鉴别新的酶相互作用化合物的方法

专利名称：：鉴别新的酶相互作用化合物的方法鉴别新的酶相互作用化合物的方法
技术领域：
：本发明涉及使用与固体支持物结合的酶配体表征酶或酶-化合物复合物的方法。药物发现的目标是，开发有效且安全的药物。为了达到该目标，药物研究的目的是，优选地鉴别指向已知是目标疾病的成因的药物靶物的小分子药物。通常，大多数小分子药物指向受体蛋白(细胞膜受体例如G蛋白偶联的受体(GPCR)或核激素受体)，离子通道和酶。在酶中，特别感兴趣的是例如蛋白酶，磷酸二酯酶和激酶(综述Drews，2000，"Drugdiscovery:ahistoricalperspective"，Science287，1960-1964)。蛋白酶被视作易掌控的药物靶物，如HIV蛋白酶抑制剂对AIDS的有效治疗或血管紧张素转化酶抑制剂治疗高血压的应用所证实的。关于癌症的治疗，正在开发指向基质金属蛋白酶和胱天蛋白酶的蛋白酶抑制剂(Docherty等，2003，"Proteasesasdrugtargets"，BiochemicalSocietySymposia70，147-161)。磷酸二酯酶(PDE)包含催化cAMP或cGMP的水解的酶家族，并涉入许多疾病。PDE5抑制剂昔多芬(Viagra)提供对勃起功能障碍的有效治疗。目前，用作抗炎治疗剂的PDE4抑制剂(例如cilomast和roflumast)正在临床试验中。该领域的一项巨大挑战是，PDE同种型特异性抑制剂的开发，以便避免引起副作用的交叉反应性(Card等，2004，"Structuralbasisfortheactivityofdrugsthatinhibitphosphodiesterases"，Structure12，2233-2247)。激酶会催化蛋白、脂质、糖、核苷和其它细胞代谢产物的磷酸化，并在真核细胞生理学的所有方面起关键作用。蛋白磷酸化是常见的蛋白翻译后修饰，会以许多方式影响蛋白结构和功能。已经成为近期药物开发焦点的一种激酶类别包含蛋白激酶，因为它们被证实通过信号转导途径的失调，在肿瘤的起始和进展中起重要作用(肺癌中的EGF受体；乳腺癌中ErbB2/Her-2受体的过表达；白血病中的BCR-ABL融合蛋白；综述Blume-Jensen和Hunter,2001，"Oncogenickinasesignaling"，Nature411,355-365)。在人基因组中编码的蛋白激酶的互补物包含518个家族成员(kinome)，它们根据序列相似性可以分成几个亚家族(综述Manning等，2002，TheProteinKinaseComplementoftheHumanGenome,Science298，1912-1934)。在任意给定的细胞或组织中，仅仅表达kinome子集。激酶会将来自ATP的磷酸基转移给底物分子，从而影响它们的靶物的稳定性、活性和功能。不同激酶的ATP结合袋在结构上是相似的，因此认为难以开发选择性的ATP-竟争性抑制剂。激酶家族是一个非常大的酶家族(与作为药物靶物有关的其它酶类别例如磷酸二酯酶相比)，其会提供药物开发的许多机会，但是也会提供独有的挑战(较大的家族大小；ATP结合袋的结构相似性；高细胞内ATP浓度)(综述Cohen,P.，2002，Proteinkinases-themajordrugtargetsofthetwenty-firstcenturyNatureReviewsDrugDiscovery,volume1,309-315)。感兴趣的另一种激酶类别是脂质激酶。脂质激酶会催化Y-磷酸基从三磷酸核苷向脂质底物的转移。已知脂质激酶例如磷酸肌醇3-激酶(PI3K)家族成员是对生长因子、激素和神经递质的细胞应答的调控剂，并参与癌症、糖尿病和其它疾病(Fruman等，1998.Phosphoinositides.AnnualReviewBiochemistry67，481-507;Cantley，L.C.,2002，Science296,1655-1657)。鉴别与蛋白(例如酶)相互作用的化合物的一个前提是，提供含有尽可能多的一种类别的高纯度蛋白的蛋白制品。更具体地，提供一种类别(例如激酶)的许多蛋白是重要的，因为这会实现针对该蛋白家族的许多成员筛选潜在地药学上令人感兴趣的化合物(所谓的击中鉴别)。这样的蛋白制品的其它可行的用途包括，测试化学上优化的化合物(先导优化)，测定给定化合物的选择性(选择性表征)以及证实给定化合物的作用模式。在本领域，已经提出了评价该问题的几种策略。从细胞提取物富集ATP-结合蛋白例如激酶和其它核苷酸-结合蛋白的一个方案，依赖于作为亲和试剂的固定化的ATP，即依赖于结合潜在地所有ATP-结合酶的配体的应用。在该情况下，通过借助于连接物将Y-磷酸基偶联到树脂上，共价地固定化ATP(Graves等，2002，MolecularPharmacology62，No.61364-1372;US5536822)。该方案进一步扩展成，偶联组合化合物文库的单一化合物(WO00/63694)。固定化的ATP的一个缺点是，对激酶的亲和力相当低，导致激酶的无效捕获，或由于高解离速率而迅速洗脱。另一个缺点是，不会优先捕获激酶，还捕获可在细胞中以高得多的水平表达的其它类别的ATP-结合蛋白。更丰富的ATP-结合蛋白可以由于竟争而造成无效捕获，或可以在对结合的蛋白的质镨分析过程中导致问题(如果分析深度不足的话)。本领域描述的另一个方案是，使用对单一酶特异性的配体，即高亲和力和高选择性的激酶抑制剂或亲近衍生物(例如优化的药物)。它们用于从细胞裂解物富集激酶，相同的未修饰的化合物用于特异性洗脱，以便鉴别细胞药物靶物(Godl等，Proc.Natl.Acad.Sci.100，15434-15439;W02004/013633)。仅仅在药物的化学修饰未破坏结构-亲和力-关系(SAR)时，该方案是成功的，但是如果SAR受损，则失败。另外，难以鉴别介导不希望的副作用的靶物，因为同源药物靶物和副作用-把物的SAR可能是不同的，后者的SAR通常是未知的。另一个策略是给定类别的酶例如激酶的体外表达。Fabian等人(Fabian等，2005，NatureBiotechnology23(3)，329-336;WO03084981)描述了一种激酶表征方法，它不依赖于捕获在细胞裂解物中包含的内源激酶，而是使用在噬菌体T7上展示的激酶。在该测定中使用的激酶(或激酶域)是经标记以便进行表达、纯化和检测的融合蛋白。在竟争结合测定中，将这些噬菌体标记的激酶结合到固定化的激酶抑制剂上，用未固定化的实验化合物处理，并使用谨菌体DNA作为模板，通过实时PCR定量结合的标记的激酶。该方法的一个缺点是，需要克隆激酶，仅仅一部分噬菌体-标记的激酶折叠成正确的天然状态。此外，这样的蛋白制品根本不会反映细胞中的天然情形。另一个方案使用活性部位定向探针(所谓的基于活性的探针)，其会与靶酶形成共价连接。该方法用于使用高选择性的探针表征丝氨酸水解酶的表达(Liu等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.96，14694-14699，W001/77668)，并使用由罗丹明-和生物素-标记的荧光磺酸酯的非基于定向活性的探针文库组成的更广镨的探针，进一步扩展到其它酶家族(Adam等，2002,NatureBiotechnology20，805-809，WO01/77684，WO03/047509)。但是，仍然不清楚这些磺酸酯乾向酶共有的结构和/或催化性质。该方案的另一个限制是，难以区分与酶的特异性相互作用和由探针的固有反应性造成的非特异性相互作用。最后，尝试了通过酪氨酸特异性的抗体富集在酪氨酸上磷酸化的蛋白(Blogoev等，2004，NatureBiotechnology9，1139-1145)。Blogoev等人描述了可以用于研究表皮生长因子(EGF)等化合物对磷酸酪氨酸-依赖型信号转导途径的影响的方法。裂解EGF-刺激的细胞后，通过用针对磷酸酪氨酸的抗体的免疫沉淀，富集含有磷酸酪氨酸的蛋白。在第二步中，分析这些富集的蛋白，并通过质谱分析进行鉴别。该方案的一个主要限制是，仅能捕获在酪氨酸上磷酸化的蛋白。鉴于此，需要改进的表征在细胞中表达的给定类别的酶的方法。此外，需要改进的鉴别作为给定化合物的结合伴侣的酶的方法。本发明满足了这些需要。在本发明的上下文中，已经令人惊奇地发现，至少一种固定化在固体支持物上的广谱酶配体的应用，会实现酶从蛋白制品、优选细胞裂解物的有效分离。分离后，可以应用有效的方法来表征结合到广镨酶配体上的酶，或鉴别化合物酶相互作用。优选地通过质镨法鉴别酶。因此，本发明提供了用于表征酶或鉴别给定化合物的结合伴侣的有效方法。在第一个方面，本发明提供了表征至少一种酶的方法，其包括下述步骤a)提供含有该酶的蛋白制品，优选地通过收获至少一个含有该酶的细胞，和裂解该细胞，b)在允许酶结合广谱酶配体的条件下，在基本上生理条件下使蛋白制品接触至少一种固定化在固体支持物上的所述广镨酶配体，c)洗脱酶，和d)通过质镨法表征洗脱的酶。在第二个方面，本发明提供了表征至少一种酶的方法，其包括下述步骤a)提供2份等分试样，其各自包含至少一个含有该酶的细胞，b)将一份等分试样与给定化合物温育，c)收获细胞，d)裂解细胞，e)在允许酶结合广镨酶配体的条件下，在基本上生理条件下使蛋白制品接触至少一种固定化在固体支持物上的所述广谱酶配体，f)洗脱酶，和g)通过质谱法表征洗脱的酶。根据本发明的第三个方面，本发明提供了表征至少一种酶的方法，其包括下述步骤a)提供含有该酶的蛋白制品的2份等分试样，优选地通过收获至少一个含有该酶的细胞，和裂解该细胞，b)在允许酶结合广谱酶配体的条件下，在基本上生理条件下使一份等分试样接触至少一种固定化在固体支持物上的所述广谱酶配体，c)在允许酶结合广i普酶配体的条件下，在基本上生理条件下使另一份等分试样接触至少一种固定化在固体支持物上的所述广谱酶配体和接触给定化合物，d)洗脱酶，和e)通过质谱法表征洗脱的酶。根据本发明的第四个方面，提供了表征酶-化合物复合物的方法，其包括下述步骤a)提供含有该酶的蛋白制品，优选地通过收获至少一个含有该酶的细胞，和裂解该细胞，b)在允许酶结合广i普酶配体的条件下，在基本上生理条件下使蛋白制品接触至少一种固定化在固体支持物上的所述广镨酶配体，c)使结合的酶接触化合物，以释放至少一种结合的酶，和d)通过质镨法表征释放的酶，或e)从配体洗脱酶，和通过质i普法表征酶，从而鉴别该化合物的一种或多种结合伴侣。上述方案，尤其是根据第四个方面的本发明的方法，具有下述优点一不需要酶的体外表达，而是使用来自细胞裂解物的内源酶。-令人惊讶地发现，广特异性激酶配体会非常有效地捕获激酶。-不需要连接或固定实验化合物(无标记的测定方法)。-使用任意的目标化合物(未修饰的，未固定化的)，可以进行竟争结合或洗脱。-不需要酶底物(如在生化酶测定中需要)。-可以表征化合物对信号转导途径的体内作用(见第二方面)。一可以鉴别直接和间接的靶物。在本发明中，术语"酶"也包括细胞中能结合配体的每一种蛋白或肽，所述配体例如转运蛋白，离子通道和与酶相互作用的蛋白例如含有肽相互作用域(例如SH2，SH3，和PDZ域)的接头蛋白。但是，优选地，术语"酶"以它的常用方式解释为细胞中的生物催化剂。在本发明中，术语"广谱酶配体，，指，能结合有些(但不是全部)存在于蛋白制品中的酶的配体。本发明优选地涉及表征酶或鉴别给定化合物的结合伴侣的方法，其中所述酶或结合伴侣包含在细胞裂解物中。但是，本发明的方法也可以用任意蛋白制品作为原料来实现，只要蛋白溶于制品中。实例包括几种蛋白的液体混合物，含有原始细胞中存在的并非全部蛋白的部分细胞裂解物，或几种细胞裂解物的组合。通过首先分离细胞器(例如细胞核，线粒体，核糖体，高尔基体等)，然后制备源自这些细胞器的蛋白制品，可以得到部分细胞裂解物。分离细胞器的方法是本领域已知的(Chapter4.2PurificationofOrganellesfromMammalianCells,见"CurrentProtocolsinProteinScience"，编者John.E.Coligan，BenM.Dunn,HiddeL.Ploegh，DavidW.Speicher，PaulT.Wingfield;Wiley,ISBN:0-471-14098-8)。另外，通过分部分离细胞提取物，从而富集特定类型的蛋白，例如胞质或膜蛋白，可以制备蛋白样品(Chapter4.3SubcellularFractionationofTissueCultureCells见"CurrentProtocolsinProteinScience"，Editors:John.E.Coligan,BenM.Dunn,HiddeL.Ploegh，DavidW.Speicher,PaulT.Wingfield;Wiley,ISBN:0-471-14098-8)。此外，可以使用来自体液(例如血液，脑脊液，腹水和尿)的蛋白制品o在本发明中，术语"固体支持物"指能将所述广谱酶配体固定化到它的表面上的每种不溶支持物。根据第二个方面的本发明的方法包括下述起始步骤提供各自包含至少一个含有该酶的细胞的2份等分试样，和将一份等分试样与给定化合物温育。在一个优选的实施方案中，所述至少一个细胞是细胞培养系统的一部分，其分成至少2份等分试样。然后将一份等分试样的细胞与给定化合物温育。将细胞培养系统与化合物温育的方法是本领域已知的(Giuliano等，2004，"High-contentscreeningwithsiRNAoptimizesacellbiologicalapproachtodrugdiscovery:definingtheroleofp53activationinthecellularresponsetoanticancerdrugs"JournalofBiomolecularScreening9(7)，557-568)。但是，本发明也包括，每份等分试样的至少一个细胞是体内系统(例如小鼠系统或低级脊推动物系统)的一部分。例如，可以使用源自模型生物体(例如美丽线虫)的限定发育阶段的全胚胎裂解物或成年阶段。另外，完整器官(例如从小鼠切离的心脏)可以是蛋白制品的来源。这些器官也可以体外灌注，并用实验化合物或目标药物处理。在优选的实施方案中，本发明的所有方法至少包括下述步骤收获至少一个含有该酶的细胞，和裂解该细胞。在一个优选的实施方案中，细胞是细胞培养系统的一部分，从细胞培养系统收获细胞的方法是本领域已知的(文献同上)。细胞的选择主要取决于要分析的酶的类别，因为必须确保该类酶主要存在于选择的细胞中。为了确定给定的细胞是否是本发明方法的合适起始系统，蛋白印迹、基于PCR的核酸检测方法、RNA印迹和DNA-微阵列方法("DNA芯片")等方法可能是合适的，以便确定给定类别的酶是否存在于细胞中。细胞的选择也受研究目的的影响。如果需要鉴别给定药物的体内靶物，则需要选择其中发生希望的治疗效果的细胞或组织(例如，对于抗癌药物，是乳腺癌组织)。相比之下，为了阐明介导不希望的副作用的蛋白靶物，需要分析其中观察到副作用的细胞或组织(例如，对于CNS副作用，是脑组织)。此外，在本发明中预见到，含有酶的细胞可以从生物体得到，例如通过活组织检查。对应的方法是本领域已知的。例如，活组织检查是用于得到小量组织的诊断方法，该小量组织然后可以显微镜检查或用生化方法检查。活组织检查对于疾病的诊断、分类和分期是重要的，对于评价和监测药物治疗也是重要的。乳腺癌活组织检查以前作为手术操作进行，但是现在优选针吸活组织检查(0yama等，20(M，BreastCancer11(4)，339-342)。所述的本发明的方法允许表征组织样品中酶类别的存在。例如，可以鉴别造成疾病的突变酶(例如激活致癌激酶的点突变)。另外，可以解释在治疗过程中产生的、且导致治疗抗性的突变酶(例如造成对抗癌药物的抗性的EGF-受体突变)。肝活组织检查用于例如诊断慢性肝病的原因，所述慢性肝病导致肝大或由升高的肝酶活性造成的异常肝检验结果(Rocken等，2001，Liver21(6)，391-396)。本发明包括，通过收获至少一个细胞，同时进行裂解。但是，同样优选地，首先收获细胞，然后单独裂解。裂解细胞的方法是本领域已知的(Karwa和Mitra:Samplepreparationfortheextraction,isolation,andpurificationofNucleiAcids;chapter8见"SamplePreparationTechniquesinAnalyticalChemistry"，Wiley2003，编者SomenathMitra,printISBN:0471328456;onlineISBN:0471457817"。用匀浆器(例如Potter-匀浆器)，超声磨碎机，酶裂解，去污剂(例如NP-40，TritonX-IOO，CHAPS,SDS)，渗透压休克，重复冻融，或这些方法的组合，可以实现不同细胞类型和组织的裂解。此外，本发明的所有方法包括下述步骤，在允许酶结合广谱酶配体的条件下，在基本上生理条件下使细胞制品或细胞裂解物接触至少一种固定化在固体支持物上的所述广谱酶配体。在基本上生理条件下的接触具有下述优点，即配体、细胞制品(即要表征的酶)和任选地化合物之间的相互作用会尽可能多地反映天然条件。"基本上生理条件"尤其是，在原始的、未加工的样品材料中存在的那些条件。它们包括生理蛋白浓度、pH、盐浓度、緩冲容量和涉及的蛋白的翻译后修饰。术语"基本上生理条件"不要求与样品来源的原始活生物体中的条件相同的条件，但是基本上细胞-样条件或接近细胞条件的条件。本领域技术人员当然会认识到，由于最终会导致不那么细胞-样条件的实验设置，可能产生某些约束。例如，当从活生物体采取和加工样品时，最后必需的细胞壁或细胞膜的破碎，可能需要与在生物体中发现的生理条件不完全相同的条件。