一种古代胶结剂文物材料中卵蛋白的检测方法
【专利摘要】一种古代胶结剂文物材料中卵蛋白的检测方法，其特征在于利用夹心酶联免疫方法来检测古代胶结剂文物材料中的卵蛋白成分，即将Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗体结合到聚苯乙烯固相载体表面形成固相抗体，然后和胶结剂文物洗脱液结合形成免疫复合物，洗涤后再加入碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体，其与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物；加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量成正相关，因此可根据呈色的深浅进行定性分析；本发明所采用的方法成本低、检测简单、响应速度快。
【专利说明】一种古代胶结剂文物材料中卵蛋白的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种古代胶结剂文物材料中卵蛋白的检测方法，主要用于古代胶结剂文物材料中卵蛋白的检测。
【背景技术】
[0002]胶结剂作为一种功能性材料，在印绘、染整等工艺中起着重要的作用。古代胶结剂材料的主要组分是卵蛋白，因此对卵蛋白的检测对胶结剂材料的研究具有重要的科学价值。古代文物材料中胶结剂的蛋白检测方法主要有微量化学实验法、拉曼光谱法。微量化学实验法主要是利用卵蛋白在有机溶剂中的溶解性及其熔点等化学物理特性来鉴定，该法简单易行，但是特异性差。拉曼光谱法具有较高的空间分辨率，能够避免不同组分之间的干扰。然而，
[0003]古代文物材料年代久远，长期受光照、氧化等环境的影响，使得胶结材料成分复杂、含量甚微，也难以分析表征单一种类蛋白胶结材料。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是:针对上述现有技术存在的问题提供一种灵敏度高、简单高效的古代胶结剂文物材料中卵蛋白的检测方法。
[0005]本发明所采用的技术方案是:利用夹心酶联免疫方法来检测古代胶结剂文物材料中的卵蛋白成分，即将Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗体结合到聚苯乙烯固相载体表面形成固相抗体，然后和胶结剂文物洗脱液结合形成免疫复合物，洗涤后再加入碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体，其与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物；加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量成正相关，因此可根据呈色的深浅进行定性分析。
[0006]2.根据权利要求1所述的古代胶结剂文物材料中卵蛋白的检测方法，其特征在于步骤如下:
[0007]a)溶液配制=PBS 缓冲溶液的配制:KC10.2g，KH2PO40.2g，NaC18.0g,NaH2PO4.7H202.16g,用去离子水溶解并定容lOOOmL，调节PH至7.4，121°C灭菌处理；洗脱液的配制:5mLlmol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液、ImL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液、180g尿素、25mL20%十二烷基硫酸钠(50mL去离子水中含有IOg溶质)，加去离子水溶解并定容500mL，用NaOH调节pH至7.4，无菌抽滤后在室温下储存；
[0008]b)将PBS缓冲溶液80-100 μ L设为空白对照，样品卵蛋白0.1-0.5mg设为阳性对照；将80-10(^ L的PBS缓冲溶液、0.1-0.5mg样品卵蛋白、0.1-0.5mg的文物材料分别溶于80-120 μ L的洗脱液中 ，室温下放置2-4天，形成阳性对照样品卵蛋白洗脱液、实验样品文物材料洗脱液；
[0009]c)取包被液稀释10000-12000倍的一抗即Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗体80-100 μ L，加到聚苯乙烯反应板各孔中，用保鲜膜封板，温度4°C下保持24h，次日用PBS缓冲溶液充分洗涤3次，甩干；
[0010]d)各孔内加入1%牛血清白蛋白(BSA)溶液100 μ L，封闭lh，然后用PBS缓冲溶液进行洗涤三次，每次三分钟；
