一种古代文物材料中胶原蛋白的检测方法
【专利摘要】一种古代文物材料中胶原蛋白的检测方法，其特征在于利用竞争酶联免疫的方法来检测古代文物材料中的蛋白成分，即将AbCam兔抗Ⅰ型胶原蛋白多克隆抗体固定于固相载体上，加入样品洗脱液形成抗原抗体复合物；用PBS缓冲溶液洗涤后再加入碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，使其通过反应而结合在固相载体上，此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例；加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量成正相关，因此可根据呈色的深浅进行定性分析。本发明所采用的方法成本低、检测简单、响应速度快。
【专利说明】一种古代文物材料中胶原蛋白的检测方法【技术领域】[0001]本发明涉及一种古代文物材料中胶原蛋白的检测方法，主要用于古代文物材料中 胶原蛋白的检测。【背景技术】[0002]文物是一定历史时期人类社会活动的产物，具有重要的科学价值。古代文物材料 对于文物的研究起着基础性的作用。胶原蛋白作为一种天然的高分子材料，在古代文物材 料中的应用十分广泛。以往鉴别古代文物材料中胶原蛋白的方法也很多，主要有显微镜观 察鉴别法、电子显微镜法、气相色谱法、液相色谱法、红外分光光度计法、热失重分析鉴别 等。但是这些方法都具有不确定性，尤其是当一种胶原蛋白来源于不同的材料或者一些蛋 白分子结构具有相似性时，这些方法根本不能进行高效的鉴别。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是:针对上述现有技术存在的问题提供一种灵敏度高、 简单高效的古代文物材料中胶原蛋白的检测方法。[0004]本发明所采用的技术方案是:利用竞争酶联免疫的方法来检测古代文物材料中 的蛋白成分，即将AbCam兔抗I型胶原蛋白多克隆抗体固定于固相载体上，加入样品洗 脱液形成抗原抗体复合物；用PBS缓冲溶液洗涤后再加入碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔 IgG(H+L)，使其通过反应而结合在固相载体上，此时固相上的酶量与标本中受检物质的量 呈一定的比例；加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检 物质的量成正相关，因此可根据呈色的深浅进行定性分析。其采用步骤如下:[0005]a)溶液配制=PBS 缓冲溶液的配制=KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g, NaH2PO4.7Η20 2.16g,用去离子水溶解并定容IOOOmL,调节PH至7.4，121°C灭菌处理；洗脱 液的配制:5mLlmol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液、ImL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶 液、180g尿素、25mL20%十二烷基硫酸钠(50mL去离子水中含有IOg溶质)，加去离子水溶解 并定容至500mL，用NaOH调节pH至7.4，无菌抽滤后在室温下储存；[0006]b)将PBS缓冲溶液80-100 μ L设为空白对照，样品鱼胶粉0.1-0.5mg设为阳性对 照；将80-100 μ L的PBS缓冲溶液、0.1-0.5mg样品鱼胶粉和0.1-0.5mg的实验样品文物材 料分别溶于80-120 μ L的洗脱液中，室温下放置2-4天，形成阳性对照样品鱼胶粉洗脱液和 实验样品文物材料洗脱液；[0007]c)取步骤b所述阴性PBS缓冲溶液、阳性对照样品鱼胶粉洗脱液和实验样品文物 材料洗脱液各40-60 μ L，分别与0.lmol/L的NaHCO3溶液80-100 μ L混合并放置10分钟；[0008]d)加 60-80 μ L0.lmol/L NaHC03 溶液至 ELISA 板的实验孔内；[0009]e)加10-30 μ L步骤c中得到的溶液到步骤d所述的ELISA板实验孔中；[0010]f)用保鲜膜或石蜡膜封板，4°C冰箱内放置过夜后继续实验；[0011]g)将ELISA板放置室温下使其温度回升至室温，去除ELISA板孔内样品；[0012]h)用PBS缓冲溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300 μ L，洗涤三次，每次三分钟；