用于实现本发明方法的生理条件的适当变化，是本领域技术人员显而易见的，且包含在本文使用的术语"基本上生理条件，，中。总之，应当理解，术语"基本上生理条件"涉及，接近生理条件的条件，例如在天然细胞中发现的条件，但是不一定要求这些条件完全相同。优选地，"基本上生理条件，，可以包含50-200mMNaCl或KC1，pH6.5-8.5，20-45"C，和0.001-10mM二价阳离子(例如Mg++，Ca++，);更优选约150mNaCl或KC1，pH7.2-7.6，5mM二价阳离子，经常包括0.Ol-l.0%非特异性蛋白(例如BSA)。可经常存在非离子型去污剂(Tween，NP-40，Triton-XlOO)，通常是约0.001-2%,典型地0.05-0.2%(体积/体积)。作为一般指南，下面的緩沖含水条件可能是适用的10-250mMNaCl，5-50mMTrisHC1，pH5-8，任选地加入二价阳离子和/或金属螯合剂和/或非离子型去污剂。优选地，"基本上生理条件"指pH6.5-7.5，优选7.0-7.5，和/或緩冲浓度10_50mM，优选25-50mM，和/或单价盐(例如Na或K)浓度120-170mM，优选150mM。二价盐(例如Mg或Ca)还可以以1-5mM、优选l-2mM的浓度存在，其中更优选地，緩沖液选自:Tris-HCl或HEPES。在本发明的上下文中，术语"在允许酶结合广谱酶配体的条件下"包括可能发生这样的结合的所有条件。这包括在固定化相上具有固体支持物和将裂解物倒于它上面的可能。在另一个优选的实施方案中，也包括固体支持物是颗粒形式，并与细胞裂解物相混合。在一个优选的实施方案中，配体和酶之间的结合是非共价的、可逆的结合，例如通过盐桥、氢鍵、疏水相互作用或其组合。另外，本发明的方法包括从固定化在固体支持物上的配体洗脱酶的步骤。这样的方法在原理上是本领域已知的，取决于配体酶相互作用的性质。原则上，离子强度的变化、pH值、温度或与去污剂的温育，是从固定化的配体解离靶酶的合适方法。洗脱緩沖液的应用，可以通过极端的pH值(高或低pH;例如使用0.1M柠檬酸盐pH2-3降低pH)、离子强度的变化(例如使用Nal，KI，MgCl2，或KCl的高盐浓度)、破坏疏水相互作用的极性降低剂(例如二噁烷或乙二醇)、或变性剂(离液盐或去污剂例如十二烷基石克酸钠，SDS;综述SubramanianA.，2002，Immunoaffinitychromatography.Mol.Biotechnol.20(1)，41-47)，解离结合伴侣。使用这些相当非特异性方法，可以释放大多数或所有结合的蛋白，然后需要通过质镨法分析(或者，通过用抗体检测，见下文)。根据本发明第四个方面的方法还包括下述步骤使结合的酶接触化合物，以释放至少一种结合的酶。该接触优选地也在基本上生理条件下进行。使用目标化合物进行洗脱(而不是上述非特异性试剂)的一个优点是，不会释放出所有结合的蛋白，而只释放出亚级分，优选目标酶类别。结果，需要通过质i普法鉴别更少的蛋白，导致对目标酶类别更快的分析和更深的分析深度(灵敏度)。熟练的技术人员会明白，在本发明方法的各个步骤之间，洗涤步骤可能是必需的。这样的洗涤是本领域技术人员知识的一部分。洗涤用于从固体支持物去除细胞裂解物中未结合的组分。通过加入低水平的去污剂或通过适度调节洗涤緩冲液的盐浓度，可以使非特异性的(例如单纯离子的)结合相互作用最小化。洗脱或接触后，在有些情况下，优选地将固体支持物与释放的物质分离。用于该目的的各个方法取决于固体支持物的性质，且是本领域已知的。如果支持物材料包含在柱内，释放的物质可以收集为柱流出物。在支持物材料与裂解物组分相混合的情况下(所谓的批式操作)，额外的分离步骤(例如轻轻离心)可能是必需的，释放的物质可以收集为上清液。或者，磁珠可以用作固体支持物，使得珠子可以使用磁力装置从样品中消除。根据本发明，优选地通过质谱法表征根据本发明第四个方面的方法洗脱的酶或共同洗脱的结合伴侣(见下文)以及释放的酶。或者，在本发明中，也可以用针对各酶或共同洗脱的结合伴侣的特异性抗体进行该表征。用质谱分析(质谱法)鉴别蛋白，是本领域已知的(Shevchenko等，1996，AnalyticalChemistry68:850-858，(Mann等，2001，Analysisofproteinsandproteomesbymassspectrometry,AnnualReviewofBiochemistry70，437-473)，并在实施例部分进一步解释。作为质谱分析的替代方案，可以使用针对目标蛋白的特异性抗体检测洗脱的酶(包括共同洗脱的结合伴侣，例如酶亚基或支架蛋白)。此外，在另一个优选的实施方案中，一旦已经通过质谱分析确认洗脱的酶的身份，可以用针对该酶的特异性抗体检测每种目标酶。合适的基于抗体的测定包括、但不限于蛋白印迹，ELISA测定，夹心ELISA测定和抗体阵列或其组合。这样的测定的建立，是本领域已知的(Chapter11，Immunology,pagesll-lto11-30in:ShortProtocolsinMolecularBiology.FourthEdition,EditedbyF.M.A應bel等，Wiley,NewYork,1999)。平行地使用几种抗体，可以进行多个测定，例如针对酶家族的多个成员(Pelch等，KinetworksProteinKinaseMultiblotanalysis-Chapter8，pages99-112in:CancerCellSignalling.MethodsandProtocols.Editor:DavidM.Terrian.HuraanaPress,Totowa，USA,2002)。这些测定不仅可以以检测和定量目标酶的方式构建，而且可以以分析翻译后修饰模式(例如砩酸化)的方式构建。例如，通过用特异性的抗-磷酸酪氨酸、抗-磷酸丝氨酸或抗-磷酸苏氨酸抗体探测它的磷酸化状态，可以测定激酶的激活状态。本领域已知如何选择和使用这样的抗-磷酸抗体(Zhang等，2002.JournalofBiologicalChemistry277，43648-43658)。根据第二个方面的本发明方法的一个优选实施方案，通过表征酶，可以确定化合物的施用是否会导致酶的差异表达或激活状态。因此，通过施用化合物，可以改变酶的表达，或可以改变酶的激活状态。在上下文中，酶表达的变化可优选地指，在细胞中产生更多或更少的酶。激活状态的变化优选地指，施用化合物后酶的活性更高，或施用化合物后酶的活性更低。也可以指，酶对固定化的配体的亲和力升高或降低(例如通过上游激酶对其的磷酸化，激酶激活状态的变化；或化合物向酶变构调节侧的结合，从而改变ATP-结合酶的ATP-结合袋的构象)。根据第一个方面的本发明方法的一个优选实施方案，优选地在基本上生理条件下，将蛋白制品与下面定义的化合物温育。结果，仅仅不结合化合物的酶随后结合到配体上，洗脱，并表征。根据本发明第三个方面的方法的一个优选实施方案，在步骤c)中，优选地在基本上生理条件下，使等分试样接触化合物，然后与配体温育。结果，仅仅不结合化合物的酶随后结合到配体上，洗脱，并表征。在根据第三个方面的本发明方法的一个优选实施方案中，检测到与化合物温育的等分试样中酶的减少，表明该酶是该化合物的直接靶物。这源自下述事实，即在本发明方法的步骤c)中，化合物会与配体竟争向酶的结合。如果在与化合物温育的等分试样中检测到更少的酶，这优选地意味着，化合物与抑制剂竟争与酶的相互作用，因此是酶的直接靶物，反之亦然。根据第四个方面的本发明方法的一个优选实施方案，该方法作为中或高处理量筛选来实现。这样的测定是本领域技术人员已知的(Mallari等，2003，Agenerichigh-throughputscreeingassayforkinases:proteinkinaseAasanexample,JournalofBiomolecularScreeing8,198-204;Rodems等，2002，AFRET-basedassayplatformforultra-highdensityscreeningofproteinkinasesandphosphatases,AssayandDrugDevelopmentTechnologies1(IPTI)，9-19)。对根据本发明第二、三和四个方面的方法必要的是，提供认为会与酶相互作用的化合物。原则上，根据本发明，这样的化合物可以是能与酶相互作用的每种分子。优选地，化合物对酶有作用，例如刺激或抑制作用。优选地，所述化合物选自合成的或天然存在的化合物或有机合成药物，更优选小分子，有机药物或天然小分子化合物。优选地，所述化合物从含有这样化合物的文库开始鉴别。然后，在本发明的过程中，篩选这样的文库。这样的小分子优选地不是蛋白或核酸。优选地，小分子的分子量小于5000Da，更优选小于2000Da，更优选小于1000Da，最优选小于500Da。根据本发明的"文库"指以分类方式提供的(许多)不同化学实体的集合(主要是大集合)，其能实现对不同单个实体的快速功能分析(筛选)，并同时提供构成文库的单个实体的快速鉴别。实例是试管或表面上的孔或点的集合，它们含有化合物，后者可以加入与一种或多种确定的潜在相互作用伴侣的高处理量方式的反应中。鉴别出两种伴侣的希望的"阳性"相互作用后，由于文库构建，可以快速鉴别各个化合物。合成和天然起源的文库可以购买，或由熟练技术人员设计。文库构建的实例提供在，例如，BreinbauerR，MangerM，ScheckM，WaldmannH.Naturalproductguidedcompoundlibrarydevelopment.CurrMedChem.2002Dec;9(23):2129—45，其中描述了天然产物，它们是生物学上验证过的设计组合文库的起点，因为它们具有经证实的生物相关性记录。参考关于通过结构生物学和生物信息学得到的蛋白的域结构的新知识，可以解释天然产物在药物化学和化学生物学中的这种特殊作用。为了满足域家族内各个结合袋的特殊要求，可能必须通过化学变化来优化天然产物结构。据称固相化学是该优化过程的有效工具，在该综述文章中，强调了该领域的最新进展。其它相关文献包括EdwardsPJ，MorrellAI.Solid-phasecompoundlibrarysynthesisindrugdesignanddevelopment.CurrOpinDrugDiscovDevel.2002Jul;5(4):594—605.;MerlotC，DomineD，ChurchDJ.Fragmentanalysisinsmallmoleculediscovery.CurrOpinDrugDiscovDevel.2002May;5(3):391-9.Review;Good謂RAJr.Currentpracticesingenerationofsmallmoleculenewleads.JCellBiochemSuppl.2001;Suppl37:13-21;它描述说，许多制药公司的当前药物开发过程需要巨大的且日益增多的高质量先导结构集合，用于高处理量筛选测定中。在过去，已经通过几种方式获得具有不同结构和"药物-样"性质的小分子集合通过以前的内部先导物优化工作的记录，通过从化合物供应商购买，和通过公司合并后单个集合的联合。尽管高处理量/组合化学被描述成属于新先导物产生方法中的重要组分，用于合成和随后设计文库成员的文库设计的选择，已经演化到新水平的挑战和重要性。针对多种生物学耙物筛选多个小分子化合物文库设计的潜在益处，会提供大量发现新的先导结构可以在常规酶测定中，测试可以从固定化的配体洗脱靶酶的实验化合物(本发明的第四方面)。在下面，描述了示例性的测定，其可以用于进一步表征这些化合物。这些测定的描述无意限制本发明的范围。蛋白酶测定可以如下进行示例性的蛋白酶测定在适当条件下，使蛋白酶接触用荧光(例如EDANS)和猝灭剂生色团(例如DABCYL)双标记的肽底物，和检测切割后荧光的增加。底物含有接近肽的一端的荧光供体和接近另一端的受体基团。这类底物的荧光最初通过供体和受体之间的分子内荧光共振能转移(FRET)淬灭。当蛋白酶切割底物时，产物从淬灭释放出来，供体的荧光变得明显。荧光信号的增加与水解的底物的量成正比(Taliani，M.etal，1996，Methods240:60-7)。磷酸二酯酶测定可以在合适的緩沖液中制备人白细胞(U937)的细胞裂解物，并用作PDE酶的来源。用[3H]cAMP作为底物，在温育緩沖液(50mMTris-HCl，ph7，5，5mMMgC12)中在25t:温育20分钟后，定量[3H]腺苷(Cortijo的机会。等，1993，BritishJournalofPharmacology108，562-568)。蛋白激酶的体外酶活性测定简而言之，可以用酪氨酸激酶(例如Lck)、ATP和抗-磷酸酪氨酸抗体温育荧光素-标记的肽底物。随着反应的进行，砩酸化的肽会结合抗-磷酸酪氨酸抗体，导致极化信号的增加。抑制激酶的化合物会产生低的极化信号。或者，可以以改进的间接方式构建测定。发荧光的磷酸肽用作与抗-磷酸-酪氨酸抗体形成复合物的示踪剂，产生较高的极化信号。当未标记的底物被激酶磷酸化时，产物与发荧光的磷酸化的肽竟争抗体。发荧光的肽然后从抗体释放进溶液，导致极化信号的丧失。直接和间接测定都可以用于鉴别蛋白酪氨酸激酶活性的抑制剂(Seethala，2000，Methods22，6卜70;Seethala和Menzel，1997，Anal.Biochem.253,210-218;Seethala和Menzel,1998，Anal.Biochem.255，257-262)。通过用抗-磷酸丝氨酸或抗-磷酸苏氨酸抗体替代抗磷酸酪氨酸抗体，可以将该荧光极化测定修改得适合用于蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶(Turek等，2001，Anal.Biochem.299，45-53，PMID11726183;Wu等，2000，J.Biomol.Screen.5，23-30，PMID10841597)。可以进一步优化在根据本发明第四个方面的方法中鉴别出的化合物(先导物优化)。因为在这些先导物产生文库中编码的结构_活性关系(SAR)信息，这样的化合物的随后优化经常被加速。由于用于随后合成的高处理量化学(HTC)方法的适用性，经常会促进先导物优化。优选地，先导物优化得到根据本发明第二个、第三个和第四个方面的方法的支持，更优选地得到根据第四个方面的方法的支持。这些方法的结果，可以为药物化学家或本领域其它技术人员提供关于如何在例如选择性方面进一步优化化合物的指导。这样的文库的一种用途最终描述在，例如，WakelingAE，BarkerAJ，DaviesDH，BrownDS，GreenLR，CartlidgeSA，WoodburnJR.Specificinhibitionofepidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinaseby4-ani1inoquinazolines.BreastCancerResTreat.1996;38(1):67-73。根据本发明可以表征的酶，优选地选自激酶，磷酸酶，蛋白酶，磷酸二酯酶，氢化酶，脱氢酶，连接酶，异构酶，转移酶，乙酰化酶，脱乙酰基酶，GTP酶，聚合酶，核酸酶和解旋酶。优选地，蛋白是激酶，更优选蛋白激酶。同样优选地，蛋白是脂质激酶。如上面已经指出的，本发明的要点是，配体是能结合给定酶类别中的多种不同(但不是所有的)酶的广镨配体。优选地，配体会结合给定酶类别中的IO-50%、更优选30-50%的酶。优选地，配体是酶的抑制剂。在一个更优选的实施方案中，酶是激酶，配体是激酶抑制剂。优选地，该激酶抑制剂选自双巧l咪基马来酰亚胺VIII，PurvalanolB，CZC0画7324(可连接的PD173955)，CZC画08004。其它配体包括吲哚配体91，喹唑啉配体32和修饰的星形孢菌素(见实施例5-7)。在图3中给出了吲哚配体91(5-[5-氟-2-氧-l，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基曱基]-2，4-二甲基-lH-吡咯-3-甲酸(3-氨基-丙基)-酰胺)的结构。该化合物是在结构上类似于激酶抑制剂Sutent(SU112W;Sun等，2003.J.Med.Chem.46，1116-1119)的分子。吲哚配体91可以通过伯氨基共价偶联到合适的固体支持物材料上，且可以用于分离结合蛋白。在实施例l中，描述了吲哚配体91的合成。根据本发明，表述"丐l咮配体91"也包括下述化合物，其包含相同的核，但是具有另一种连接物，优选地偶联到不属于环状结构一部分的NH基团上，用于连接固体支持物。通常，连接物具有8，9或10个原子的主链。连接物含有羧基-或氨基-活性基团。根据另一个优选的实施方案，通过表征酶的共同洗脱的结合伴侣、酶亚基或酶的翻译后修饰，进行酶的表征。该优选实施方案的基础是，由于在配体和酶之间结合的过程中使用基本上生理条件，优选地可以保持酶的天然条件，这包括结合伴侣、酶亚基或翻译后修饰的存在。在质语(MS)帮助下，不仅可以鉴别酶，而且可以鉴别共同洗脱的结合伴侣、酶亚基或所述翻译后修饰。根据本发明的另一个优选的实施方案，通过鉴别酶或酶结合伴倡的proteotypic肽，进行质镨(MS)表征。proteotypic肽的概念在实施例部分详细描述。其想法是，用蛋白酶消化洗脱的酶或结合伴倡，通过MS测定产生的肽。结果，来自相同来源蛋白的肽的肽频率有很大程度的差异，最经常观察到的"通常"促成该蛋白的鉴别的肽称作"proteotypic肽"。因此，在本发明中使用的proteotypic肽是在实验中非常容易观察到的肽，其会独特地鉴别特定蛋白或蛋白同种型。