[0011]e)各孔内加入40 μ L-70 μ L的步骤b的阳性对照样品卵蛋白样品洗脱液和实验样品文物材料洗脱液，置37°C温箱中一个小时，移去液体，用PBS缓冲溶液洗涤三次，每次三分钟，甩干；
[0012]f)各孔内加稀释10000-12000倍之间的酶标二抗即碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG (H+L) 80-100 μ L，置37°C的烘箱中一个小时，移去液体，用PBS缓冲溶液洗涤三次，每次
三分钟，并甩干；
[0013]g)各孔内加底物液1%的四甲基联苯胺溶液100 μ L，置黑暗处使其反应20min ；
[0014]h)各孔内加2mol/L H2SO4溶液0.05mL,终止反应；
[0015]i)将步骤h液体取出，加到酶标仪中，读取在450nm处的吸光度；
[0016]j)比较阳性对照样品卵蛋白和实验样品文物材料二者的吸光度数值OD ;与空白对照样品卵蛋白检测的OD值相比，如果文物洗脱液中卵蛋白检测实验OD值明显增加，证明实验样品文物材料中确实存在卵蛋白；与空白对照样品卵蛋白检测的OD值相比，如果文物洗脱液中卵蛋白检测实验OD值无显著变化，证明实验样品文物材料中不存在卵蛋白。
[0017]本发明的有益效果是:1、本发明利用夹心酶联免疫的方法对胶结剂文物材料中的卵蛋白成分进行检测，一方面灵敏度高、操作简单。另一方面，避免其它蛋白的干扰，特异性强。2、与现有技术相比，本发明所采用的方法成本低、检测简单、响应速度快。
【具体实施方式】
[0018]本发明采用的夹心酶联免疫方法对古代胶结剂文物材料中卵蛋白进行检测，一方面灵敏度高、操作简单，另一方面，特异性强，能够避免其它蛋白的干扰。将Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗体结合到聚苯乙烯固相载体表面形成固相抗体，然后和胶结剂文物洗脱液结合形成免疫复合物，洗涤后再加入碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG (H+L)抗体，其与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量成正相关，因此可根据呈色的深浅进定性分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测试具有较高的灵敏度。
[0019]下面结合实施例对本发明作进一步说明:
[0020]实施例1
[0021]一种古代胶结剂文物材料中卵蛋白的检测方法，它包括如下步骤:
[0022]a)溶液配制=PBS 缓冲溶液的配制:KC10.2g，KH2PO40.2g，NaC18.0g,NaH2PO4.7Η202.16g,用去离子水溶解并定容IOOOmL,调节PH至7.4，121°C灭菌处理。洗脱液的配制:5mLlmol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液、ImL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液、180g尿素、25mL20%十二烷基硫酸钠(50mL去离子水中含有IOg溶质)，加去离子水溶解并定容至500mL，用NaOH调节pH至7.4。无菌抽滤后在室温下储存。
[0023]b)将PBS缓冲溶液IOOyL设为空白对照，样品卵蛋白0.1mg设为阳性对照。将100 μ L的PBS缓冲溶液、0.1mg样品卵蛋白、0.1mg的文物材料分别溶于100 μ L的洗脱液中，室温下放置2天，形成阳性对照样品卵蛋白洗脱液、实验样品文物材料洗脱液。[0024]c)取包被液稀释10000倍的一抗(Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗体)100 μ L，加 到聚苯乙烯反应板各孔中，用保鲜膜封板，4°C冰箱里面保持24h。然后用PBS缓冲溶液充分 洗涤3次，甩干。[0025]d)各孔内加入1%牛血清白蛋白(BSA)溶液100 μ L，封闭lh。然后用PBS缓冲溶 液进行洗涤三次，每次三分钟。[0026]e)各孔内分别加入40 μ L步骤b的阳性对照样品卵蛋白样品洗脱液和实验样品文 物材料洗脱液，置37°C温箱中一个小时，移去液体，用PBS缓冲溶液洗涤三次，每次三分钟，甩干。[0027]f)各孔内加稀释10000倍的酶标二抗(碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG(H+L)) ΙΟΟμ L，置37°C温箱中一个小时。移去液体，用PBS缓冲液洗涤三次，每次三分钟，并甩干。