[0013]i)去除步骤h的PBS缓冲溶液，每孔加300 μ Ll%牛血清白蛋白(BSA)溶液，室温下封闭Ih ；
[0014]j)去除步骤i的封闭液,每孔添加80-120 μ L—抗即AbCam兔抗I型胶原蛋白多克隆抗体，一抗的浓度稀释到1:3000到1:9000之间，室温下孵育2小时；
[0015]k)去除步骤j的抗体溶液，每孔加300 μ LPBS缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟；
[0016]I)去除步骤k的PBS缓冲溶液，每孔添加80-120 μ L 二抗即碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG (H+L)，二抗的浓度稀释至I:10000到1:12000之间，室温下孵育2小时；
[0017]m)去除步骤I的抗体溶液，用PBS缓冲溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300 μ LPBS缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟；
[0018]η)去除步骤m的PBS缓冲溶液，每孔加80-120 μ L10mmol/L的对硝基苯磷酸二钠溶液，待阳性对照反应完全，而阴性对照仍呈透明时，每孔加80-120 μ L0.75mol/L的NaOH溶液终止反应；
[0019]ο)用酶标仪读取405nm处各孔处的吸光度数值OD ；
[0020]p)比较空白对照样品鱼胶粉和实验样品文物材料的吸光度数值OD ;与空白对照样品鱼胶粉检测的OD值相比，如果文物洗脱液中胶原蛋白检测实验OD值明显增加，证明实验文物材料中确实存在胶原蛋白；与空白对照样品鱼胶粉检测的OD值相比，如果文物洗脱液中胶原蛋白检测实验OD值无显著变化，证明实验样品文物材料中不存在胶原蛋白。
[0021]本发明的有益效果是:1、本发明利用竞争酶联免疫的方法进行文物材料胶原蛋白成分的检测，一方面灵敏度高、专一性强、特异性强、成本低、操作简单，可以实现对文物材料成分的高效分析，另一方面，对文物本身的破坏性较小，可以较好的保持文物本身的原貌。2、与现有技术相比，本发明所采用的方法成本低、检测简单，响应速度快。
【具体实施方式】
[0022]本发明是利用竞争酶联免疫的方法来检测古代文物材料中的蛋白成分，即将AbCam兔抗I型胶原蛋白多克隆抗体固定于固相载体上，加入样品洗脱液形成抗原抗体复合物。用PBS溶液洗涤后再加入碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，使其通过反应而结合在固相载体上，此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量成正相关，可根据呈色的深浅进行定性分析。下面结合实施例对本发明作进一步说明:
[0023]实施例1
[0024]a)溶液配制=PBS 缓冲溶液的配制=KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g,NaH2PO4.7H20 2.16g,用去离子水溶解并定容IOOOmL,调节PH至7.4，121°C灭菌处理。洗脱液的配制:5mLlmol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液、ImL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液、180g尿素、25mL20%十二烷基硫酸钠(50mL去离子水中含有IOg溶质)，加去离子水溶解并定容至500mL，用NaOH调节pH至7.4，无菌抽滤后在室温下储存。
[0025]b)将PBS缓冲溶液100 μ L设为空白对照、样品鱼胶粉0.1mg设为阳性对照。将空白样品PBS缓冲溶液100 μ L、阳性对照样品鱼胶粉0.1mg和实验样品文物材料0.1mg分别溶于100 μ L洗脱液中，室温下放置2天，形成阳性对照样品鱼胶粉洗脱液和实验样品文物材料洗脱液。[0026]c)取步骤b所述阴性PBS缓冲溶液、阳性对照样品洗脱液和实验样品文物材料洗 脱液各50 μ L，分别与0.lmol/L NaHCO3溶液100 μ L混合并放置10分钟。[0027]d)加 65 μ L0.lmol/L NaHC03 溶液至 ELISA 板的实验孔内。[0028]e)加15 μ L步骤c中得到的溶液到步骤d所述的ELISA板实验孔中。[0029]f)用保鲜膜或石蜡膜封板，4°C冰箱内放置过夜后继续实验。