根据一个优选的实施方案，通过对比对酶或结合伴侣得到的proteotypic肽和已知的proteotypic肽，进行表征。因为当4吏用蛋白酶消化制备的片段在MS中鉴别蛋白时，通常对于特定酶观察到相同的proteotypic肽，可以对比对特定才羊品得到的proteotypic肽和特定酶类别中的酶的已知proteotypic肽，并从而鉴别样品中存在的酶。优选地，以定量方式进行质i普分析，例如通过使用iTRAQ技术(用于相对和绝对定量的同量异序标记)或cICAT(可切割的同位素-编码的亲和标记)(Wu等，2006.J.ProteomeRes.5，651-658)。根据另一个优选的实施方案，固体支持物选自琼脂糖，改性琼脂糖(modifiedagarose)，琼脂糖(sepharose)珠子(例如NHS-活化的琼脂糖)，胶乳，纤维素，和亚铁-或铁磁性颗粒。广谱酶配体可以共价或非共价地偶联到固体支持物上。非共价结合包括通过生物素亲和配体结合，后者结合到链霉抗生物素基质上。优选地，广镨配体共价偶联到固体支持物上。偶联之前，基质可以含有活性基团，例如NHS,碳化二亚胺等，以实现与化合物的偶联反应。通过直接偶联(例如使用官能团例如氨基-，巯基-，羧基-，羟基-，醛-，和酮基)和通过间接偶联(例如通过生物素，共价结合在化合物上的生物素，和生物素与直接结合在固体支持物上的链霉抗生物素的非共价结合)，可以将化合物偶联到固体支持物上。与固体支持物材料的连接，可以包含可切割的和不可切割的连接物。切割可以通过酶切割或适当化学方法处理来实现。目标化合物结合固体支持物材料的优选结合界面是含有c-原子主链的连接物。通常，连接物具有8，9或10个原子的主链。根据要偶联的化合物，连接物含有羧基-或氨基-活性基团。使用广镨配体的组合，可以更完全地覆盖酶类别。优选地，使用1-10、更优选l-6、更优选l-4种不同配体。最优选地，使用3或4种不同配体。在使用超过一种配体的情况下，每种配体优选地在不同支持物上。但是，同样优选地，当使用超过一种配体时，在一个固体支持物上存在至少2种或所有不同的配体。在使用超过一种配体的情况下，优选地每种单独配体可以结合的谱范围是不同的，从而可以达到酶类别的最大覆盖。优选地，每种配体会结合给定酶类别中的10-50%、更优选30-50%的酶。根据另一个优选的实施方案，通过表征酶或化合物酶复合物，可以确定细胞中酶类别的全部或几个成员的身份。这是由于下述事实，即通过将配体与细胞裂解物温育，可以分离潜在地所有能结合配体的酶，并随后表征。根据酶的表达i普，配体能结合酶类别的全部或几个成员，从而可以鉴别它们。在激酶的情况下，本发明的方法有助于熟练的技术人员鉴别和表征在给定细胞中表达的kinome。在本发明中，优选地化合物不同于配体，尽管不排除同一性。本发明还涉及生产药物组合物的方法，其包括下述步骤a)根据本发明第四个方面的方法鉴别酶化合物复合物，和b)将化合物配制成药物组合物。因此，本发明提供了制备药物组合物的方法，其可以以有效量施用给受试者。在一个优选方面，治疗剂是基本上纯化的。待治疗的受试者优选地是动物，包括但不限于牛、猪、马、鸡、猫、狗等动物，优选哺乳动物，最优选人。在一个具体的实施方案中，非-人哺乳动物是受试者。总体而言，本发明的药物组合物包含治疗有效量的治疗剂和药学上可接受的载体。在一个具体的实施方案中，术语"药学上可接受的"指被联邦或政府机关的管理部门所批准，或列在美国药典或其它公认的药典中，用于动物，更特别是用于人。术语"载体"指与治疗剂一起施用的稀释剂，辅剂，赋形剂，或介质。这样的药物载体可以是无菌的液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，包括但不限于花生油，大豆油，矿物油，芝麻油等。当经口施用药物组合物时，水是优选的载体。当静脉内地施用药物组合物时，盐水和含水右旋糖是优选的载体。盐水溶液和含水右旋糖和甘油溶液优选地用作可注射溶液的液体栽体。合适的药物赋形剂包括淀粉，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明胶，麦芽，稻米，面粉，白垩，硅胶，硬脂酸钠，单硬脂酸甘油酯，滑石，氯化钠，脱脂奶粉，甘油，丙烯，乙二醇，水，乙醇等。如果需要，组合物还可以含有小量的润湿剂或乳化剂，或pH緩冲剂。这些组合物可以采取溶液、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶嚢、粉末、持续释放制剂等的形式。利用传统的粘合剂和载体，例如甘油三酯，可以将组合物配制成栓剂。经口制剂可以包括标准的载体例如药物级甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。合适的药物载体的实例记载在E.W.Martin的"Remington'sPharmaceuticalSciences",这样的组合物含有治疗有效量的治疗剂，优选纯化的形式，以及合适量的载体，以便提供适于施用给患者的形式。制剂应当适合施用模式。在一个优选的实施方案中，根据常规方法，将组合物配制成适于静脉内地施用给人类的药物组合物。典型地，静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性緩冲液中的溶液。当需要时，组合物也可以包括增溶剂和局部麻醉剂，例如利多卡因，以緩解注射部位的疼痛。通常，单独分开地或在单位剂型中混合在一起地供应成分，例如，作为在密封容器中的冻干粉末或无水浓缩物，所述容器例如指示活性剂的量的安瓿或药囊(sachette)。当要通过输注施用组合物时，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配它。当通过注射施用组合物时，可以提供一安瓿的无菌注射用水或盐水，以便可以在施用前混合各成分。本发明的治疗剂可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与游离羧基形成的那些，例如源自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的羧基；与游离胺基团形成的那些，例如源自异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等的胺基团，和源自钠、钾、铵、钙和铁氢氧化物等的那些。将有效地治疗特定障碍或状况的本发明的治疗剂的量，取决于障碍或状况的性质，且可以通过标准的临床技术来确定。另外，可以任选地采用体外测定，以辅助鉴别最佳剂量范围。在制剂中使用的准确剂量，也依赖于施用途径，疾病或障碍的严重性，且应当根据操作人员的判断和每位患者的情况来决定。但是，静脉内施用的合适的剂量范围通常是约20-500微克活性化合物/千克体重。鼻内施用的合适的剂量范围通常是约0.01Pg/kg体重至lmg/kg体重。从源自体外或动物模型实验系统的剂量-效应曲线，可以外推有效剂量。一般而言，栓剂可以含有0.5%-10%(重量)的活性成分；经口制剂优选地含有10°/。-95°/。活性成分。已知多种输送系统，且可以用于施用本发明的治疗剂，例如包封在脂质体，微粒，和微胶嚢中；使用能表达治疗剂的重组细胞，使用受体-介导的胞吞作用(例如，Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262:4429-4432);构建作为逆转录病毒或其它栽体的一部分的治疗核酸等。导入方法包括但不限于皮内的，肌肉内的，腹膜内的，静脉内的，皮下的，鼻内的，硬膜外的和经口的途径。通过任何方便的途径，例如通过输注，通过快速推注，通过经上皮或粘膜皮肤内衬(例如，口腔的，直肠的和肠的粘膜等)的吸收，可以施用化合物，且可以与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。另外，可能需要通过任何合适的途径，包括脑室内的和鞘内的注射，将本发明的药物组合物导入中枢神经系统；通过脑室内的导管，例如其连接到储器，例如0mmaya储器，可以促进脑室内注射。也可以釆用肺施用，例如，通过使用吸入器或或喷雾器，并与雾化剂一起配制。在一个具体的实施方案中，可能需要将本发明的药物组合物局部地施用到需要治疗的区域。这可以通过下述方式实现例如但不限于，在手术过程中局部输注，局部应用，例如手术后与创伤敷料相联合，通过注射，借助导管，借助栓剂，或借助植入物，所述植入物是多孔的，无孔的，或凝胶状的材料，包括膜，例如sialastic膜，或纤维。在一个实施方案中，施用可以是通过在恶性肿瘤或肿瘤组织或肿瘤发生前组织的部位(或先前部位)直接注射。在另一个实施方案中，可以在囊泡、尤其脂质体中输送治疗剂(Langer，1990，Science249:1527-1533;Treat等，1989，见LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer,Lopez-Berestein和Fidler编，Liss，NewYork,第353-365页；Lopez-Berestein，同上，第317-327页；总见上文)在另一个实施方案中，通过控释系统，可以输送治疗剂。在一个实施方案中，可以4吏用泵(Langer,同上；Sefton，1987，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201-240;Buchwald等，1980，Surgery88:507-516;Saudek等，1989,N.Engl.J.Med.321:574-579)。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料(MedicalApplicationsofControlledRelease,Langer和Wise编，CRCPress,BocaRaton,Florida,1974;ControlledDrugBioavailability,DrugProductDesignandPerformance,Smolen和Ball编,Wiley,NewYork,1984;Ranger和Peppas，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61;Levy等，1985，Science228:190-192;During等，1989，Ann.Neurol.25:351-356;Howard等，1989，J.Neurosurg.71:858-863)。在另一个实施方案中，控释系统可以置于治疗靶物(即脑)附近，从而仅仅需要全身剂量的一小部分(例如，Goodson，1984，见MedicalApplicationsofControlledRelease,同上，Vol.2，第115-138页)。在Langer(1990，Science249:1527-1533)的综述中，讨论了其它控释系统。在一个优选的实施方案中，该方法还包括调节化合物对酶的结合亲和力的步骤。这可以通过本领域技术人员已知的方法来实现，例如通过化合物多种不同残基的化学修饰，和随后分析化合物与酶的结合亲和力。本发明还涉及至少一种固定化在固体支持物上的广镨酶配体在至少一种酶或酶-化合物复合物的表征中的应用。关于本发明的该应用，上面为本发明的方法描述的所有实施方案也适用。下面附图和实施例进一步解释了本发明，它们不应当视作限制本申请权利要求赋予的保护范围。附图简述图1:kinobead配体的结构。在实施例1中描述了配体的来源和合成途径。图la:Kinobead配体1(双吲咮基马来酰亚胺VIII)图lb:Kinobead配体2(PurvalanolB)图lc:Kinobead配体3(CZC00007324,(7-(4-氨基甲基-苯基氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-I-曱基-IH-[1，6]萘啶-2-酮))图Id:Kinobead配体4(CZC00008004，2-(4'-氨基甲基苯基胺)-5-氟-嘧啶-4-基)-苯基-胺)图2:Signalokinome(见实施例2)。该图显示了使用kinobead的药物pulldowns(左圏)和使用抗-磷酸酪氨酸抗体珠子的常规免疫沉淀(右團)的对比。在Kinobeads实验中，鉴别了共626种蛋白，其中有100种激酶。在免疫沉淀(IP)实验中，鉴别了共503种蛋白，其中有12种激酶。在重叠区域，列出了用这两种实验鉴别出的激酶(共同激酶)。结果表明，与抗-磷酸酪氨酸抗体珠子(12种激酶)相比，使用kinobeads鉴别出明显更多的激酶(100种激酶)。图3:kinobead配体5，6和7的结构。在实施例5，6和7中描述了配体的合成途径。图3a:kinobead配体5(丐l咮配体91)的结构。图3b:kinobead配体6(喹唑啉配体32)的结构。图3c:kinobead配体7(修饰的星形孢菌素)的结构。图4:定量蛋白亲和力图镨(PAP)。该图显示了裂解物中与实验化合物BisVIII的竟争和用蛋白印迹分析对蛋白的检测。使用含有10mg蛋白的Jurkat细胞裂解物样品，如实施例8所述进行pulldown实验。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离输入裂解物(泳道L;50Mg蛋白)和来自kinobead的SDS-洗脱物(泳道l-7)，转移到膜上，并用抗体探测。图4A:首先用针对GSK3P的抗体探测蛋白印迹。用过氧化物酶标记的检测二抗进行化学发光检测。作为装载对照，用抗-ITK抗体探测印迹。泳道L:50iugJurkat裂解物；泳道1:6.0juMBisVIII;泳道2:2.0juMBisVIII;泳道3:0.67jiMBisVIII;泳道4:0.22pMBisVIII;泳道5:0.074inMBisVIII;泳道6:0.025pMBisVIII;泳道7:0.5%DMS0(溶剂对照)。图4B:BisVIII对GSK3P结合kinobead的浓度依赖性竟争。定量图2A所示的蛋白印迹上的GSK3P条带，并相对于加入裂解物中的BisVIII的浓度绘图。图5:激酶的定量蛋白亲和力图谱对4种激酶显示了实施例8的定量亲和力图谱实验结果。相对于化合物浓度(BisVin)绘制相对强度(RI)值图。RI50值代表着相对于DMSO对照给定激酶的MS信号的相对强度是50%时的化合物浓度。图5A:糖原合酶激酶3oc的曲线(GSKa;RI50-72.7nM)图5B:糖原合酶激酶3P的曲线(GSKb;RI50-95nM)图5C:蛋白激酶Ca的曲线(PKCa;RI50-12.2nM)图5D:蛋白激酶Cp的曲线(PKCb;RI50=21.5nM)实施例实施例1:kinobead的制备本实施例解释了制备含4种不同配体的kinobead。这些kinobead随后用于实施例2和实施例3中。使用合适的官能团(例如氨基或羧基等基团)，通过共价连接将广镨捕获配体共价地固定化到固体支持物上。修饰不含有合适官能团的化合物，以便导入这样的基团。必需的化学方法是药物化学文献中已知的，且在下面阐述。1.配体的选择和合成如下所述，在分开的反应中，将下面4种广特异性配体(Kinobead配体l-4;图1)共价偶联到珠子上，然后混合4种类型的珠子，并用于药物pulldown实验。Kinobead配体1:双吲咮基马来酰亚胺VIII-乙酸(化学式C24H22N402CH3C00H;分子量398.5;CAS号138516-31-1;AlexisBiochemicals，AXX0RADeutschlandGmbH,Griinberg;Cat-ALX-270-056)。Kinobead配体2:PurvalanolB(化学组成:C2。H25C1N603;分子量441.92;CAS号212844-54-7;TocrisBiochemicalsCat-1581，BI0T薩DChemikalienGmbHK6ln，Germany)。Kinobead配体3:CZC00007324;(7-(4-氨基甲基-苯基氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-l-甲基-lH-[1，6]萘啶-2-酮)。kinobead配体1的合成7-(4-氨基甲基-苯基氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-IH-[1，6]萘啶-2-酮如Klutchko，S.R.等，1998，JournalofMedicinalChemistry41，3276-3292所述，进行CZC00007324合成的前7步。如下所迷进行剩余的步骤。步骤l-7:按照/.1998，W,3276-3292的操作，从4-氯-2-甲硫基-5-嘧啶曱酸乙基酯合成6-(2，6-二氯苯基)-2-甲烷磺酰基-8-甲基-8f吡啶并[2，3-d嘧啶-7-酮。步骤8:{4-[3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-2-氧-l，2-二氢-[1，6]萘啶-7-基氨基]节基}-氨基甲酸叔丁基酯混合固体状的6-(2，6-二氯苯基)-2-甲烷磺酰基-8-甲基-吡啶并[2，3-cd嘧啶-7-酮(0.100g，0.2mmol)和3-0V"Boc-曱基氨基)苯胺(0.421g，2.Ommol)，加热至140X:30分钟。将粗反应混合物溶于二氯甲烷中，用2NHC1(aq)洗涤x2。用无水硫酸镁干燥有机层，过滤，并浓缩。从热乙酸乙酯重结晶粗产物，得到{4-[3-(2，6-二氯-苯基)-l-甲基-2-氧-l，2-二氢-[1，6]萘啶-7-基氨基]苄基}-氨基甲酸叔丁基酯黄色固体(O.031g-25%)。