专利名称：抗人磷酸二酯酶4d相互作用蛋白变体5的单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有抗体的医药配制品，或单克隆抗体的制备，具体是一种抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白变体5的单克隆抗体及其应用。
背景技术：
Myomegalin(MMG/MMGL/PDE4DIP, phosphodiesterase 4D interacting protein, 磷酸二酯酶4D相互作用蛋白)是一种崭新的蛋白，它分布于胞浆中，并在高尔基体和中心体处聚集，提示该分子的主要功能涉及这两个细胞器的cAMP信号转导。Myomegalin基因很长，约15万碱基对,但是其每个外显子都很小,大约只有30-40氨基酸，因此Myomegalin的变体很多。目前尚不清楚具体有多少个Myomegalin的变体存在。Myomegalin蛋白结构中含有α螺旋和coiled-coil结构，以及微管相关蛋白结合域和亮氨酸拉链模式。Myomegalin还被称作Η)Ε40ΙΡ,这是由于该蛋白可以结合循环中的 TOE4D(核苷酸磷酸二酯酶)。在肿瘤性疾病中能够见到Myomegalin的异常表现。骨髓增生异常的病人中可以检测出PDE4DIP-PDGFRB融合基因。在食管肿瘤中可以见到Myomegalin 变体5蛋白的高表达。变体I蛋白则在大多数的肿瘤细胞中缺失。由此可见，Myomegalin 变体与肿瘤的关系尚未完全阐明，值得进一步研究。1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊断、预防、治疗提供了新的工具。单克隆抗体是研究蛋白质表达和分布的主要工具之一， 针对Myomegalin的单克隆抗体可以检测细胞和组织,尤其是肿瘤组织中Myomegalin的表达水平和定位情况，有助于深入研究Myomegalin的细胞学功能及在肿瘤中的生物学作用。
发明内容
本发明是为了解决Myomegalin在细胞生物功能中的作用，以及Myomegalin与肿瘤之间的关系，应用于基础医学研究和临床检测问题，而提供一种抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白变体5蛋白的单克隆抗体及其应用。本发明是按以下技术方案实现的。—种抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白变体5蛋白的单克隆抗体,特点是该抗体特异性识别人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白变体5蛋白1103-1116位点氨基酸；该抗体由保藏号为CGMCC No. 5078的杂交瘤细胞株产生，氨基酸序列为序列表所示的氨基酸序列。一种杂交瘤细胞，该杂交瘤细胞株产生抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白变体5蛋白单克隆抗体，该杂交瘤细胞株保藏号为CGMCC No. 5078。所述抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白变体5蛋白的单克隆抗体在制备免疫组化检测试剂中的应用，用来检测人体组织及细胞中磷酸二酯酶4D相互作用蛋白变体5的表达与定位。以此原核表达多肽免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)细胞融合，用上述原核表达多肽进行筛选，获得阳性克隆，亚型鉴定及小鼠腹腔注射制备腹水， 腹水抗体进行细胞和组织的免疫组化，观察Myomegalin变体5蛋白的表达和定位检测。这样设计的本发明，其抗体与Myomegalin变体5蛋白具有特异性结合能力，制备人Myomegalin变体5蛋白的免疫组化检测试剂,用来检测人体组织特别是肿瘤组织细胞中 Myomegalin变体5的表达与定位。杂交瘤细胞株由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏；
地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。
保藏号为CGMCC No. 5078，保藏日期:2011年7月22日。
图I是Hela细胞的Myomegalin变体5蛋白免疫荧光染色图2显示Myomegalin变体5蛋白在乳腺导管内癌中的表达与定位；
图3显示Myomegalin变体5蛋白在正常乳腺中的表达。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明做详细的说明。—、Myomegalin变体5 (磷酸二酯酶4D相互作用蛋白变体5)的单克隆抗体的制备
I.实验材料来源
BALB/c小鼠由天津肿瘤医院提供，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；Hela细胞、小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)由天津肿瘤医院提供，购自中科院血研所。福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂、HAT、HT条件培养基成分购自Invitrigen公司。DMEM培养基、聚乙二醇 (PEG)、RPMI 1640培养基购自Hyclone公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠Ig、 邻苯二胺(OPD)、二氨基联苯胺(DAB)、8_氮鸟嘌呤(8-AG)购自Sigma公司。2.动物免疫
取7 10周龄BALB/c雌性小鼠4只，将IOOug Myomegalin变体5蛋白多肽(1103-1116 氨基酸，带有GST标签)(香港科技大学齐众教授提供)溶于O. 2ml O. IM PBS (pH7. 2)，与等体积弗氏完全佐剂(Sigma)充分混匀，腹部皮下多点注射。第I次免疫后第15和29天， 分别用IOOug多肽/ 0.2ml PBS与等体积弗氏不完全佐剂(Sigma)充分混匀后加强免疫， 融合前3d由尾静脉强化免疫注射50ug多肽/ O. 2ml PBS I次。3.细胞融合
取经加强免疫的BALB/c小鼠I只，放血处死后，无菌条件下取脾，制备脾细胞悬液。取 2X IO7个骨髓瘤细胞(SP2/0)，于37°C水浴中加50%PEG (MW 4000)1 ml融合，将融合细胞接种于96孔培养板内，分别采用HAT和HT培养基进行选择性培养。待杂交瘤细胞长至培养孔底面1/3时，用Myomegalin变体5蛋白多肽作包被抗原，以ELISA法筛选抗体，选择抗体分泌阳性孔，采用有限稀释法，将杂交瘤细胞稀释为5-10个/ml，接种于96孔培养板内， 选择单个细胞集落孔的培养上清作抗体检测，阳性者用同样方法再次克隆，直至克隆后有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为100%。4.阳性杂交瘤腹水单克隆抗体的制备