[0030]g)将ELISA板放置室温下使其温度回升至室温，去除ELISA板孔内样品。[0031]h)用PBS缓冲溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300 μ L，洗涤三次，每次三分钟。[0032]i)去除步骤h的PBS缓冲溶液，每孔加300 μ Ll%牛血清蛋白(BSA)溶液，室温下 封闭Ih0[0033]j)去除步骤i的封闭液,每孔添加80 μ L—抗(AbCam兔抗I型胶原蛋白多克隆抗 体)，一抗的浓度稀释到1:3000。室温下孵育2小时。[0034]k)去除步骤j的抗体溶液，每孔加300 μ LPBS缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟。[0035]I)去除步骤k的PBS缓冲溶液，每孔添加80μ L 二抗(碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔 IgG (H+L) )，二抗的浓度稀释至1: 10000。室温下孵育2小时。[0036]m)去除步骤I的抗体溶液，用PBS缓冲溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300 μ LPBS 缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟。[0037]η)去除步骤m的PBS缓冲溶液，每孔加80 μ L10mmol/L的对硝基苯磷酸二钠溶液。 待阳性对照反应完全，而阴性对照仍呈透明时，每孔加80 μ L的0.75mol/L的NaOH溶液终 止反应。[0038]ο)用酶标仪读取405nm处各孔处的吸光度数值OD。[0039]p)比较阳性对照样品鱼胶粉和实验样品文物材料的吸光度数值0D。[0040]实施例2[0041]一种检测古代文物材料中胶原蛋白的方法，它包括如下步骤:[0042]a)溶液配制=PBS 缓冲溶液的配制=KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g, NaH2PO4.7H20 2.16g,用去离子水溶解并定容IOOOmL,调节PH至7.4，121°C灭菌处理。洗 脱液的配制:5mLlmol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液、ImL0.5mol/L的乙二胺四乙酸 溶液、180g尿素、25mL20%十二烷基硫酸钠(50mL去离子水中含有IOg溶质)，加去离子水溶 解并定容至500mL，用NaOH调节pH至7.4，无菌抽滤后在室温下储存。[0043]b)将PBS缓冲溶液100 μ L设为空白对照、样品鱼胶粉0.1mg设为阳性对照。将空 白样品PBS缓冲溶液100 μ L、阳性对照样品鱼胶粉0.1mg和实验样品文物材料0.3mg分别 溶于100 μ L洗脱液中，室温下放置3天，形成阳性对照样品鱼胶粉洗脱液和实验样品文物 材料洗脱液。[0044]c)取步骤b所述阴性PBS缓冲溶液、阳性对照样品洗脱液和实验样品文物材料洗 脱液各50 μ L，分别与0.lmol/L的NaHCO3溶液100 μ L混合并放置10分钟。[0045]d)加65 μ L0.lmol/L的NaHCO3溶液至ELISA板的实验孔内。[0046]e)加15 μ L步骤c中得到的溶液到步骤d所述的ELISA板实验孔中。[0047]f)用保鲜膜或石蜡膜封板，4°C冰箱内放置过夜后继续实验。[0048]g)将ELISA板放置室温下使其温度回升至室温，去除ELISA板孔内样品。[0049]h)用PBS缓冲溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300 μ L，洗涤三次，每次三分钟。
[0050]i)去除步骤h的PBS缓冲溶液，每孔加300 μ Ll%牛血清蛋白(BSA)溶液，室温下封闭Ih0
[0051]j)去除步骤i的封闭液，每孔添加80 μ L—抗(AbCam兔抗I型胶原蛋白多克隆抗体)，一抗的浓度稀释到1:6000。室温下孵育2小时。
[0052]k)去除步骤i的抗体溶液，每孔加300 μ LPBS缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟。
[0053]I)去除步骤k的PBS缓冲溶液，每孔添加80μ L 二抗(碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG (H+L) )，二抗的浓度稀释至1: 10000。室温下孵育2小时。