卞NMR(DMS0-《)510.18(s，1H);8.83(s，1H);7.76(d，2H);7.58(d，2H);7.46(dd,1H);7.32(brt，1H);7.23(d，2H);4.10(d，2H);3.66(s，3H);1.40(s，9H)。LCMS:方法A，RT-5.60min.步骤9:7-(4-氨基甲基-苯基氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-l-甲基-IH-[I，6]萘啶-2-酮将{4-[3-(2，6-二氯-苯基)-l-甲基-2-氧-l，2-二氢-[1，6]萘啶-7-基氨基]苄基}-氨基甲酸叔丁基酯(0.026g，0.05mmol)溶于甲醇(3ml)中，加入氢氯酸(4N，在二噁烷中，1.2ml)。在室温搅拌反应物1.5小时，此时HPLC显示没有剩余的原料。真空去除溶剂。将残余物溶于水，用碳酸氢钠(饱和的，aq.)碱化溶液。收集得到的沉淀，并干燥，得到7-(4-氨基甲基-苯基氨基)-3-(2，6-二氯-苯基)-1-甲基-lH-[l，6]萘啶-2-酮(0.021g-100W黄色固体。力腿(DMS0-《)510.20(brd，1H);8.83(d，1H);7.90(d，1H);7.76(d，1H);7.72(d，1H);7.60(dd，2H);7.47(ddd，1H);7.33(d，1H);7.24(d，1H);4.07(d，2H);3.66(s，3H)。LCMS:方法A，RT-4.44min，[MH+—26]。Kinobead配体4:CZC00008004.2-(4'-氨基甲基苯基胺)-5-氟-嘧啶-4-基)-苯基-胺。化学式C17H16N5F.分子量309.34。这是CZC00004919的类似物。CZC00008004-(2-(4'-氨基甲基苯基胺)-5-氟-嘧啶-4-基)-苯基-胺的合成步骤l:2，4-二氯-5-氟-嘧啶将磷酰氯(2ml)加入5-氟尿嘧啶(lg，7.688m迈o1)，随后加入五氯化磷(3.28g，15.76mmo1)，加热混合物，在IIOX:搅拌5小时，然后冷却。在水/水混合物(10ml)浴中緩慢水解过量的磷酰氯。用二乙醚(3xlOml)萃取含水混合物。合并有机层，用饱和碳酸氢钠(10ml)、随后用饱和氯化钠(10ml)洗涂，用无水硫酸镁千燥，然后过滤。通过在350mmHg蒸发，去除溶剂，剩下粘稠的油，将其緩慢结晶，得到标题化合物(1.22g-95%)。不经进一步分析，将化合物用于下一步。步骤2:(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)-苯基胺向2，4-二氯-5-氟-嘧啶(0.550g,3.30mmol)于二甲基甲酰胺(13ffll)中的溶液中，加入苯胺(O.301ml，3.30mmol)和A^乙基二异丙基胺(0.602ml，3.63mmo1),在室温搅拌混合物18小时。用乙酸乙酯(20ml)淬灭混合物，用饱和氯化铵(20ml)洗涤，去除有机层。用乙酸乙酯(20ml)洗涤含水层，用水(20ml)、饱和氯化钠(10ml)洗涤合并的有机层，经无水硫酸镁千燥。蒸发去除溶剂，对得到的固体进行柱色镨(二氧化硅，乙酸乙酯(0-20%)/石油醚)，得到标题化合物(0.532g-72%)。LCMS:方法A，RT-4.67min，[MH+=224].步骤3:[4-(5-氟-4-苯基氨基-嘧啶-2_基氨基)-苄基]-氨基曱酸叔丁基酯将(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)-苯基胺(0.087g，0.39mmol)和4[^Boc氨基甲基]苯胺(0.087g，0.39隨ol)混合到一起。加入搅拌棒，将烧瓶置于110°C油浴中20分钟。冷却混合物，将残余物溶于3ml二氯甲烷/甲醇(99:5)，装载到快速色谱柱上，使用在石油醚中的乙酸乙酯(20-60%)纯化，产生黄色固体状的目标化合物(0.051g-32%)。^NMR(400MHz，CDCl3-《)57.85(d，1H);7.50(dd，2H);7.39(d，2H);7.27(t，2H);7.12-7.00(m，3H);6.81(s，1H);6.66(s，1H);4.67(s，1H)，4.17(d，2H)，1.36(s，9H)。LCMS:方法B，RT=9.20min,[MH+-410].步骤4:(2-(4'-氨基甲基苯基胺)-5-氟-嘧啶-4-基)-苯基-胺向[4-(5-氟-4-苯基氨基-嘧啶-2-基氨基)-节基]-氨基甲酸叔丁基酯(0.055g，0.134mmol)于甲醇(5ml)中的溶液加入HCl(4N，在二噁烷中)(2ml)，在室温搅拌反应物1小时。蒸发去除溶剂。加入水(5ml)，通过加入碳酸氢钠，使溶液的pH升高至8。过滤得到的沉淀，并千燥，得到标题化合物(0.035g-84%)。力賺(400MHz，DMSO-cO57.90(d，1H);7.70(dd，2H);7.55(dd，2H);7.35(t,2H);7.20(d，2H);7.10(t，1H);3.80(s，2H)。LCMS:方法B，RT=5.022min，[M『=310].在惰性气氛下进行所有反应。在Brukerdpx400上得到NMR光谱。使用zorbaxSBC-18，4.6mmxl50mm-5jli柱，在Agilent1100上进行LCMS。柱流速是1ml/min，使用的溶剂是水和乙腈(0.1%TFA)，注射体积是10ul。波长是254和210nm。方法如下所述。表1:分析方法<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表2:化学方法方案中使用的缩写aq含水的d双峰DMSO二曱基亚砜g克HC1氢氯酸HPLC高压液相色语LCMS液相色谱-质谱法m多重峰mins分钟mmol毫摩尔N当量(Normal)腿核磁共振q四重峰RT保留时间s单峰sat饱和的t三重峰2.含有胺基的配体的固定化用无水DMSO(二甲基亚砜，Fluka，41648，H20<=0.005%)平衡NHS-活化的Sepharose4FastFlow(AmershamBiosciences,17-0906-01)。将1ml沉降的珠子置于15mlFalcon试管中，加入化合物储备溶液(通常100mM，在DMF或DMSO中)(终浓度0.2-2nmol/ml珠子)以及15jil三乙胺(SIGMA，T-0886,99%纯)。在室温在黑暗中，在反转摇动器(RotoShakeGenie，ScientificIndustriesInc.)上温育珠子16-20小时。通过HPLC，测定偶联效率。通过在反转摇动器上在室温与氨基乙醇温育过夜，封闭不反应的NHS-基团。将洗过的珠子保藏在异丙醇中，或立即用于结合反应。3.含有羧基的配体的固定化如下所述，在碱性条件下，将化合物偶联到反转的(reversed)NHS-琼脂糖珠子(PyBroPchemistry)上。珠子的洗涤步骤l:使用lml(沉降体积)NHS-琼脂糖/珠子进行标准的偶联反应(在异丙醇中提供的NHS-活化的Sepharose4FastFlow,AmershamBiosciences,17-0906-01)。步骤2:用10mlDMSO洗涤珠子3次，用10ml无水DMSO(二甲基亚砜，Fluka，41648,H20<=0.005%)洗涤一次；离心步骤1min:I.200rpm，室温；将上清液弃入非含卣溶剂废液中。步骤3:最后的洗涤步骤后，将珠子重悬于1体积的无水DMSO中。反转NHS珠子该步骤为1mL珠子而设计，相应地为任意其它珠子体积而调节。NHS珠子具有20nmol/mL的容量。因此，20%反转的珠子应当具有4jimol/mL的容量。制备氨基乙醇和乙二胺的4:1比例混合物，然后向混合物中加入三乙胺。(共200jimol)(10x1mLNHS珠子容量)1:9.6616.56M氨基乙醇(2-氨基乙醇，Aldrich，II.016-7)(共160jimol)2:2.6814.92M乙二胺(Fluka，03350)(共40,1)。3:15jiL7.2M三乙胺(TEA)(SIGMA，T-0886,99%纯)混合物将分成两相，但是这没有问题。将混合物加入经洗涤的/重悬的NHS珠子，在室温在反转摇动器上温育16小时(过夜)。PyProB偶联。该操作不需要预活化步骤，激活和偶联在原位发生。1.将PyBroP(溴-三-吡咯烷基-磷钹六氟磷酸盐；供应商NOVABIOCHEM)在无水的二甲基甲酰胺(DMF)中溶解至终浓度100mM(46.62mg/mL)，溶液可以使用最长达l天。2.在1mL无水的DMF中溶解35nL二异丙基乙基胺(DIBA)，终浓度200mM。3.用15mLDMS0洗涤1mL反转的珠子3次。离心步骤1分钟，1，200rpm室温。抛弃上清液。4.用15mL无水的DMF洗涤反转的珠子3次。离心步骤1分钟，1，200rpm室温。抛弃上清液。5.在1mL无水的DMF中悬浮反转的琼脂糖珠子。6.加入IOO二异丙基乙基胺(DIEA)溶液。7.向珠子加入需要量的来自DMF-溶液的化合物(1nmol/mL反转的琼脂糖珠子；相当于10jiL100mM化合物/mL反转的琼脂糖珠子)。8.混合，直到获得均匀悬浮液。9.在1200rpm、在室温离心1分钟，取出20上清液，在30甲醇(MeOH)中稀释，作为HPLC分析的起始值。10.向悬浮液加入100jiLPyBroP溶液，再次混合。11.在室温，在反转混合仪上温育过夜。12.在1200rpm、在室温离心1分钟，取出20上清液，在30jiL甲醇(MeOH)中稀释，作为HPLC分析的偶联值。珠子的封闭1.通过加入100jiL100mMNHS-乙酸(封闭试剂的制备见下文)，封闭珠子。2.在室温，在反转摇动器上温育过夜。封闭试剂(NHS激活的乙酸)1.制备200mMDCCD和NHS于乙腈中的溶液(各自约5mL)。2.在20mL透明玻璃瓶中，混合等体积的200mM冊S和DCCD;3.每lmL总体积冊S/DCCD混合物，加入11.4pL17.49M乙酸(2x摩尔过量)(Merck，1.00063.1000)。4.彻底混合。约2分钟后，形成沉淀(脲衍生物的晶体)。5.使反应物在室温放置至少过夜，然后再使用。珠子的洗涤1.用14mlDMSO(例如FLUKA，34869或等同物)洗涤珠子2次，然后用2x14mL异丙醇(Merck，1.00983.1000，proanalysis)洗涤。离心步骤1分钟，1200rpm，室温。在洗涤之间，去除上清液。2.用1mL异丙醇重悬珠子，制备50°/。料浆，在-20X:保藏，或立即用于与细胞裂解物的结合反应。表3:偶联方案中使用的缩写<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>实施例2:signalokinome本实施例解释了用化合物处理细胞(具体见本发明的第二个方面)。用表皮生长因子(EGF)处理HeLa细胞，制备细胞裂解物，使用Kinobead(实验方法见第2.1部分)和质谱法进行分析。Kinobead的制备如实施例1所述。平行地，用抗-磷酸酪氨酸抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀(实验37方法见第2.2部分)，并通过质镨法进行分析。结果(图"表明，与免疫沉淀方法(表6)相比，kinobead会鉴别出明显更多的激酶(表8)。1.生物样品(细胞裂解物)的制备1.1细胞培养和细胞的处理细胞培养。在37t:、5%C02，在MEM培养基(不含有L-精氨酸，不含有L-谷氨酰胺；PromocellC-75280)、10%经透析的胎牛血清(Gibco,26400-044)、1%100x非必需氨基酸(Cambrex，BE13-114E)、lmM丙酮酸钠(Gibco，11360-039)、2mML-谷氨酰胺(Gibco，25030-032)、40mg/L12C或13CL-精氨酸(12C精氨酸-Sigma,A6969)(13C精氨酸-CambridgeIsotopeLaboratoriesInc.,CLM-2265)中培养HeLa细胞(美国典型培养物中心-NoCCL-2)。细胞繁殖。细胞在15cm培养皿中达到汇合后，将细胞按1-10分盘，进一步生长。如下分开细胞首先去除上清液培养基，然后用15mLPBS緩沖液(Gibco，14190-094)短暂地洗涤细胞。去除PBS后，通过向每个15cm培养皿加入2mL胰蛋白酶-EDTA溶液(Gibco，25300-054)，并在37。C温育平板10分钟，使细胞脱离平板。细胞脱离后，向每个15cm培养皿加入8mLMEM生长培养基(见上面)。将1mL该溶液置于新鲜的15cm平板上，加入24mLMEM培养基(见上面)。在5%C02再次温育平板，直到细胞汇合(约3-4天)。细胞的EGF处理。在用表皮生长因子(EGF)处理细胞前一天，通过抽吸去除细胞生长培养基，加入20niL新鲜的MEM培养基(见上面)，例外是，培养基添加了0.ly。胎牛血清(FBS)来替代l(^FBS。在37匸、5%C02,在该饥饿培养基中温育细胞过夜。细胞饥饿后，将3pL1mg/mL重组人EGF(Biomol，50349-1)加入每个15cm平板(最终EGF浓度=150ng/mL培养基)。在37C、5%C02，温育平板10分钟，然后收获。细胞收获。如下收获细胞倾倒出含有EGF的培养基，用10mL冰冷的PBS緩冲液洗涤每个15cm平板一次，用橡胶刮棒刮擦平板，以便使细胞脱离。将细胞转移进50mLFalcon试管(BectonDickinson,352070)，在1500rpm、在HeraeusMultifuge3SR中离心10分钟。抽吸上清液，将细胞沉淀重悬于50mL冰冷的PBS緩冲液中。离心和抽吸上清液后，在液氮中快速冷冻细胞沉淀，然后在-80t:保藏。1.2细胞裂解物的制备通过在维持蛋白的结构和功能的轻柔条件下，在裂解緩沖溶液中机械破碎，制备HeLa细胞裂解物。进行如下的步骤*在室温或37X:迅速融化组织，然后将组织转移至含有lx裂解緩冲液的玻璃瓶(使用大小足以配用PolytronPT3100匀浆器的瓶子)*在冷室中，在4匸，在5000-7000rpm、以4xl0秒脉沖裂解器官/组织鲁将匀浆转入预冷的50mlfalcon试管*在水上温育匀浆30min*在6000g、在4。C旋转细胞10min(6.000rpm，在SorvallSLA600中，预冷)将上清液转移至UZ-聚碳酸酯试管(Beckmann，355654)在145，000g、在4。C旋转上清液1h(40.000rpm，在Ti50.2中，预冷)*保藏上清液(取出和抛弃大部分脂质层(如果可能))，将上清液转移进玻璃瓶，在冰上保藏。，通过Bradford测定(BioRad)，测定蛋白浓度。典型的蛋白浓度是在5-10mg/ml的范围内。*在15-50mlFalcon试管内，制备等分试样。參在液氮中冷冻等分试样，在-80。C保藏。制备含0.8%NP40的100mllx裂解緩沖液合并下述溶液或试剂，加入蒸馏水至终体积100ml:20ml5x裂解緩沖液(见下文)，100pi1MDTT，5ml0.5MNaF，4ml20%NP40，4片不含EDTA的完全片剂(蛋白酶抑制剂混合物，RocheDiagnostics,1873580)，加入蒸馏7JC至100ml。表4:5x-裂解緩沖液的制备<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>从下述供应商得到这些溶液1MTris/HClpH7.5:Sigma,T-2663;87%甘油Merck,目录号04091.2500;IMMgCl"Sigma,M—1028;5MNaCl:Sigma,S—5150经O.22jam过滤器，过滤5x浓缩的裂解緩冲液，以40ml等分试样在-8G。C保藏。在该实验中使用的储备溶液的制备100mMNa3V04储备溶液的制备将9.2gNa3V0,溶于400ml蒸馏水。1)使用1NNaOH或1NHC1,调节pH至10.0。原钒酸钠溶液的起始pH可能随批次而变化。在pH10.0，溶液是黄色。2)煮沸溶液，直到它变成无色(约10min)。3)冷却至室温。4)再次调节pH至lO.0，重复步骤2和3，直到溶液保持无色，且pH稳定在10.0。5)用蒸馏水调节体积至500ml。6)在-20C冷冻等分试样。等分试样可以保藏几个月。500mMNaF储备溶液的制备将21.0gNaF(SIGMA,S7920)溶于500ml蒸馏水。经0.22pm过滤器过滤溶液，在4x:保藏。20%NP40-溶液的制备称量40.0gNP40(SIGMA，Igepal-CA630，目录号13021)。加入蒸馏水直至200g。彻底混合，在室温储存溶液。1MDTT溶液的制备将7.7gDTT(Biomol，目录号04010)溶于50ml蒸馏水。经0.22pm过滤器过滤溶液，在-20t:冷冻400ji1等分试样。等分试样可以保藏几个月。2.结合反应2.1"kinobead"(固定化的捕获配体)与细胞裂解物的接触在允许裂解物中的蛋白结合配体的条件下，使kinobead(固定化的捕获配体)接触从HeLa细胞制备的细胞裂解物。通过选择能维持蛋白功能的合适緩沖条件，结合条件接近于生理条件。通过轻柔洗涤操作，去除未捕获的蛋白后，使结合的蛋白接触导致蛋白洗脱的实验化合物。2.1.1DP-緩冲液的制备表5:5x-DP緩沖液的制备物质储备溶液在lx裂解緩沖液中的终浓度用于115x裂解緩冲液的加入量<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>经O.22pm过滤器过滤5x-DP緩沖液，在-80。C保藏40ml-等分试样。从下述供应商得到这些溶液1.0MTris/HClpH7.5(SIGMA,T-2663),87%甘油(Merck，目录号04091.2500);1.0MMgCl2(SIGMA，M-1028);5.0MNaCl(SIGMA,S-5150)。