[0028]g)各孔内加入1%的底物液四甲基联苯胺溶液100 μ L，置黑暗处使其反应20min。[0029]h)各孔内加2mol/LH2S040.溶液0.05mL,终止反应。[0030]i)将步骤h液体取出，加入到酶标仪中，读取在450nm处的吸光度[0031]j)比较阳性对照样品卵蛋白和实验样品文物材料的吸光度数值0D。[0032]实施例2[0033]一种古代胶结剂文物材料中卵蛋白的检测方法，它包括如下步骤:[0034]a)溶液配制=PBS 缓冲溶液的配制:KC10.2g，KH2PO40.2g，NaC18.0g, NaH2PO4.7Η202.16g,用去离子水溶解并定容IOOOmL,调节PH至7.4，121°C灭菌处理。洗脱 液的配制:5mLlmol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液、ImL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶 液、180g尿素、25mL20%十二烷基硫酸钠(50mL去离子水中含有IOg溶质)，加去离子水溶解 并定容至500mL，用NaOH溶液pH至7.4。无菌抽滤后在室温下储存。[0035]b)将PBS缓冲溶液IOOyL设为空白对照，样品卵蛋白0.1mg设为阳性对照。将 100 μ L的PBS缓冲溶液、0.1mg样品卵蛋白、0.3mg的文物材料分别溶于100 μ L的洗脱液 中，室温下放置3天，形成阳性对照样品卵蛋白洗脱液、实验样品文物材料洗脱液。[0036]c)取包被液稀释11000倍的一抗(Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗体)IOOyLjP 到聚苯乙烯反应板各孔中，用保鲜膜封板，在4°C冰箱里面保持24h。然后用PBS缓冲溶液 充分洗漆3次，甩干。[0037]d)各孔内加入1%牛血清蛋白(BSA)溶液100 μ L，封闭lh。然后用PBS缓冲溶液 进行洗涤三次，每次三分钟。[0038]e)各孔内分别加入50 μ L步骤b的阳性对照样品卵蛋白样品洗脱液和实验样品文 物材料洗脱液，置37°C温箱中一个小时，移去液体，用PBS缓冲溶液洗涤三次，每次三分钟，甩干。[0039]f)各孔内加稀释11000倍的酶标二抗(碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG(H+L)) ΙΟΟμ L，置37°C温箱中一个小时。移去液体，用PBS缓冲溶液洗涤三次，每次三分钟，并甩干。[0040]g)各孔内加1%的底物液四甲基联苯胺溶液100 μ L,置黑暗处使其反应20min。[0041]h)各孔内加2mol/LH2S04溶液0.05mL,终止反应。[0042]i)将步骤h液体取出，加到酶标仪中，读取在450nm处的吸光度[0043]j)比较阳性对照样品卵蛋白和实验样品文物材料的吸光度数值0D。
[0044]实施例3
[0045]一种古代胶结剂文物材料中卵蛋白的检测方法，它包括如下步骤:
[0046]a)溶液配制=PBS 缓冲溶液的配制:KC10.2g，KH2PO40.2g，NaC18.0g,NaH2PO4.7Η202.16g,用去离子水溶解并定容IOOOmL,调节PH至7.4，121°C灭菌处理。洗脱液的配制:5mLlmol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液、ImL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液、180g尿素、25mL20%十二烷基硫酸钠(50mL去离子水中含有IOg溶质)，加去离子水溶解并定容至500mL，用NaOH调节pH至7.4。无菌抽滤后在室温下储存。
[0047]b)将PBS缓冲溶液IOOyL设为空白对照，样品卵蛋白0.1mg设为阳性对照。将100 μ L的PBS缓冲溶液、0.1mg样品卵蛋白、0.5mg实验样品文物材料分别溶于100 μ L洗脱液中，室温下放置4天，形成阳性对照样品卵蛋白洗脱液、实验样品文物材料洗脱液。
[0048]c)取包被液稀释12000倍的一抗(Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗体)IOOyLjp到聚苯乙烯反应板各孔中，用保鲜膜封板，在4°C冰箱里面保持24h。次日用PBS缓冲溶液充分洗漆3次，甩干。
[0049]d)各孔内加入1%牛血清白蛋白(BSA)溶液100 μ L，封闭lh。然后用PBS缓冲溶液进行洗涤三次，每次三分钟。