[0054]m)去除步骤I的抗体溶液，用PBS缓冲溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300 μ LPBS缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟。
[0055]η)去除步骤m的PBS缓冲溶液，每孔加80 μ L10mmol/L的对硝基苯磷酸二钠溶液。待阳性对照反应完全，而阴性对照仍呈透明时，每孔加80 μ L0.75mol/L的NaOH溶液终止反应。
[0056]ο)用酶标仪读取405nm处各孔处的吸光度数值OD。
[0057]p)比较阳性对照样品鱼胶粉和实验样品文物材料的吸光度数值0D。
[0058]实施例3
[0059]一种检测古代文物材料中胶原蛋白的方法，它包括如下步骤:
[0060]a)溶液配制=PBS 缓冲溶液的配制=KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g,NaH2PO4.7H20 2.16g,用去离子水溶解并定容IOOOmL,调节PH至7.4，121°C灭菌处理。洗脱液的配制:5mLlmol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液、ImL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液、180g尿素、25mL20%十二烷基硫酸钠(50mL去离子水中含有IOg溶质)，加去离子水溶解并定容至500mL，用NaOH调节pH至7.4，无菌抽滤后在室温下储存。
[0061 ] b)将PBS缓冲溶液100 μ L设为空白对照、样品鱼胶粉0.1mg设为阳性对照。将空白样品PBS溶液100 μ L、阳性对照样品鱼胶粉0.lmg、实验样品文物材料0.5mg分别溶于100 μ L洗脱液中，室温下放置4天，形成阳性对照样品鱼胶粉洗脱液和实验样品文物材料洗脱液。
[0062]c)取步骤b所述阴性PBS缓冲溶液、阳性对照样品洗脱液和实验样品文物材料洗脱液各50 μ L，分别与0.lmol/L的NaHCO3溶液100 μ L混合并放置10分钟。
[0063]d)加65 μ L0.lmol/L的NaHCO3溶液至ELISA板的实验孔内。
[0064]e)加15 μ L步骤c中得到的溶液到步骤d所述的ELISA板实验孔中。
[0065]f)用保鲜膜或石蜡膜封板，4°C冰箱内放置过夜后继续实验。
[0066]g)将ELISA板放置室温下使其温度回升至室温，去除ELISA板孔内样品。
[0067]h)用PBS缓冲溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300 μ L，洗涤三次，每次三分钟。
[0068]i)去除步骤h的PBS缓冲溶液，每孔加300 μ Ll%牛血清白蛋白(BSA)溶液，室温下封闭Ih。
[0069]j)去除步骤i的封闭液,每孔添加80 μ L—抗(AbCam兔抗I型胶原蛋白多克隆抗体)，一抗的浓度稀释到1:9000。室温下孵育2小时。
[0070]k)去除步骤j的抗体溶液，每孔加300 μ LPBS缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟。
[0071]I)去除步骤k的PBS缓冲溶液，每孔添加80μ L 二抗(碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG (H+L) )，二抗的浓度稀释至1: 10000。室温下孵育2小时。
[0072]m)去除步骤I的抗体溶液，用PBS缓冲溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300 μ LPBS缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟。
[0073]η)去除步骤m的PBS缓冲溶液，每孔加80 μ L10mmol/L的对硝基苯磷酸二钠溶液。待阳性对照反应完全，而阴性对照仍呈透明时，每孔加80 μ L0.75mol/L的NaOH溶液终止反应。
[0074]ο)用酶标仪读取405nm处各孔处的吸光度数值OD。
[0075]p)比较阳性对照样品鱼胶粉和实验样品文物材料的吸光度数值0D。
[0076]除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
【权利要求】