制备下述的lxDP緩冲液lxDP緩冲液(用于珠子平衡)lxDP緩沖液/O.4%NP40(用于珠子平衡和珠子的第一个洗涤步lxDP緩冲液/O.2%NP40(用于珠子的第二个洗涤步骤和化合物洗脱)lxDP緩沖液/蛋白酶抑制剂(用于第一个裂解物稀释步骤)；加入1片蛋白酶抑制剂片剂/25ml裂解緩冲液(无EDTA的片剂，蛋白酶抑制剂混合物，RocheDiagnostics,1873580)lxDP緩冲液/0.4WNP40/蛋白酶抑制剂(用于第二个裂解物稀释步骤)制备lxDP-緩冲液/0.4。/。NP40(100ml)的实例合并下述溶液和试剂，加入蒸馏水直至100ml的终体积20ml5xDP緩冲液，5ml0.5MNaF，2ml20%NP40，100|U11MDTT，加入蒸馏水直至100ml。所有緩沖液舍有1mMDTT终浓度。2.1.2珠子的洗涤和平衡通过用合适的緩沖液洗涤和在緩沖液中平衡，制备用于结合反应的kinobead(实施例1)。进行下述步骤1.使用15mlFalcon试管，进行所有洗涤步骤。2.每个实验使用100p1Kinobead(沉降的珠子体积)混合相同量的(25pl)与下述4种配体偶联的每个珠子类型(偶联密度是1jumol/ml):BisVIII(CZC00001056)，PurvalanolB(CZC00007097)，PD173955衍生物(CZC00007324)，和CZC00008004。3.用3mllxDP緩冲液洗涤珠子2次，用3mllxDP緩沖液/0.4。/。NP40洗涤一次。在每个洗涤步骤过程中，反转试管3-5次，在1200rpm、在41C、在Heraeus离心机中离心2分钟。抽吸上清液，并抛弃。最后洗涤步骤后，用lxDP緩冲液/0.4%NP40制备1:1料浆(体积/体积)。2.1.3稀释的细胞裂解物的制备通过在合适緩冲液中稀释，并经离心步骤澄清，制备如第(1.2)部分所述的用于结合反应的细胞裂解物。进行下述步骤1.使用相当于每个实验50mg蛋白的体积的细胞裂解物。2.在371C水浴中迅速融化裂解物，然后在水上保持样品。3.以下述方式稀释裂解物1)用lxDP緩沖液/蛋白酶抑制剂稀释裂解物，使去污剂浓度从O.8%降低至0.4%NP-40。2)用lxDP缓冲液/0.4%NP40/蛋白酶抑制剂进一步稀释裂解物，达到5mg/ml的终蛋白浓度。4.将稀释的裂解物转入UZ-聚碳酸酯试管(Beckmann，"5654)。5.通过超速离心(20min，4T，100.000g，TI50.2转子，预冷的超速离心机)，澄清稀释的裂解物。6.保藏上清液，在水上保藏。2.1.4结合反应和洗涤使来自第(2.1.2)部分的经洗涤和平衡的珠子接触来自步骤(2.1.3)的稀释的细胞裂解物，以便使蛋白结合配体。通过轻柔洗涤，去除非特异性结合的蛋白，以便减少背景结合。1.在15ml或50mlFalcon试管中，合并稀释的澄清的裂解物和IOOp1经洗涤的Kinobead。2.在4t:温育2小时，在冷室中在ROTOSHAKEGENIE(ScientificIndustries,Inc.)上旋转。3.温育后，在4"C、在U00rpm、在Heraeus离心机或等效仪器中离心3分钟。4.小心地去除上清液，不使珠子松开。5.将珠子转移至带90jum过滤器的Mobicol-柱(MoBiTec，Goettingen，目录号M1002-90)。6.用10mllxDP緩冲液/O.4%NP-40和5mllxDP緩冲液/O.2%NP-4Q洗涤珠子。7.使洗涤緩冲液完全流过柱，然后进行下一步。8，将柱置于埃彭道夫试管中，在800rpm、在4r将它们离心1分钟。用下盖封闭柱。2.1.5蛋白的洗脱1.加入60|j12xNuPAGESDS样品緩冲液(Invitrogen，NP0007;在使用前，用蒸馏水l:l稀释4x緩冲液)。2.在50X:温育样品30分钟。3.打开柱的下盖，在2000rpm离心MobiTec柱1分钟，分离洗脱液和珠子。4.加入1/10体积的200mg/ml碟乙酰胺，在室温温育30分钟，避光。该反应导致半胱氨酸的烷基化，用于质谱分析。5.将样品上样到凝胶之前，在15.000rpm离心样品5分钟，以便去除沉淀。6.为了蛋白分离，将60jiil样品应用于NuPAGE4-12y。Bis-Tris凝胶(Invitrogen，NP0335)。2.1.6在该实验中使用的储备溶液的制备100mMNa3V04储备溶液的制备1)将9.2gNa3V04溶于400ml蒸馏水。2)使用1NNaOH或1NHC1，调节pH至10.0。原钒酸钠溶液的起始pH可能随批次而变化。在pH10.0，溶液是黄色。3)煮沸溶液，直到它变成无色(约IOmin)。4)冷却至室温。5)再次调节pH至10.0，重复步骤2和3，直到溶液保持无色，且pH稳定在10.0。6)用蒸馏水调节体积至500ml。7)在-2or;冷冻等分试样。等分试样可以保藏几个月。500mMNaF储备溶液的制备将21.0gNaF(SIGMA，S7920)溶于500ml蒸馏水。经0.22pm过滤器过滤溶液，在4t;保藏。20%NP40-溶液的制备称量40.0gNP40(SIGMA,Igepal-CA630,目录号13021)。加入蒸馏水直至200g。彻底混合，在室温储存溶液。1MDTT溶液的制备将7.7gDTT(Biomol，目录号04010)溶于50ml蒸馏水。经0.22)im过滤器过滤溶液，在-20r冷冻400jil等分试样。等分试样可以保藏几个月。碘乙酰胺储备溶液(200mg/ml)的制备将2.0g碘乙酰胺(SIGMA,1-6125)溶于10ml蒸馏水。经0.22jam过滤器过滤溶液，在-2GC冷冻400pi等分试样。等分试样可以保藏几个月。2.2使用抗-磷酸酪氨酸抗体珠子的免疫沉淀2.2.1緩冲液和抗磷酸酪氨酸抗体珠子在固定化的抗-磷酸酪氨酸抗体的免疫沉淀实验中使用的所有緩沖液与在kinobead实验(见上面)中使用的那些相同，例外是，没有加入DTT，且加入50pLlmM冈田酸(Biomol，El-181;磷酸酶抑制剂)，以便达到500nM冈田酸的终浓度。从Biomol(目录号16-199)得到抗磷酸酪氨酸抗体珠子(含有共价偶联的重组4G10抗-磷酸酪氨酸抗体的琼脂糖珠子)。2.2.2抗-砩酸酪氨酸珠子的洗涤和平衡通过用合适的緩冲液洗涤和在緩冲液中平衡，制备用于结合反应的抗-磷酸酪氨酸珠子。1，使用15mlFalcon试管，进行所有洗涤步骤。2.每个实验使用100jil抗-磷酸酪氨酸珠子。3.用3mllxDP緩冲液(-DTT)洗涤珠子2次，用3mllxDP緩冲液/O.4%NP40(-DTT)洗涤一次。在每个洗涤步骤过程中，反转试管3-5次，在1200rpm、在4"C、在Heraeus离心机中离心2分钟。抽吸上清液，并抛弃。最后洗涤步骤后，用lxDP緩冲液/0.4%NP40(-DTT)制备1:1料浆(体积/体积)。2.2.3稀释的细胞裂解物的制备通过在合适緩沖液中稀释，并经离心步骤澄清，制备用于结合反应的细胞裂解物。1.使用相当于每个实验50mg蛋白的体积的细胞裂解物。2.在37C水浴中迅速融化裂解物，然后在水上保持样品。3.以下述方式稀释裂解物第一个稀释步骤用lxDP緩沖液/蛋白酶抑制剂/冈田酸/不含DTT稀释裂解物，使去污剂浓度从0.8%降低至0.4%NP-40。第二个稀释步骤用lxDP緩冲液/0.4%NP40/蛋白酶抑制剂/冈田酸/不含DTT进一步稀释裂解物，达到5mg/ml的终蛋白浓度。(注意只有在第一个稀释步骤之后裂解物的蛋白浓度高于5mg/ml时，才需要第二个稀释步骤)。4.将稀释的裂解物转入UZ-聚碳酸酯试管(Beckmann，355654)。5.通过超速离心(20min,4t:，100.000g，TI50.2转子，预冷的超速离心机)，澄清稀释的裂解物。6.保藏上清液，在冰上保藏。2.2.4结合反应和洗涤步骤使经洗涤和平衡的抗-磷酸酪氛酸珠子接触来自部分2.2.3的稀释的细胞裂解物，以便使蛋白结合抗-磷酸酪氨酸珠子。通过轻柔洗涤，去除非特异性结合的蛋白，以便减少背景结合。1.在15ml或50mlFalcon试管中，合并稀释的澄清的裂解物和100ji1经洗涤的抗-磷酸酪氨酸珠子。2.在4t:温育4小时，在冷室中在ROTOSHAKEGENIE(ScientificIndustries,Inc.)上旋转。3.温育后，在4匸、在1200rpm、在Heraeus离心机或等效仪器中离心3分钟。4.小心地去除上清液，不使珠子松开。5.将珠子转移至带90过滤器的Mobicol-柱(MoBiTec，Goettingen，目录号M1002-90)。6.用10mllxDP緩冲液/0.4XNP-40/不含DTT和5mllxDP緩沖液/O.2%NP-40/不含DTT洗涤珠子。7.使洗涤緩沖液完全流过柱，然后进行下一步。8.将柱置于埃彭道夫试管中，在800rpm、在4匸将它们离心1分钟。用下盖封闭柱。2.2.5结合的蛋白的洗脱1.加入60jli12xNuPAGESDS样品緩冲液(Invitrogen，NP0007;在使用前，用蒸馏水l:l稀释4x緩冲液)。2.在50"C温育样品30分钟。3.打开柱的下盖，在2000rpm离心MobiTec柱1分钟，分离洗脱液和珠子。4.加入1/10体积的200mg/ml碘乙酰胺，在室温温育30分钟，避光。该反应导致半胱氨酸的烷基化，用于质镨分析。5.将样品上样到凝胶之前，在15.000rpm离心样品5分钟，以便去除沉淀。6.为了蛋白分离，将60nl样品应用于NuPAGE4-12。/。Bis-Tris凝胶(Invitrogen，NP0335)。3.洗脱的酶(例如激酶)的质镨分析proteotypic肽的描述胰蛋白酶消化经SDS-PAGE-分离的蛋白混合物，每种蛋白会产生具有不同物理化学性质的许多不同的肽片段。这些肽的差别在于与用于蛋白鉴别(ID)的基于质谱法的分析平台的相容性，在这里是纳米毛细管反相-液相色镨电喷射离子化串联质谱(RP-LC-MS/MS)。结果，来自相同来源蛋白的肽的肽频率有很大程度的差异，最经常观察到的"通常，，促成该蛋白的鉴别的肽称作"proteotypic"肽。因此，"proteotypic肽"是在实验中非常容易观察到的肽，其会独特地鉴别特定蛋白或蛋白同种型。proteotypic肽的优点proteotypic肽在蛋白鉴别中的应用，允许通过将蛋白鉴别过程聚焦在筛选富含信息的特征肽的存在上，快速且集中地鉴别和定量多种已知的靶蛋白。proteotypic肽的实验鉴别建立一列proteotypic肽的一种策略是，经验为主地收集肽-鉴别数据，和搜索独特地鉴别蛋白的常见肽的数据集合。对于CZ数据集合中具有至少10个明确鉴别的每个IPI数据库蛋白条目(多肽ID或手工验证的单肽ID)，计算贡献肽的肽频率。仅仅考虑根据数据库搜索引擎Mascot(MatrixScience)特异性的、最好的肽-光镨匹配。为了定义特定蛋白的proteotypic肽，按照递减的肽频率，对肽排序，并计算累积的肽存在该值会给出每种肽的鉴别比例，其中存在该肽或任一种具有更高肽频率的肽。使用95°/4的累积存在截止值来定义proteotypic肽，即该蛋白的至少95%的鉴别事件是基于至少一种proteotypic肽。3.1质谱分析之前的蛋白消化和样品制备浓缩蛋白，在4-12%NuPAGENovex凝胶(Invitrogen，Carlsbad,CA)上分离，用胶体考马斯蓝染色。在整个分离范围内，将凝胶泳道系统地切成<48薄片(条带和带间区域)，并基本上如Shevchenko等，1996，AnalyticalChemistry68:850-858所述，进行凝胶内胰蛋白酶消化。简而言之，在5mMNH4HC03(在50%EtOH中)中使凝胶塞(gelplug)脱色过夜，用12.5ng/jil胰蛋白酶(在5mMNH4HC03中)消化4小时。用U甲酸提取肽，转入第二个96孔平板，在真空下千燥。将干燥的肽重悬于10pi0.1%甲酸水溶液中，将5pi注射进LC-MS/MS系统，用于蛋白鉴别。3.2质谱数据获取将肽才羊品注射进nanoLC系统(CapLC，Waters或Ultimate,Dionex)，后者直接连接到四极飞行时间(QT0F2，QT0FUltima,QT0FMicro,Micromass或QSTARPulsar,Sciex)或离子阱(LCQDecaXP，LTQ，Thermo-Finnigan)质i普仪。使用含水和有机溶剂的梯度，以15-45min的典型梯度时间，在LC系统上分离肽。溶剂A是5y。乙腈于0.1%甲酸中，溶剂B是70。/。乙腈于0.1%甲酸中。3.3蛋白鉴别在LC-MS/MS实验中产生的肽质量和断裂数据，用于查询国际蛋白指数(IPI)蛋白序列数据库(EBI)的内部副本。通过使用软件工具Mascot(MatrixScience;Perkins等，1999，Electrophoresis20:3551-3567)，将测量的肽质量和断裂数据与从数据库的登录条目计算出的相同数据相关联，鉴别蛋白。搜索标准随用于分析的质镨仪而异。4.结果在图2中显示了signalokinome实验的结果。该图显示了使用kinobead的药物pu11downs(左圏)和4吏用抗-磷酸酪氨酸抗体珠子的常规免疫沉淀(右圏)的对比。在Kinobead实验中，鉴别了共626种蛋白，其中有100种激酶。在免疫沉淀(IP)实验中，鉴别了共503种蛋白，其中有12种激酶。在重叠区域，列出了用这2个实验鉴别出的激酶(共同激酶)。结果表明，与抗-磷酸酪氨酸抗体珠子(12种激酶)相比，使用kinobead鉴别出明显更多的激酶(100种激酶)。在下表中，列出了2个实验方案鉴别出的激酶。另外，在单独的表中，列出了激酶的proteotypic肽序列。表6:免疫沉淀(IP)后鉴别出的激酶。激酶名称是根据人激酶命名法(http:〃kinase.com)和Manning等，2002，Science298，1912-1934,如补充材料所述)。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表7:免疫沉淀(IP，见表6)后鉴别出的激酶的proteotypic肽序列。激酶名称是根据人激酶命名法(http:〃kinase.com)和Manning等，2002，Science298，1912-1934，如补充材料所述)。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>表8:使用kinobead药物pulldown后鉴别出的激酶。激酶名称是才艮据人激酶命名法(hup:〃kinase.com)和Manning等，2002，Science298，1912-1934，如补充材料所述)。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>激酶标识激酶名称评分鉴别的肽数目可得到的和鉴别的实验proteotypic肽也在IP(见表1)中鉴别出79PHKg251916X80CaMKK21995X81MAP2K22946X82TGFbR249283Fused42284EphA2209990X85ACK1694IP86NLK46287CDK762320X88CHK2582X89KHS2604IP90MLK3591X91PKCe534X92PKCh534X93PYK21063X94TA02120395CKlgl452X96L皿l271697MAP2K14801498HRI52199SIK361100Erk7671101NEK21454102腿71755103BMPR1B1795X104MAP2K31335105FGFR251417表9:使用kinobead药物pulldown后鉴别出的激酶(见表8)的proteotypic欣序歹寸。<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>实验激酶名称鉴另'J出的proteotypic肽KinobeadDPYESLPQLVDMAAQIADGMAYIERKiiiobeadDPYESSDVWSFGILQTELVTKKinobeadDPYESAANILVGENLVCKKinobeadDPYESEVLEQVERKinobeadDPYESFQIINNTEGDWWEARKinobeadDPYESWTAPEAALYGRKinobeadDPYESLIEDNEYTARKinobeadDPYESGSLLDFLKKinobeadDPYESIADFGLARKinobeadDPZAKCEIEATLERKinobeadDPZAKGLEGLQVAWLVVBKKinobeadDPZAKLTIPSSCPRKinobeadDPZAK譜IAADGVLK实施例3:使用实验化合物用于蛋白洗脱的筛选测定本实施例解释了未修饰的实验化合物对结合到kinobead上的蛋白的竟争洗脱(具体见本发明的第四个方面)。使kinobead(如实施例1所述)接触小鼠脑裂解物，用各种不同的实验化合物洗脱结合的蛋白，通过质镨法分析释放的蛋白。1.生物样品(组织裂解物)的制备1.1裂解物的制备通过在维持蛋白的结构和功能的轻柔条件下，在裂解緩沖溶液(每个小鼠脑5ml緩沖液)中机械破碎，制备小鼠脑裂解物。进行如下的步骤*在室温或37C迅速融化组织，然后将组织转移至含有lx裂解緩沖液的玻璃瓶(使用大小足以配用PolytronPT3100匀浆器的瓶子)*在冷室中，在4X:，在5000-7000rpm、以4xl0秒脉沖裂解器官/组织鲁将匀浆转入预冷的50mlfalcon试管*在冰上温育匀浆30min,在6000g、在4iC旋转细胞10min(6.000rpm，在SorvallSLA600中，预冷)将上清液转移至UZ-聚碳酸酯试管(Beckmann，355654)在145.000g、在4C旋转上清液1h(40.000rpm,在Ti50，2中，预冷)鲁保藏上清液(取出和抛弃大部分脂质层(如果可能))，将上清液转移进玻璃瓶，在冰上保藏。