法是1)将带有孢子的聚合酶链反应的反应管置于玻片上；2)在显微镜或解剖镜下，用破壁针的针头直接挤压聚合酶链反应的反应管中的孢子，促使孢子壁破裂，或者直接刺破孢子，使孢子的内含物DNA释放出来。
8.适合聚合酶链反应的真菌单孢子或多孢子的破壁方法的破壁针，其特征在于破壁针由手柄和针头组成，针头固定在手柄上。
9.根据权利要求8所述的一种专用于适合聚合酶链反应的真菌单孢子或多孢子的破壁方法的破壁针，其特征在于针头经90度的弯曲杆固定在手柄上。
10.根据权利要求8和9所述的一种专用于适合聚合酶链反应的真菌单孢子或多孢子的破壁方法的破壁针，其特征在于针头是具有光滑平面的针头。
全文摘要
一种适合聚合酶链反应(PCR)的真菌单孢子或多孢子的破壁方法,包括真菌单个或多个孢子的取得与放置、用破壁针对孢子破壁使DNA释放、将DNA注入到聚合酶链反应管的反应液中混合等方法,通过该方法可获取单个或多个真菌孢子的DNA分子,DNA不丢失,不降解,完全能够满足直接PCR反应的需要以及进行以PCR为基础的各种分子生物学反应的的需要。采用本发明,不需要对真菌进行分离培养,真菌的检测速度提高几十倍,只少量真菌孢子甚至一个孢子就能进行分子生物学鉴定或检测,其意义十分重大。
文档编号C12Q1/37GK1334345SQ01125009
公开日2002年2月6日 申请日期2001年8月1日 优先权日2001年8月1日
发明者章桂明, 程颖慧 申请人:中华人民共和国深圳出入境检验检疫局