1.一种古代文物材料中胶原蛋白的检测方法，其特征在于利用竞争酶联免疫的方法来检测古代文物材料中的蛋白成分，即将AbCam兔抗I型胶原蛋白多克隆抗体固定于固相载体上,加入样品洗脱液形成抗原抗体复合物；用PBS缓冲溶液洗涤后再加入碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG(H+L)，使其通过反应而结合在固相载体上，此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例；加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量成正相关，因此可根据呈色的深浅进行定性分析。
2.根据权利要求1所述的古代文物材料中胶原蛋白的检测方法，其特征在于步骤如下: a)溶液配制=PBS缓冲溶液的配制=KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g, NaH2PO4.7H202.16g,用去离子水溶解并定容1000mL,调节PH至7.4，121 °C灭菌处理；洗脱液的配制:5mLlmol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液、ImL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液、180g尿素、25mL20%十二烷基硫酸钠(50mL去离子水中含有IOg溶质)，加去离子水溶解并定容至500mL,用NaOH调节pH至7.4，无菌抽滤后在室温下储存； b)将PBS缓冲溶液80-100μ L设为空白对照，样品鱼胶粉0.1-0.5mg设为阳性对照；将80-100 μ L的PBS缓冲溶液、0.1-0.5mg样品鱼胶粉和0.1-0.5mg的实验样品文物材料分别溶于80-120 μ L的洗脱液中，室温下放置2-4天，形成阳性对照样品鱼胶粉洗脱液和实验样品文物材料洗脱液； c)取步骤b所述阴性PBS缓冲溶液、阳性对照样品鱼胶粉洗脱液和实验样品文物材料洗脱液各40-60 μ L，分别与0.lmol/L的NaHCO3溶液80-100 μ L混合并放置10分钟； d)加60-80μ L0.lmol/L NaHC03溶液至ELISA板的实验孔内；· e)加10-30μ L步骤c中得到的溶液到步骤d所述的ELISA板实验孔中； f)用保鲜膜或石蜡膜封板，4°C冰箱内放置过夜后继续实验； g)将ELISA板放置室温下使其温度回升至室温，去除ELISA板孔内样品； h)用PBS缓冲溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300μ L，洗涤三次，每次三分钟； i)去除步骤h的PBS缓冲溶液，每孔加300μ Ll%牛血清白蛋白(BSA)溶液，室温下封闭Ih ； j)去除步骤i的封闭液，每孔添加80-120 μ L—抗即AbCam兔抗I型胶原蛋白多克隆抗体，一抗的浓度稀释到1:3000到1:9000之间，室温下孵育2小时； k)去除步骤j的抗体溶液，每孔加300 μ LPBS缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟； I)去除步骤k的PBS缓冲溶液，每孔添加80-120 μ L 二抗即碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG (H+L)，二抗的浓度稀释至I:10000到1:12000之间，室温下孵育2小时； m)去除步骤I的抗体溶液，用PBS缓冲溶液清洗ELISA板孔，每孔加入300 μ LPBS缓冲溶液，洗涤三次，每次三分钟； η)去除步骤m的PBS缓冲溶液，每孔加80-120 μ L10mmol/L的对硝基苯磷酸二钠溶液，待阳性对照反应完全，而阴性对照仍呈透明时，每孔加80-120 μ L0.75mol/L的NaOH溶液终止反应； ο)用酶标仪读取405nm处各孔处的吸光度数值OD ； P)比较空白对照样品鱼胶粉和实验样品文物材料的吸光度数值OD ;与空白对照样品鱼胶粉检测的OD值相比，如果文物洗脱液中胶原蛋白检测实验OD值明显增加，证明实验文物材料中确实存在胶原蛋白；与空白对照样品鱼胶粉检测的OD值相比，如果文物洗脱液中 胶原蛋白检测实验OD值无显著变化，证明实验样品文物材料中不存在胶原蛋白。
【文档编号】G01N33/68GK103575908SQ201310527119
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】刘苗苗, 郑益炜, 胡智文 申请人:浙江理工大学