*通过Bradford测定(BioRad),测定蛋白浓度。典型的蛋白浓度是在5-10Dig/ml的范围内。*在15-50mlFalcon试管内，制备等分试样。在液氮中冷冻等分试样，在-80"C保藏。1.2裂解緩冲液和储备溶液的制备制备含0.8%NP40的100mllx裂解緩沖液合并下述溶液或试剂，加入蒸馏水至终体积100ml:20ml5x裂解緩冲液(见下文)，100jal1MDTT，5ml0.5MNaF，4ml20%NP40，4片不含EDTA的完全片剂(蛋白酶抑制剂混合物，RocheDiagnostics,1873580)，加入蒸馏水至100ml。表10:5x-裂解緩冲液的制备<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>从下述供应商得到这些溶液1MTris/HClpH7.5:Sigma,T-2663;87%甘油Merck，目录号04091.2500;1MMgCl"Sigma，M-1028;5MNaCl:Sigma,S-5150经O.22ium过滤器，过滤5x浓缩的裂解緩沖液，以40ml等分试样在-80X:保藏。储备溶液的制备100mMNa3V04储备溶液的制备将9.2gNa具溶于400ml蒸馏水。1)使用1NNaOH或1NHC1,调节pH至10.0。原钒酸钠溶液的起始pH可随批次而变化。在pH10.0，溶液是黄色。2)煮沸溶液，直到它变成无色(约IOmin)。3)冷却至室温。4)再次调节pH至10.0,重复步骤2和3，直到溶液保持无色，且pH稳定在10.0。5)用蒸馏水调节体积至500ml。6)在-20^C冷冻等分试样。等分试样可以保藏几个月。500mMNaF储备溶液的制备将21.0gNaF(SIGMA，S7920)溶于500ml蒸馏水。经0.22pm过滤器过滤溶液，在4'C保藏。20%NP40-溶液的制备称量復0gNP40(SIGMA,Igepal-CA630，目录号13021)。加入蒸馏水直至200g。彻底混合，在室温储存溶液。1MDTT溶液的制备将7.7gDTT(Biomol，目录号04010)溶于50ml蒸馏水。经0.22jim过滤器过滤溶液，在-20X:冷冻40Qp1等分试样。等分试样可以保藏几个月。2.使Hnobead接触细胞裂解物，和用实验化合物洗脱结合的蛋白在允许裂解物中的蛋白结合配体的条件下，使kinobead接触小鼠脑裂解物。通过选择能维持蛋白功能的合适緩冲条件，结合条件接近于生理条件。通过轻柔洗涤操作，去除未捕获的蛋白后，使结合的蛋白接触用于蛋白洗脱的实验化合物。2.1DP-緩冲液的制备表11:5x-DP緩沖液的制备物质储备溶液在lx裂解緩冲液中的终浓度用于115x裂解緩冲液的加入量Tris/HClpH7.51M50mM250ml甘油87%5%288mlMgCl21M1.5mM7.5mlNaCl5M150mM150mlNa具100mM1mM50ml经O.22jam过滤器过滤5x-DP緩冲液，在-80。C保藏40ml-等分试样(注意相同緩冲液也用于制备总细胞裂解物)。从下述供应商得到这些溶液1.0MTris/HClpH7.5(SIGMA，T-2663),87%甘油(Merck,目录号04091.2500);1.0MMgCl2(SIGMA，M-1028);5.0MNaCl(SIGMA,S-5150)。制备下述的lxDP緩冲液lxDP緩沖液(用于珠子平衡)lxDP緩沖液/0.4%NP40(用于珠子平衡和珠子的第一个洗涤步骤)lxDP緩冲液/0.2%NP40(用于珠子的第二个洗涤步骤和化合物洗脱)lxDP緩冲液/蛋白酶抑制剂(用于第一个裂解物稀释步骤)；加入l片蛋白酶抑制剂片剂/25ml裂解緩冲液(无EDTA的片剂，蛋白酶抑制剂混合物，RocheDiagnostics,1873580)lxDP緩沖液/0.4。/。NP40/蛋白酶抑制剂(用于第二个裂解物稀释步骤)制备lxDP-緩沖液/0.4%NP40(100ml)的实例合并下述溶液和试剂，加入蒸馏水直至100ml的终体积20ml5xDP緩沖液，5ml0.5MNaF，2ml20%NP40，100pi1MDTT，加入蒸馏水直至100ml。所有緩沖液含有1mMDTT终浓度。2.2珠子的洗涤和平衡通过用合适的緩沖液洗涤和在緩冲液中平衡，制备用于结合反应的kinobead(实施例1)。1.使用15mlFalcon试管，进行所有洗涤步骤。2.每个实验4吏用100)i1Kinobead(沉降的珠子体积)混合相同量(25iul)的与下述4种配体偶联的每个珠子类型(偶联密度是1nmol/ml):BisVIII(CZC00001056)，PurvalanolB(CZC00007097)，PD173955衍生物(CZC00007324)，和CZC00008004。3.用3mllxDP緩沖液洗涤珠子2次，用3mllxDP緩冲液/0.4XNP40洗涤一次。在每个洗涤步骤过程中，反转试管3-5次，在1200rpm、在4t:、在Heraeus离心机中离心2分钟。抽吸上清液，并抛弃。最后洗涤步骤后，用lxDP緩沖液/0.4y。NP40制备1:1料浆(体积/体积)。2.3稀释的细胞裂解物的制备通过在合适緩冲液中稀释，并经离心步骤澄清，制备用于结合反应的小鼠脑裂解物。1.使用相当于每个实验50mg蛋白的体积的细胞裂解物。2.在37C水浴中迅速融化裂解物，然后在水上保持样品。3.以下述方式稀释裂解物3)用lxDP緩冲液/蛋白酶抑制剂稀释裂解物，使去污剂浓度从O.8°/。降低至0.4%NP-40。4)用lxDP緩冲液/0.4y。NP40/蛋白酶抑制剂进一步稀释裂解物，达到5mg/ml的终蛋白浓度(注意只有在第一个稀释步骤之后裂解物的蛋白浓度高于5mg/ml时，才需要第二个稀释步骤)。4.将稀释的裂解物转入UZ-聚碳酸酯试管(Beckmann，355654)。5.通过超速离心(20min，4X:，100.000g，TI50.2转子，预冷的超速离心机)，澄清稀释的裂解物。6.保藏上清液，在水上保藏。2.4结合反应和洗涤使洗涤和平衡的珠子(部分2.2)接触稀释的细胞裂解物(部分2.3)，以便使蛋白结合配体。通过轻柔洗涤，去除非特异性结合的蛋白，以便减少背景结合。1.在15ml或50mlFalcon试管中，合并稀释的澄清的裂解物和100ji1洗涂的Kinobead。2.在4。C温育2小时，在冷室中在ROTOSHAKEGENIE(ScientificIndustries,Inc,)上旋转。3.温育后，在41C、在1200rpm、在Heraeus离心机或等效仪器中离心3分钟。4.小心地去除上清液，不使珠子松开。5.将珠子转移至带90jam过滤器的Mobicol-柱(MoBiTec，Goettingen,目录号M1002-90)。6.用10mllxDP緩冲液/0.4%NP-40和5mllxDP緩沖液/0.2%NP-40洗涤珠子。7.使洗涤緩沖液完全流过柱，然后进行下一步。8.将柱置于埃彭道夫试管中，在800rpm、在4^C离心它们1分钟。用下盖封闭柱。2.5用实验化合物洗脱结合的蛋白按照下述步骤，将各种不同的实验化合物(见部分2.7)用于释放结合的蛋白1.将含有结合的蛋白的珠子(部分2.4)重悬于lxDP緩沖液/0.2%NP-40，制成1:3料浆(体积/体积)；2.将20jul1:3料浆转入MoBiTech柱(相当于5ju1珠子)。3.将柱置于埃彭道夫管中，在4X:、在800rpm离心15秒。用下盖封闭柱。4.加入IOp1含有1.0mM实验化合物的洗脱緩沖液(合适的浓度范围是O.1-1.0mM)。根据用于溶解实验化合物的溶剂，使用含有2%DMS0或2WDMF的洗脱緩沖液作为对照。用上盖封闭柱。5.在埃彭道夫培养箱中、在70Qrpm，在4X:温育30分钟。6.打开柱(首先顶部，然后底部)，将柱放回硅化处理的试管(SafeSealMicrocentrifugeTubes,目录号11270,SorensonBioscience,Inc.)。为了收获洗脱物，在2.000rpm、在室温在台式离心机中离心2分钟。洗脱物的典型体积是约15Ml。7.加入5ja1含有100mMDTT(DTT必须在即将使用前加入)的4xNuPAGESDS样品緩沖液(Invitrogen，NP0007)。8.在50"C温育30分钟。9.加入1/10体积的200mg/ml碟乙酰胺，在室温温育30min，避光。该反应导致半胱氨酸的烷基化用于质谱法。10.将样品上样到凝胶之前，在15.000rpm离心样品5分钟，以便去除沉淀。11.为了蛋白分离，将10pl样品应用于NuPAGE4-12WBis-Tris凝胶(Invitrogen，NP0335),2.6在该实验中使用的储备溶液的制备100mMNa3V04储备溶液的制备1)将9.2gNa3V0,溶于400ml蒸馏水。2)使用1NNaOH或1NHC1，调节pH至10.0。原钒酸钠溶液的起始pH可随批次而变化。在pH10.0，溶液是黄色。3)煮沸溶液，直到它变成无色(约10min)。4)冷却至室温。5)再次调节pH至10.0，重复步骤2和3，直到溶液保持无色，且pH稳定在10.0。6)用蒸馏水调节体积至500ml。7)在-201C冷冻等分试样。等分试样可以保藏几个月。500mMNaF储备溶液的制备将21.0gNaF(SIGMA，S7920)溶于500ml蒸馏水。经0.22pm过滤器过滤溶液，在4。C保藏。20%NP40-溶液的制备称量40.0gNP40(SIGMA，Igepa卜CA630，目录号13021)。加入蒸馏水直至20Gg。彻底混合，在室温储存溶液。1MDTT溶液的制备将7.7gDTT(Biomol,目录号04010)溶于50ml蒸馏水。经0.22iam过滤器过滤溶液，在-20X:冷冻40Gn1等分试样。等分试样可以保藏几个月。碘乙酰胺储备溶液(200mg/ml)的制备将2.Og碘乙酰胺(SIGMA，1-6125)溶于10ml蒸馏水。经0.22Mm过滤器过滤溶液，在-20t:冷冻400pl等分试样。等分试样可以保藏几个月。2.7用于洗脱的实验化合物下面列出的实验化合物在如下所述的稀释后用于洗脱实验。实验化合物原液的制备典型地，将所有化合物溶于100%DMS0(Fluka，目录号41647)，浓度为100mM。或者，100%DMF(Fluka，目录号40228)可以用于不能溶于DMSO的那些化合物。化合物保藏在-20匸。用于洗脱实验的实验化合物的稀释通过用100%DMSO1:1稀释100mM原液，制备50mM原液。对于洗脱实验，进一步用洗脱緩沖液(=lxDP-緩冲液/0，2%NP40)1:50稀释化合物。CZC1038:双丐l咮基马来酰亚胺III(供应商AlexisBiochemicals;目录号270-051-M005;化学式-C23H2。N402;分子量384.4)。CZC7097:PurvalanolB(供应商TocrisBiochemicals，目录号1581;化学组成C2。H"C1N6()3;分子量441.92;CAS号212844-54-7)。CZC00007324(PD173955衍生物；合成如实施例l所述)。CZC00008004:它是CZC00004919的类似物(合成如实施例1所述)。CZC00007098:SB202190(供应商:T0CRIS12641A/46297;化学式C2。H14N3OF;分子量331.34)。CZC00009280:星形孢菌素(供应商Sigma-ALDRICH:S4400;宽范围激酶抑制剂；化学式C28H26N403;分子量466.53)。CZC00007449:SP600125(供应商MerckBiosciences#420119,JNK1/2抑制剂；化学式C14H8N20;分子量220.2)。3.洗脱的酶(例如激酶)的质谱分析proteotypic肽的描述胰蛋白酶消化经SDS-PAGE-分离的蛋白混合物，每种蛋白会产生具有不同物理化学性质的许多不同的肽片段。这些肽的差别在于与用于蛋白鉴别(ID)的基于质语法的分析平台的相容性，在这里是纳米毛细管反相-液相色镨电喷射离子化串联质镨(RP-LC-MS/MS)。结果，来自相同来源蛋白的肽的肽频率有很大程度的差异，最经常观察到的"通常"促成该蛋白的鉴别的肽称作"proteotypic"肽。因此，"proteotypic肽"是在实验中非常容易观察到的肽，其会独特地鉴别特定蛋白或蛋白同种型。proteotypic肽的优点proteotypic肽在蛋白鉴别中的应用，允许通过将蛋白鉴别过程聚焦在筛选富含信息的特征肽的存在上，快速且集中地鉴别和定量多种已知的靶蛋白。proteotypic肽的实验鉴别建立一列proteotypic肽的一种策略是，经验为主地收集肽-鉴别数据，和搜索独特地鉴别蛋白的常见肽的数据集合。对于CZ数据集合中具有至少10个明确鉴别的每个IPI数据库蛋白条目(多肽ID或手工验证的单肽ID)，计算贡献肽的肽频率。仅仅考虑根据数据库搜索引擎Mascot(MatrixScience)特异性的、最好的肽-光谱匹配。为了定义特定蛋白的proteotypic肽，按照递减的肽频率，对肽排序，并计算累积的肽存在该值会给出每种肽的鉴别比例，其中存在该肽或任一种具有更高肽频率的肽。使用9W的累积存在截止值来定义proteotypic肽，即该蛋白的至少95%的鉴别事件是基于至少一种proteotypic肽。3.1质谱分析之前的蛋白消化和样品制备浓缩蛋白，在4-12%NuPAGENovex凝胶(Invitrogen，Carlsbad,CA)上分离，用胶体考马斯蓝染色。在整个分离范围内，将凝胶泳道系统地切成<48薄片(条带和带间区域)，并基本上如Shevchenko等，1996，AnalyticalChemistry68:850-858所述，进行凝胶内胰蛋白酶消化。简而言之，在5mMNH4HC03(在50%EtOH中)中使凝胶塞(gelplug)脱色过夜，用12.5ng/n1胰蛋白酶(在5mMNH4HC03中)消化4小时。用1%甲酸提取肽，转入第二个96孔平板，在真空下干燥。将干燥的肽重悬于10pl0.1%曱酸水溶液中，将5pl注射进LC-MS/MS系统，用于蛋白鉴别。3.2质镨数据获取将肽样品注射进nanoLC系统(CapLC，Waters或Ultimate,Dionex),后者直接连接到四极飞行时间(QT0F2，QT0FUltima,QT0FMicro,Micromass或QSTARPulsar,Sciex)或离子阱(LCQDecaXP，LTQ，Thermo-Finnigan)质镨仪。使用含水和有机溶剂的梯度，以15-45min的典型梯度时间，在LC系统上分离肽。溶剂A是5。/。乙腈于0.1%甲酸中，溶剂B是7(^乙腈于0.1%甲酸中。3.3蛋白鉴别在LC-MS/MS实验中产生的肽质量和断裂数据，用于查询国际蛋白指数(IPI)蛋白序列数据库(EBI)的内部副本。通过使用软件工具Mascot(MatrixScience;Perkins等，1999，Electrophoresis20:3551-3567)，将测量的肽质量和断裂数据与从数据库的登录条目计算出的相同数据相关联，鉴别蛋白。搜索标准随用于分析的质谱仪而异。4.结果该方法允许建立对于任意给定实验化合物洗脱的激酶的谱，从而允许评估实验化合物的选择性。一个限制是，仅仅可以评估在第一个步骤中捕获在kinobead上的激酶，其可能代表包含在细胞裂解物内的所有激酶的亚级分。<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>小分子(激酶支架化合物)文库。激酶名称是根据人激酶命名法(http:〃kinase.com)和Manning等，2002，Science298，1912-1934，如补充材料所述)。<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>实施例4:共同固定化的配体和分开偶联的配体的对比该实验的目的是，评估与共同固定化的配体(同时偶联)相比，含有一类配体的珠子的混合物(分开偶联的配体)在鉴别的激酶方面是否会产生类似的結果。结果表明，在两个实验中，鉴别的激酶存在宽重叠，证实2个方案都是可行的。将2种配体单独或同时偶联到琼脂糖珠子上，然后用于使用HeLa细胞裂解物的pulldown实验(配体1:BisVIII;配体2:CZC00008004;细节参见实施例1:kinobead的制备)。如实施例1所详述，进行各个化合物的偶联。也如实施例1所述进行2种配体的同时偶联，例外是，将化合物偶联到相同珠子上，其浓度为0.5pmol/mL，而不是标准的1pmol/mL珠子。通过HPLC分析，控制单独或同时固定化的化合物的偶联成功。如实施例l所述，洗涤和保藏珠子。如实施例2所述，进行HeLa细胞裂解物的制备，珠子洗涤，珠子与裂解物的接触，释放的蛋白的洗涤和质谮法分析(Signalokinome实验)。表I4:通过质谱分析鉴别出的激酶。使用2种同时偶联的配体(左边部分)和单独偶联的化合物(混合的珠子；右边部分)的实验对比。激酶名称是根据人激酶命名法(http:〃kinase.com)和Manning等，2002,Science298，1912-1934，如补充材料所述)。