[0050]e)各孔内分别加入60 μ L步骤b的阳性对照样品卵蛋白样品洗脱液和实验样品文物材料洗脱液，置37°C温箱中一个小时，移去液体，用PBS缓冲溶液洗涤三次，每次三分钟，甩干。
[0051]f)各孔内加稀释12000倍的酶标二抗(碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG (H+L) 100 μ L，置37°C温箱中一个小时。移去液体，用PBS缓冲溶液洗涤三次，每次三分
钟，并甩干。
[0052]g)各孔内加1%的底物液四甲基联苯胺溶液100 μ L,置黑暗处使其反应20min。
[0053]h)各孔内加2mol/LH2S04溶液0.05mL,终止反应。
[0054]i)将步骤h液体取出，加到酶标仪中，读取在450nm处的吸光度
[0055]j)比较阳性对照样品卵蛋白和实验样品文物材料的吸光度数值0D。
[0056]除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
【权利要求】
1.一种古代胶结剂文物材料中卵蛋白的检测方法，其特征在于利用夹心酶联免疫方法来检测古代胶结剂文物材料中的卵蛋白成分，即将Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗体结合到聚苯乙烯固相载体表面形成固相抗体，然后和胶结剂文物洗脱液结合形成免疫复合物，洗涤后再加入碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体，其与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物；加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量成正相关，因此可根据呈色的深浅进行定性分析。
2.根据权利要求1所述的古代胶结剂文物材料中卵蛋白的检测方法，其特征在于步骤如下: a)溶液配制:PBS缓冲溶液的配制:KC10.2g，KH2PO40.2g，NaC18.0g,NaH2PO4.7H202.16g,用去离子水溶解并定容lOOOmL，调节PH至7.4，121°C灭菌处理；洗脱液的配制:5mLlmol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲溶液、ImL0.5mol/L的乙二胺四乙酸溶液、180g尿素、25mL20%十二烷基硫酸钠(50mL去离子水中含有IOg溶质)，加去离子水溶解并定容500mL，用NaOH调节pH至7.4，无菌抽滤后在室温下储存； b)将PBS缓冲溶液80-100μ L设为空白对照，样品卵蛋白0.1-0.5mg设为阳性对照；将80-100 μ L的PBS缓冲溶液、0.1-0.5mg样品卵蛋白、0.1-0.5mg的文物材料分别溶于80-120 μ L的洗脱液中，室温下放置2-4天，形成阳性对照样品卵蛋白洗脱液、实验样品文物材料洗脱液； c)取包被液稀释10000-12000倍的一抗即Millpore兔抗卵蛋白多克隆抗体80-100 μ L，加到聚苯乙烯反应板各孔中，用保鲜膜封板，温度4°C下保持24h，次日用PBS缓冲溶液充分洗涤3次，甩干； d)各孔内加入1%牛血清白蛋白(BSA)溶液100μL，封闭lh，然后用PBS缓冲溶液进行洗涤三次,每次三分钟； e)各孔内加入40μ L-70 μ L的步骤b的阳性对照样品卵蛋白样品洗脱液和实验样品文物材料洗脱液，置37°C温箱中一个小时，移去液体，用PBS缓冲溶液洗涤三次，每次三分钟，甩干； f)各孔内加稀释10000-12000倍之间的酶标二抗即碱性磷酸酯酶标记山羊抗兔IgG (H+L) 80-100 μ L，置37°C的烘箱中一个小时，移去液体，用PBS缓冲溶液洗涤三次，每次三分钟，并甩干； g)各孔内加底物液1%的四甲基联苯胺溶液100μ L，置黑暗处使其反应20min ； h)各孔内加2mol/LH2SO4溶液0.05mL,终止反应； i)将步骤h液体取出，加到酶标仪中，读取在450nm处的吸光度； j)比较空白对照样品卵蛋白和实验样品文物材料二者的吸光度数值OD ;与空白对照样品卵蛋白检测的OD值相比，如果文物洗脱液中卵蛋白检测实验OD值明显增加，证明实验样品文物材料中确实存在卵蛋白；与空白对照样品卵蛋白检测的OD值相比，如果文物洗脱液中卵蛋白检测实验OD值无显著变化，证明实验样品文物材料中不存在卵蛋白。
【文档编号】G01N33/68GK103575907SQ201310527117
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】刘苗苗, 郑益炜, 王秉 申请人:浙江理工大学