BALB/c小鼠腹腔注射PristaneO. 5ml /只，I周后腹腔注射生长良好的杂交瘤细胞 IO7, 10 d左右，小鼠腹部胀大至其活力极差时，处死小鼠，抽取其腹水，离心去沉淀，收集上清测定效价。5.间接ELISA法检测抗体效价
以Myomegalin变体5蛋白多肽包被酶标板，设空白对照组，37 °C包被过夜。用O. 25%BSA 37°C封闭I h。加入腹水抗体，以封闭液作系列梯度稀释，37°C孵育lh，PBS-T洗5次。加辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠Ig，37°C孵育lh，PBS-T洗5次。OPD底物显色系统显色5-10 min，测定0D492值。6.抗体亚型鉴定
以羊抗鼠Ig包被酶标板，37°C包被过夜。用O. 25%BSA 37°C封闭I h。加入杂交瘤培养上清，37°C孵育lh，PBS-T洗5次。分别加辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgGl、 IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA，37°C孵育 lh, PBS-T 洗 5 次。OPD 底物显色系统显色 5-10 min，测定 0D492 值。7.结果
细胞融合后，以重组Myomegalin变体5蛋白多肽为检测抗原，间接ELISA筛选获得一株单抗，亚型鉴定为IgGl，小鼠腹水效价为I :8000。二、Myomegalin变体5单抗的特异性检测
I.实验方法
将Hela细胞胰酶消化，取适量细胞点于载玻片上，37°C培养8小时后，冷甲醇固定， 2%BSA封闭Ih,加Myomegalin变体5单抗、微管蛋白(Y -tubulin)抗体孵育37°C 2h, PBS 洗涤后加不同荧光素标记的二抗室温闭光孵育lh，荧光显微镜下观察。见附图I。2.结果判定
微管蛋白(Y-tubulin)作为在细胞中心体和高尔基体上均有染色，以中心体为强； Myomegalin变体5主要在高尔基体上有明显荧光显色，中心体处略弱，说明该抗体对于 Myomegalin蛋白具有明显的特异性,特异性识别人Myomegalin蛋白变体5的1103-11160
位点氨基酸。三、Myomegalin变体5蛋白的单克隆抗体在制备免疫组化检测试剂中的应用
I.乳腺癌切片制备
乳腺癌切片取自天津肿瘤医院病理室，常规脱蜡。2.免疫组化步骤
将载玻片取出置于500ml甲醇+15ml 3% H202溶液中，浸泡15分钟，去除内源性过氧化物酶。浸入柠檬酸缓冲液(PH=6. O)中，微波炉抗原修复12分钟。每片点I滴正常羊血清，37°C温浴20分钟。应用Myomegalin变体5单抗I :800稀释，4°C过夜。PBS漂洗3遍， 加辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG，37°C孵育15分钟，DAB显色，常规复染与封片。3.结果判定
乳腺浸润性导管癌染色显示，Myomegalin变体5蛋白在阳性细胞胞浆内呈均匀着色的棕/黄色颗粒，或(和)密集散在分布，纤维间质细胞，淋巴细胞等不着色，背景清晰。正常乳腺很少着色，见附图2、3。因此,该抗体制备的人Myomegalin变体5蛋白的免疫组化检测试剂，用来检测人体组织及细胞中Myomegalin变体5的表达与定位。
SEQUENCE LISTING <110>天津市肿瘤医院
〈120〉抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白变体5的单克隆抗体及其应用 〈130〉 I 〈160〉 I
<170> PatentIn version 3. 3 〈210〉 I 〈211〉 14 〈212〉 PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 〈220〉
<221> protein 〈222〉 (I).· (14)
〈400〉 I
Gly Glu Leu Glu Ser Val Arg lie His His Lys His Ala Tyr I510
权利要求
1.一种抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白变体5的单克隆抗体，其特征是该抗体特异性识别人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白变体5的1103-1116位点氨基酸；该抗体由保藏号为 CGMCC No. 5078的杂交瘤细胞株产生，氨基酸序列为序列表所示的氨基酸序列。
2.一种杂交瘤细胞，其特征在于该杂交瘤细胞产生抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白变体5单克隆抗体，该杂交瘤细胞株保藏号为=CGMCC No. 5078。
3.根据权利要求I所述抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白变体5的单克隆抗体在制备免疫组化检测试剂中的应用，用来检测人体组织及细胞中磷酸二酯酶4D相互作用蛋白变体5的表达与定位。
全文摘要
本发明公开了一种抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白变体5的单克隆抗体及其应用，属于含有抗体的医药配制品，或单克隆抗体的制备。该抗体特异性识别人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白变体5的1103-1116位点氨基酸；该抗体由保藏号为CGMCCNo.5078的杂交瘤细胞株产生，氨基酸序列为GELESVRIHHKHAY。本发明的单克隆抗体与磷酸二酯酶4D相互作用蛋白变体5具有特异性结合能力，用来检测人体组织及细胞中磷酸二酯酶4D相互作用蛋白变体5的表达与定位，用作为人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白变体5的免疫组化检测试剂。
文档编号C07K16/18GK102584995SQ20111029724
公开日2012年7月18日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者张霖, 杨毅, 牛瑞芳, 罗艺, 魏熙胤, 齐众 申请人:天津市肿瘤医院