同时m(BisVIII和CZC8004预》^^)^W^S^^K子(BisVIII和CZC8004)鉴别MS粉肽做目中鉴别鰣MS粉肽的数目林预齡中1TBK1153163X1TBK1136557X2GSK3B93252X2鹏111336X3AurA89540X3TNK192144X4TYK284129X4TYK291734X5而77146X5AurA91046X6CDK274134X6G汰3A81447X7NEK973622X7CaMK2g78138X8GSDA70743X8G汰犯74533X9JNK265424X9JAK173127X10腦54823X10CaMK2d64126X11C禮g49424X11AurB63128X12CaMK2d45621X12DNAPK61024X13AAK145017X13J服257823X14AurB42415X14腿49921X15JAK11876X15CDK248519X16CDK91606016卿42317X17YES1085X17鹿36817X18FER1063X18TEC1597019MPSK1803019BIKE1244020D隨724X20YES1086X21|ULK3641021證593o表15:在同时偶联实验中鉴别的激酶和proteotypic肽的序列激酶名称proteotypic肽AAK1AP丽NLYSGKAURKBIYLILEYAPRAURKBLPLAQVSAHP證AURKBSNVQPTAAPGQKCAMK2DDLKPENLLLASKCAMK2DFTDEYQLFEELGKCAMK2DGAILTTMLATRCAMK2DIPTGQEYAAKCAMK2GLTQYIDGQGRPRCDK2ALFPGDSEIDQLFRCDK2簡ASALTGIPLPLIKCDK9IGQGTFGEVFK<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>表16:在混合实验(偶联后混合的珠子)中鉴别的激酶和proteotypic肽的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>激酶名称proteotypic肽STK6SKQPLPSAPENNPEEELASKSTK6VEFTFPDFVTEGARTBK1IASTLLLYQELMRTBK1LFAIEEETTTRTBK1TTEENPIFVVSRTBK1VIGEDGQSVYKTECELGSGLFGVVRTECGQEYLILEKTECHAFGSIPEIIEYHKTNK1AAALSGGLLSDPELQRTNK1ANL冊APPARTNK1MLPEAGSLWLLKTNUVADFGLVRPLGGARTYK2AAALSFVSLVDGYFRTYK2HGIPLEEVAKTYK2LGLAEGTSPFIKTYK2LSDPGVGLGALSRTYK2MVVAQQLASALSYLENKTYK2SLQLVMEYVPLGSLRTYK2SQAPDGMQSLRYES1EVLEQVER实施例5:kinobead配体5(吲咮配体91)的合成合成p引咮配体91:5-[5-氟-2-氧-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基曱基]-2，4-二甲基-lH-吡咯-3-甲酸(3-氨基-丙基)-酰胺步骤l:5-氟-l，3-二氢-吲哚-2-酮在110C，加热5-氟靛红(lg)于水合肼(55^10ml)中的溶液30分钟。一旦悬浮液转变成溶液，在IIO"C加热反应4小时，然后在01C冷却。过滤沉淀，用水洗涤。将固体悬浮于水(10ml)中，通过加入浓盐酸，使pH降低至pH2，在室温搅拌溶液5小时。收集沉淀，用水(2xl5ml)洗涤固体，在40X:真空烘箱中干燥(0.26g，30%)。^NMR(400MHz，DMSO-《)510.2(s，1H);6.8-7.0(dd，2H);6.6(m，1H);3.2(s，2H);。LCMS:方法D，RT-l.736min，[MHM52]。步骤2:{3-[(5-甲酰基-2，4-二甲基-lH-吡咯-3-羰基)-氨基]-丙基}-氨基甲酸叔丁基酯向5-甲酰基-2，4-二曱基-lH-吡唑-3-甲酸(0.300g，1.79mmo1)、N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳化二亚胺(0.516g，2.69mmo1)、1-羟基苯并三唑水合物(O.364g，2.69mmo1)、三乙胺(O.502ml，3.56mmo1)于二甲基曱酰胺(3ml)中的溶液中，加入N-Boc-l，3-二氨基丙烷(0.375ml，2.15mmo1)。在室温搅拌溶液15小时。加入盐水(l.5ml)、水(l.5ml)和饱和碳酸氬钠水溶液(1.5ml)的混合物，通过加入10N氬氧化钠，将溶液的pH调节至12。用二氯甲烷甲醇(9:1)的混合物，萃取溶液3次。用无水硫酸镁干燥有机层。去除溶剂，通过快速色镨(己烷乙酸乙酯(50-100%))纯化残余物，产生黄色固体状的希望的化合物(0.30g，52%)。^NMR(400MHz，DMS0-^)511.90(s，1H);9.50(s，1H);7.50(m，1H);6.90(m，1H);3.20(q，2H);3.00(q，2H);2.30(s，3H));2.20(s，3H));1.60(m，2H));1.40(s，9H)。LCMS:方法D,RT=2.103min，[M+Na+-346]，和[M-Boc+Na+=246]。步骤3:[3-((5-[5-氟-2-氧-l，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-lH-吡咯-3-羰基}-氨基)-丙基]-氨基甲酸叔丁基酯在78C加热U-[(5-甲酰基-2，4-二甲基-lH-吡咯-S-羰基)-氨基]-丙基}-氨基甲酸叔丁基酯(0.200g，0.62mmol)和5-氟-l,3-二氢-吲咮-2-酮(0.Ollg，0.62mmo1)、吡咯烷(O.003ml)于乙醇(2ml)中的溶液3小时。使反应冷却至ox:，过滤得到的沉淀，用冷乙醇洗涤。将产物悬浮于乙醇(4ml)，在72€搅拌30分钟。过滤反应物，在40X:真空烘箱中千燥沉淀，产生希望的化合物固体(0.2658，"。/。)。^NMR(400MHz，DMS0-《)513.8(s，1H);11.00(s，1H);7.80(m，2H);7.70(m，1H);7.0(m，1H);6.9(m,2H);3.30(q，2H);3.10(q，2H);2,50(dd，6H)1.60(m，2H));1.40(s，9H)。LCMS:方法D，RT=2.86min，[M+Na+=479]，和[M-Boc+Na+=379]。步骤4:5-[5-氟-2-氧-1，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-lH-吡咯-3-甲酸(3-氨基-丙基)-酰胺将[3-({5-[5-氟-2-氧-l，2-二氢-吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二曱基-lH-吡咯-3-羰基)-氨基)-丙基]-氨基甲酸叔丁基酯悬浮于甲醇。加入2mlHC1(4N)的二噁烷溶液，在室温搅拌反应物过夜。去除溶刑，产生希望的化合物(O.098g，91%)。^NMR(400MHz，DMSO-《)513.8(s，1H);11.00(s，1H);7.90-7.70(m，5H);6.9(m，2H);3,30(q，2H);2.80(q，2H);2.50(dd，6H)1.80(m，2H)。LCMS:由于荧光而不确定。在惰性气氛下进行所有反应。在Brukerdpx400上得到醒R光谱。使用zorbaxSBC-18,4.6mmxl50mm-5jla柱或小柱Z0RBAXSB-C18，4.6x75mm，3.5微米("短柱，，)，在Agilent1100上进行LCMS。柱流速是1ml/min，使用的溶剂是水和乙腈(0.1%TFA)，注射体积是10ul。波长是254和210mn。方法如下所述。表17:分析方法<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>表18:在化学方案中使用的缩写<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>实施例6:kinobead配体6(奮唑啉配体32)的合成合成眚唑啉配体32:7-(4-氨基)-丁基氧-4-(2-氟-4-溴-苯基)-氨基-6-甲氧基喹唑啉步骤1:7-千氧基-4-(2-氟-4-溴-苯基)-氨基-6-甲氧基喹唑啉向7-苄氧基-4-氯-6-甲氧基喹唑啉(0.250g，0.83mmol)和4-溴-2-氟苯胺(190mg，l咖ol)于异丙醇(10ml)中的溶液中，加入氢氯酸(4M，于二噁烷中，0.230ml，0.92mmo1)。在90匸搅拌混合物2小时。使反应混合物冷却至室温。滤出固体，用冷异丙醇和乙醚洗涤，最后在50t:干燥过夜，得到标题化合物(0.297g-79%)。^NMR(400MHz，CD30D-《)58.65(s，1H);7.96(s，1H);7.55(m，5H);7.40(t，3H);7.30(s，1H);5.37(s，2H);4.89(s，1H);4.08(s，1H)。LCMS:方法C，[M+-454]。步骤2:7-羟基-4-(2-氟-4-溴-苯基)-氨基-6-甲氧基喹唑啉将7-千氧基-4-(2-氟-4-溴-苯基)-氨基-6-曱氧基喹唑啉(297mg，0.654mmol)溶于三氟乙酸(5ml)，回流搅拌溶液l小时。使反应混合物冷却至室温，倒到冰上。滤出固体，吸收入甲醇中。使用氨水碱化溶液(至pHll),并真空还原。通过过滤收集固体，用冷水和乙醚洗涤，最后在50匸真空干燥过夜，得到标题化合物(0.165g-69。/。)？H腿(400MHz,CD3OD-《)58.55(s，1H);7.89(s，1H);7.52(m，3H);7.13(s，1H);4.08(s，3H)。LCMS:方法C，[M+-364]。步骤3:7-(4-氨基-酞酰亚胺)-丁基氧-4-(2-氟-4-溴-苯基)-氨基-6-甲氧基喹唑啉将N(-4-溴丁基)-酞酰亚胺(0.355g，0.1.187mmol)以一份加入7-羟基-4-(2-氟-4-溴-苯基)-氨基-6-甲氧基喹唑啉(360mg，0.989mmol)和碳酸钾(410mg，2.967mmo1)于二甲基甲酰胺(7ml)中的混合物。在601C搅拌反应混合物2小时，然后冷却至室温。加入水(10ml)，滤出沉淀。用冷水和曱醇洗涤固体，最后在501C真空下干燥过夜，得到标题化合物(0.317mg-57%)。NMR(400MHz，CD3OD-^)59.49(s，1H);8.29(s，1H);7.82(m,4H);7.71(s，1H);7.61(m，1H);7.47(t，1H，J-8.3Hz);7.413(m，1H);7.11(s，1H);4.09(m，2H);3.87(s，3H);3.62(m，2H);1.75(broads，4H)。LCMS:方法B，RT=9.20min，[MH+=410]。步骤4:7-(4-氨基)-丁基氧-4-(2-氟-4-溴-苯基)-氨基-6-曱氧基奮唑啉用肼一水合物处理7-(4-氨基-酞酰亚胺)-丁基氧_4-(2-氟-4-溴-苯基)-氨基-6-甲氧基喹唑啉a50mg，0.265ramo1)于二甲基甲酰胺(5ml)中的悬浮液。在室温搅拌反应混合物2天(几分钟后发生溶解，观察到原料的总消耗)，然后真空还原。使用"捕获和释放"方法(IsoluteSCX-2柱体，使用优化的释放方法)，纯化粘稠的黄色油，得到标题化合物(63mg，51%)。^NMR(400MHz，CDC1厂《)58.68(s，1H);8.48(t，1H，J-8.5Hz);7.36(m，1H);7.33(m，1H);7.32(broads，1H);7.25(s，1H);7.OO(s，1H);4.19(m，2H);4.02(s,3H);2.80(m，2H);1.98(m，2H);1.67(m，2H);1.49(broads，2H)。HPLC:方法D，RT-3.52min。在惰性气氛下进行所有反应。在Brukerdpx400上得到丽R光谱。使用zorbaxSBC-18，4.6mmxl50mm-5ja柱或小柱ZORBAXSB-C18，4.6x75mm,3.5微米("短柱")，在Agilent1100上进行LCMS。柱流速是1ffll/迈in，使用的溶剂是水和乙腈(O.1订FA)，注射体积是lOul。波长是254和210nm。方法如下所述。表19:分析方法<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>表20:在化学方案中使用的缩写<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>实施例7:kinobead配体7(修饰的星形孢菌素)的合成根据下述方法，合成基于星形孢菌素的Kinobead配体7。步骤1:用二甘醇酸酐(diglycolicacidanhydride)修饰星形孢菌素将星形孢菌素(典型地10mg，IRIS-Biotech,Germany)溶于1ml无水DMF中，加入5mLTEA,冷却至0C。从该溶液中，取出5pl，与50jilACN相混合，用于使用LC-MS系统(AGILENT,Germany)测定相对起始量。对于LC-MS分析，将5pi反应混合物稀释进50)Lil100%ACN。彻底混合后，使用自动釆样器，将5pi应用于HPLC分析。进行分离，流速为450|nl/niin，使用0.1%甲酸水溶液作为溶剂A，使用在100%ACN中的0.1%甲酸作为溶剂B，使用3x50mmC18柱(ZORBAX-延伸的C18，AGILENT,Germany)。使用75分钟中10%A-95%B的梯度。在254nin观察紫外吸光度，通过单阶段四极MS系统(MSD，AGILENT:Germany),在线测定化合物的分子质量。手工检查记录的数据。该第一个分析用作计算反应产物产率的标准。基于纯星形孢菌素，将紫外信号的峰面积设定为100%，作为起始量。向冰冷却的星形孢菌素溶液中，加入IO倍过量的于DMF中的二甘醇酸酐(MerckGermany)。接近100%产率的反应在10分钟内结束，通过混合5pl反应混合物和50piACN，通过HPLC检查，并如上所述通过LC-MS进行分析。对于带单电荷的分子，分子质量从467.5Da(未修饰的星形孢菌素)迁移至545.6Da(修饰的星形孢菌素)。如果反应不完全，再加入10倍过量的二甘醇酸酐，将混合物在室温保持另外30分钟。如上所述通过LC-MS分析反应混合物。反应结束后，检测不到未〗务饰的星形孢菌素。将5mL水加入反应混合物，首先淬灭酸酑，其次稀释以进行固相提取。通过用10ml甲醇活化和用0.1%TFA水溶液平衡，制备500mgC18固相提取柱(Phenomenex，Germany),《吏用膜真空泵，以约2-3ml/min的流速，将溶剂抽过该柱。将含水反应混合物应用于该柱，以与上面相同的流速，将其抽过。溶液完全通过柱并且修饰的星形孢菌素结合C18材料后，首先用5%ACN0.1%TFA洗涤，然后用10。/。ACN洗涤，最后用20%ACN洗涤，都含有0.1°/。TFA水溶液。然后用70%ACN，0.1%TFA水溶液、随后用80%ACN，0,1%TFA水溶液洗脱修饰的星形孢菌素。合并洗脱物，并真空干燥。步骤2:使用PyBroP-化学，将修饰的星形孢菌素偶联到固相结合的二胺上将修饰的星形孢菌素溶于无水DMF中，加入在DMF中的预溶胀的双-(氨基乙基)乙二醇-三苯甲基树脂(IRISBiotech,Germany),加入2-3倍过量的固相结合的二胺。向料浆中，加入IOpl二异丙基乙基胺(DIEA，FLUKA，Germany)和相对于修饰的星形孢菌素5倍过量的PyBroP。在反转混合仪上，在恒定混合下，在室温进行反应16小时。使用如上所述的LC-MS系统，通过HPLC检查上清液中未结合的修饰的星形孢菌素，该步骤不是定量的，仅仅测量未结合的修饰的星形孢菌素的消失。反应结束后(不再能检测到未结合的修饰的星形孢菌素)，用IO体积的无水DMF洗涤树脂，用10体积的DCM洗涤2次。步骤3:裂解反应然后将树脂重悬于5体积DCM,冷却至0'C，加入1mlTFA。先前的浅黄色树脂现在应当变成暗红色，指示反应。在0。C进行裂解20分钟，在室温进行20分钟。收集溶液，用10体积的DCM洗涤树脂2次。合并所有洗脱物，使用旋转式蒸发器干燥。将剩余的油膜溶于0.5mlDMF，加入5ml水。通过如上所述的固相提取，纯化修饰的星形孢菌素，并在真空下千燥。将反应产物溶于lmlDMF后，如上所述，使用HPLC，通过254nm紫外吸光度，相对于未修饰的星形孢菌素溶液，针对原始未修饰的星形孢菌素溶液检查产率。从该溶液中，取5与50jilACN相混合，通过LC-MS分析5jtl。预期产物的分子质量是727.8Da。将在254nm的峰面积与未修饰的星形孢菌素的峰面积(如所述分析为100%)相关联。象通常一样，通过它的氨基，将修饰的星形孢菌素用于偶联NHS-活化的琼脂糖。偶联之前，用12ml无水DMSO洗涤lml珠子3次，然后用1mL无水DMSO重悬。向该悬浮液中，加入20TEA和1一ol修饰的星形孢菌素于DMF中的等价物。加入和混合均匀并在1200rpm短离心1'分钟后，直接取20nl上清液，通过LC-MS分析5pl。在旋转混合仪上在连续混合下16小时后，再次离心悬浮液，取20pl，通过如上所述的LC-MS分析5pi,用于测定剩余的未结合的修饰的星形孢菌素。通常，100%修饰的星形孢菌素会结合。然后，用12mlDMS0洗涤珠子3次，再次用1mlDMS0重悬，加入50jil乙醇胺(MERCK，Germany),以封闭未反应的NHS-激活的基团。在连续混合下，进行反应16h。封闭反应后，用12ml异丙醇(MERCK，Germany)洗涤珠子3次，并在4TC保藏为l:l料浆备用。使用下述试剂DMF:N，N-二甲基曱酰胺(FLUKA，40228);TEA:三乙胺(SIGMA-Aldrich，T0886);ACN:用于HPLC的乙腈(Merck,1.00030);TFA:三氟乙酸(FLuKA，09653);PyBroP:溴-三-p比咯烷基-磷镇六氟碼酸盐(Novabiochem，0卜62-0017);DCM:二氯曱烷(FLUKA，66749);DMSO:二甲基亚砜(FLUKA，41648)。实施例8:裂解物中的竟争结合和定量蛋白亲和力图谱(PAP)本实施例解释了细胞裂解物中的竟争结合(具体见本发明的第三个方面)。将实验化合物双吲哚基马来酰亚胺VIII(BisVIII，一种众所周知的激酶抑制剂；Davies等，2000.Specificityandmechanismofactionofsomecommonlyusedproteinkinaseinhibitors.BiochemicalJournal351(Pt1):95-105)加入细胞裂解物，从而使实验化合物结合裂解物中的靶蛋白。然后，使裂解物接触kinobead亲和基质，以捕获剩余的游离靶蛋白。然后，用含有去污剂的緩沖液洗脱结合到kinobead基质上的蛋白，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并通过免疫检测(蛋白印迹)或质谱检测进行分析。对于蛋白印迹分析，从亲和基质洗脱结合到亲和基质上的蛋白，并随后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到印迹膜上。用针对GSK3oc、GSK30和ITK的特异性抗体，检测各个激酶(图4A)。结果表明，细胞裂解物与BisVIII预温育，以剂量依赖性的方式阻止乾蛋白GSK3a和GSK3p与Hnobead基质的结合。递增浓度的激酶抑制剂BisVIII，特异性地阻止GSK3oc和GSK3P与kinobead的结合，但不会阻止ITK的结合。对于GSK3P，定量信号，针对加入细胞裂解物中的BisVIII浓度绘图(图4B)。为了通过质谱法定量检测蛋白，从亲和基质洗脱蛋白，并随后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。切出合适的凝胶区域，用胰蛋白酶进行凝胶内蛋白水解消化。用iTRAQ试剂标记4份胰蛋白酶消化的样品(对应裂解物中的3个不同的BisVIII浓度和1份DMS0对照)，在单一LC-MS/MS质i普分析中分析合并的样品，随后在MS/MS镨中峰定量(Ross等，2004.MultiplexedProteinquantitationinSaccharomycescerevisiaeusingamine-reactiveisobarictaggingreagents.Mol.Cell.Proteomics3(12):1154-1169)。结果表明，检测到不同水平的单个蛋白，并计算了相对强度值(表21)。显示了各个激酶的结合曲线(图5)。代表激酶-化合物对的亲和力的相对强度50(RI50)值类似于激酶酶测定中报告的IC50值(Davies等，2000.Specificityandmechanismofactionofsomecommonlyusedproteinkinaseinhibitors.BiochemicalJournal351(Pt1):95-105)。1.细胞培养在l升旋动烧瓶(IntegraBiosciences,#182101)内的添加了10%胎牛血清(Invitrogen)的RPMI1640培养基(Invitrogen，#21875-034)中，以0.15x106至1.2x106细胞/ml的密度，悬浮培养Jurkat细胞(来自ATCC的克隆E6-1，编号TIB-152)，离心收集。在液氮中冷冻细胞沉淀，随后保藏在-8ox:。2.细胞裂解物的制备在PotterS匀浆器中，在下述裂解緩冲液中均质化Jurkat细胞50mMTris-HCl，0.8%NP40,5%甘油，150mMNaCl，1.5mMMgC12，25mMNaF，1mM钒酸钠，1mMDTT，pH7.5。每25ml緩沖液加入1片不含EDTA的完全片剂(蛋白酶抑制剂混合物，RocheDiagnostics,1873580)。使用机械化的POTTERS，研磨物质10次，转移至50mlfalcon试管，在水上温育30分钟，在20，000g、在4X:(10，000rpm,在SorvallSLA600中，预冷)旋转10分钟。将上清液转移至超速离心(UZ)-聚碳酸酯试管(Beckmann，355654)并在100.000g、在4匸(33.500rpm，在Ti50.2中，预冷)旋转1小时。将上清液再次转移至新鲜的50mlFalcon试管，通过Bradford测定(BioRad)，测定蛋白浓度，制备每份等分试样含有50mg蛋白的样品。将样品立即用于实验，或在液氮中冷冻，在-80C冷冻保藏。3.裂解物与实验化合物预温育在41c，Jurkat裂解物的等分试样(10mg蛋白)与不同的BisVIII浓度(0.025mM，0.074jaM，0.22jaM，0.67jliM，2.0和6.0jaM终浓度的BisVIII)温育1小时。为此，在100。/。DMSO溶剂中制备BisVIII溶液，相当于200倍希望的终BisVIII浓度(BisVIII来自AlexisBiochemicals目录号ALX270-056)。将5pl这样的溶液加入1ml裂解物，产生指示的终浓度。关于对照实验，使用5m1不含BisVIII的DMSO。4.用kinobead进行蛋白捕获向每份预温育的裂解物样品中，加入40"1kinobead(见实施例l),在4C温育1小时。在温育过程中，在反转摇动器(RotoShakeGenie，ScientificIndustriesInc.)上旋转试管。通过离心收集珠子，转移至Mobicol-柱(MoBiTech10055)，用含有0.4°/。NP40去污剂的10mllxDP緩沖液洗涤，然后用含有0.2%NP40的5mllxDP緩冲液洗涤。为了洗脱结合的蛋白，加入IOOpi2xSDS样品緩冲液，在50。C加热柱30分钟，通过离心，将洗脱物转移至微量离心管。然后，通过SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)分离蛋白。緩冲液的组成和制备如实施例2所述。5.通过蛋白印迹分析进行蛋白检测根据标准操作，进行蛋白印迹，并根据生产商的说明书(AmershamBiosciences,#RPN2106)，用ECL蛋白印迹检测系统显色。来自Amersham的ECL蛋白印迹系统是直接或间接用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体检测特定抗原的光发射非放射性方法。以1:1000的稀释度，使用抗-糖原合酶激酶3P(GSK3P)抗体(兔多克隆抗-GSK3P，StressgenBioreagents,Victoria,Canada,产品编号KAP-ST002)。该抗体也识别GSK3oc。也以1:1000的稀释度，使用抗-ITK抗体(兔多克隆抗-ITK抗体，UpstateLakePlacid,NY，目录号06-546)。6.通过质谱法进行蛋白检测6.1质谱分析前的蛋白消化还原凝胶分离的蛋白，烷基化，基本上按照Shevchenko等，1996，Anal.Chem.68:850-858所述的操作，在凝胶中消化。简而言之，使用清洁的解剖刀，从凝胶切离经凝胶分离的蛋白，使用10mMDTT还原(在5mM碳酸氢铵中，54°C，45分钟)，随后在室温用55mM碘乙酰胺(在5mM碳酸氬铵中)在黑暗中烷基化30分钟。以在SmM三乙基铵碳酸氢盐(TEAB)中10ng/pl的蛋白酶浓度，用猪胰蛋白酶(Promega)在凝胶中消化经还原和烷基化的蛋白。在37°C进行消化4小时，随后使用5pi5%曱酸终止反应。6.2质镨法分析之前的样品制备用20pi1%甲酸水溶液提取凝胶塞2次，用20卩l0.1%甲酸，60%乙腈水溶液提取1次，与酸化的消化上清液合并。在真空中千燥样品。6.3肽提取物的iTRAQ标记用同量异序标记试剂的不同异构体(iTRAQReagentsMultiplexKit,partnumber4352135，AppliedBiosystems，FosterCity,CA,USA),处理用不同浓度的实验化合物(0.074)iM，0.22jaM和0.67pMBisVIII)和溶剂对照(0.5%DMSO)处理过的样品的肽提取物。iTRAQ试剂是一组多种多样的、胺-特异性的、稳定的同位素试剂，其可以标记多至4个不同生物样品中的所有肽，实现肽的同时鉴别和定量。根据生产商提供的说明书，使用iTRAQ试剂。将样品重悬于10jal50mMTEAB溶液，pH8.5，加入lOpl乙醇。将iTRAQ试剂溶于85pl乙醇，将IOjil试剂溶液加入样品。在室温在水平摇动器上进行标记反应1小时，通过加入10y110%甲酸水溶液停止反应。然后合并4份经标记的样品，在真空离心机中干燥，重悬于IOnl0.1%甲酸水溶液。6.4质语数据获取将肽样品注射进nanoLC系统(CapLC，Waters或Ultimate,Dionex)，后者直接连接到四极TOF(QTOF2,QTOFUlUma，QTOFMicro,Microraass)或离子阱(LTQDecaXP)质镨仪。使用含水和有机溶剂的梯度(见下文)，在LC系统上分离肽。溶剂A是5W乙腈于0.5%甲酸中，溶剂B是70。/fl乙腈于0.5%甲酸中。表3:从LC系统洗脱的肽在质谱仪内部分测序<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>6.5蛋白鉴别在LC-MS/MS实验中产生的肽质量和断裂数据，用于查询在NCBI(对于NCBInr，dbEST以及人和小鼠基因组)和欧洲生物信息学研究所(EBI，对于人，小鼠，黑腹果蝇和美丽线虫蛋白质组数据库)维持和定期更新的fasta格式化的蛋白和核苷酸序列数据库。通过使用软件工具Mascot(MatrixScience;Perkins等，1999.Probabi1ity-basedproteinidentificationbysearchingsequencedatabasesusingmassspectrometrydata.Electrophoresis20，3551-3567)，将测量的肽质量和断裂数据与从数据库中登录条目计算出的相同数据相关联，鉴别蛋白。搜索标准随分析使用的质镨仪而异。6.6蛋白定量基本上如Ross等人(Ross等，2004.MultiplexedproteinquantitationinSaccharomycescerevisiaeusingamine—reactiveisobarictaggingreagents.Mol.Cell.Proteomics3(12):1154-1169)所述，使用iTRAQ报告离子信号的峰面积，进行相对蛋白定量。6.7结合曲线和RI50值的测定在表21中显示了鉴别的激酶的相对强度(RI)值。以在细胞裂解物中的3个不同浓度，使用实验化合物BisVIII，将RI值相对于DMSO对照标准化。对于选择的激酶，针对BisVIII的浓度绘制RI值，使用双曲线平衡模型，4吏用Xlfit程序(IDBusiessSolutionsLtd.)进行曲线拟合(图5)。RI50值对应着激酶的MS信号的相对强度与溶剂(DMS0)对照相比是50%时的实验化合物(BisVIII)浓度。表21:通过质i普分析鉴别的蛋白以在细胞裂解物中的3个不同浓度，使用实验化合物BisVIII,将得到的RI值相对于设定为1.0的DMS0对照标准化。列出了相对强度值。代表是指国际蛋白指数(IPI，EuropeanBioinformaticsInstitute)的数据库登录号，IPI是源自几个高质量序列数据库的蛋白序列的汇编(包括GenBank，EMBL，SwissProt，RefSeq，Ensembl)。激酶名称是根据人激酶命名法(http:〃kinase.com)和Maiming等，2002，Science298，1912-1934，如补充材料所述)。<table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>权利要求1.表征至少一种酶的方法，其包括下述步骤a)提供含有该酶的蛋白制品，b)在允许酶结合广谱酶配体的条件下，在基本上生理条件下使该蛋白制品接触至少一种固定化在固体支持物上的所述广谱酶配体，c)洗脱酶，和d)通过质谱法表征洗脱的酶。2.权利要求l的方法，其中步骤a)中蛋白制品的提供包括下述步骤收获至少一个含有该酶的细胞，和裂解该细胞。3.表征至少一种酶的方法，其包括下述步骤a)提供2份等分试样，其各自包含至少一个含有该酶的细胞，b)将一份等分试样与给定化合物温育，c)收获细胞，d)裂解细胞，e)在允许酶结合广镨酶配体的条件下，在基本上生理条件下使细胞裂解物接触至少一种固定化在固体支持物上的所述广i瞽酶配体，f)洗脱酶，和g)通过质镨法表征洗脱的酶。4.权利要求3的方法，其中通过表征酶，可以确定化合物的施用是否会导致该酶的差异表达或激活状态。5.表征至少一种酶的方法，其包括下述步骤a)提供含有该酶的蛋白制品的2份等分试样，b)在允许酶结合广谙酶配体的条件下，在基本上生理条件下使一份等分试样接触至少一种固定化在固体支持物上的所述广谱酶配体，c)在允许酶结合广谱酶配体的条件下，在基本上生理条件下使另一份等分试样接触至少一种固定化在固体支持物上的所述广谱酶配体和接触给定化合物，d)洗脱酶，和e)通过质谦法表征洗脱的酶。6.权利要求5的方法，其中步骤a)中蛋白制品的提供包括下述步骤收获至少一个含有该酶的细胞，和裂解该细胞。7.权利要求5或6中任一项的方法，其中检测到与化合物温育的等分试样中酶的减少，指示着该酶是该化合物的直接乾物。8.表征至少一种酶-化合物复合物的方法，其包括下述步骤a)提供含有该酶的蛋白制品，b)在允许酶结合广语酶配体的条件下，在基本上生理条件下使蛋白制品接触至少一种固定化在固体支持物上的所述广谱酶配体，c)使结合的酶接触化合物，以释放至少一种结合的酶，和d)通过质镨法表征释放的酶，或e)从配体洗脱酶，和通过质镨法表征酶，从而鉴别该化合物的一种或多种结合伴侣。9.权利要求8的方法，其中步骤a)中蛋白制品的提供包括下述步骤收获至少一个含有该酶的细胞，和裂解该细胞。10.权利要求9的方法，作为中或高处理量筛选进行。11.权利要求3-10中任一项的方法，其中所述化合物选自合成的化合物，或有机合成药物，更优选小分子有机药物，和天然小分子化合物。12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述酶选自激酶，磷酸酶，蛋白酶，磷酸二酯酶，氢化酶，脱氢酶，连接酶，异构酶，转移酶，乙酰化酶，脱乙酰基酶，GTP酶，聚合酶，核酸酶，和解旋酶。13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述配体会结合给定酶类别中10%-50%、优选30°/。-50%的酶。14.权利要求l-13中任一项的方法，其中所述配体是抑制剂。15.权利要求14的方法，其中所述酶是激酶，配体选自双吲哚基马来酰亚胺VIII，PurvalanolB，CZC00007324(可连接的PD173955),和CZC00008004。16.权利要求l-15中任一项的方法，其中通过表征酶的共同洗脱的结合伴侣、酶亚基或酶的翻译后修饰，进行酶的表征。17.权利要求l-16中任一项的方法，其中通过鉴别酶或酶结合伴侣的proteotypic肽，进行所述表征。18.权利要求17的方法，其中通过对比为酶或结合伴倡得到的proteotypic肽和已知的proteotypic肽,进行所述表征。19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述固体支持物选自琼脂糖，改性琼脂糖，琼脂糖珠子(例如NHS-活化的琼脂糖)，胶乳，纤维素，和亚铁-或铁磁性颗粒。20.权利要求l-19中任一项的方法，其中所述广镨酶配体共价偶联到固体支持物上。21.权利要求l-20中任一项的方法，其中使用1-IO种不同配体，优选l-6、更优选l-4种。22.权利要求l-21中任一项的方法，其中当使用超过一种配体时，每种配体存在于不同固体支持物上。23.权利要求l-21中任一项的方法，其中当使用超过一种配体时，至少2种不同配体存在于一个固体支持物上。24.权利要求1-23中任一项的方法，其中通过表征酶或化合物-酶复合物，确定细胞中酶类别的全部或部分成员的身份。25.权利要求3-24中任一项的方法，其中所述化合物不同于配体。26.权利要求l-25中任一项的方法，其中配体和酶之间的结合是非共价结合。27.生产药物組合物的方法，其包括下述步骤a)根据权利要求6-17中任一项的方法，鉴别酶-化合物复合物》和b)将化合物配制成药物组合物。28.权利要求27的方法，还包括调节化合物对酶的结合亲和力的步骤。29.至少一种固定化在固体支持物上的广谱酶配体在表征至少一种酶或表征至少一种酶-化合物复合物中的应用。全文摘要本发明涉及表征酶或酶-化合物复合物的方法，其中所述酶在至少一种固定化在固体支持物上的广谱配体的辅助下，从蛋白制品得到，且其中通过质谱法表征酶。这些方法用于筛选未固定化的化合物文库，先导化合物的选择性表征和在活细胞中的作用机制研究。文档编号G01N33/68GK101223447SQ200680025846公开日2008年7月16日申请日期2006年6月7日优先权日2005年6月14日发明者B·屈斯特,C·霍普夫,D·埃伯哈德,D·米德尔米斯,G·德勒韦斯,M·班舍夫,M·赖达,U·克鲁泽,V·雷德尔申请人:塞尔卓姆股份公司