一种帕布昔利布原料有关物质的检测方法
【专利摘要】本发明提供一种帕布昔利布原料有关物质的检测方法，该方法是采用高效液相色谱法进行的，包括下述步骤：（1）配制帕布昔利布样品溶液；和（2）将步骤（1）所得样品溶液注入高效液相色谱仪，采用流动相A和流动相B作为流动相进行梯度洗脱，并记录色谱图；其中，所述高效液相色谱法的色谱柱固定相填充剂为氟苯基键合硅胶或苯基键合硅胶；流动相A的配制为酸性缓冲液的浓度为0.05%~0.3%去离子水溶液；流动相B的配制为酸性缓冲液体积：甲醇体积=0~10：100~90甲醇。本发明的检测方法在同一液相条件下测定帕布昔利布原料测定的有关物质，所述检测方法操作简便、分离度高、测定方法专属性强、检测结果准确可信。
【专利说明】一种帕布昔利布原料有关物质的检测方法
[0001]
技术领域
[0002]本发明属于药物分析领域。具体的说，本发明涉及一种采用高效液相色谱法测定帕布昔利布原料有关物质的检测方法。
技术背景
[0003]帕布昔利布(Palbociclib)是由美国辉瑞制药有限公司研发的一种高选择性的细胞周期蛋白依赖性激酶⑶K4和⑶K6可逆性拮抗剂。其化学名为6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(l-哌嗪基)-2-吡啶基]氨基}-7，8_ 二氢喹唑啉-7-酮，英文化学名为6-acetyl-8-cyc1penty1-5-methyl-2 - {[5- (1-piperazinyl) -2-pyridinyl] amino} -7,8-dihydro-quinazolin_7 ketone，其分子量为447.53，分子式为C24H29N7O2。
[0004]帕布昔利布可通过抑制⑶K4/6阻断细胞周期从Gl期到S期的进程，从而抑f|jljDNA合成。临床前研究数据表明，Palbociclib具有肿瘤细胞减灭作用及抑制细胞生长作用，是2015年由FDA批准的目前上市的第一个乳腺癌免疫治疗药物，目前上述的为普通胶囊剂(规格75mg、10mg和125mg)。
[0005]乳腺癌是乳房腺上皮细胞在多种致癌因子作用下，发生基因突变，致使正常细胞变为癌细胞。癌细胞的恶性增值使得乳腺组织的正常结构被破坏，挤压并侵蚀正常组织。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一(男性少见但存在)，仅次于子宫癌，其也可扩散到其他部位，也是严重危害患者身心健康、增加社会医疗负担的重大疾病。
[0006]乳腺癌的早期治疗包括手术治疗、内分泌治疗、化疗、放疗及分子靶向治疗，尽管如此，仍有很多患者会发生转移和复发，其主要机制包括肿瘤耐药、信号通路的激活和癌基因的活化等。目前，较多研究关注于肿瘤微环境和宿主的关系，其中免疫系统是重要的组成部分之一。因此针对患者的免疫系统，通过调节其在肿瘤为缓解以及宿主中的作用成为乳腺癌后续治疗的依据。帕布昔利布通过抑制CDK4/6阻断细胞周期从Gl期到S期的进程，从而抑制DNA的合成。其临床前试验数据表明帕布昔利布具有肿瘤细胞减灭作用及抑制细胞生长作用。
[0007]目前帕布昔利布原料合成工艺中，最终原料产品中可能含有的起始原料、中间体及降解的已知杂质共有7个，分别为4-(6-氨基吡啶-3-基)呢嗪-1-羧酸叔丁酯(SM1)、6-溴-
2-氯-8-环戊基-5-甲基-吡啶并[2，3-0]嘧啶-7(8!1)-酮(312)、叔丁基4-(6-(6-溴-8-环戊基-5-甲基-7-氧-7，8-二氢吡啶[2，3-d]嘧啶-2-yl氨基)吡啶-3-yl)哌嗪-1-羧酸盐(PALBOl)、叔丁基4-(6-(6-( 1-丁氧基乙烯)_8_环戊基-5-甲基-7-氧-7，8-二氢吡啶[2，3-d]嘧啶-2-yl氨基)吡啶-3-yl)哌嗪-1-羧酸盐(PALB02)、8-环戊基-5-甲基-2 - ((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-6-乙烯基吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-06651464)、8_环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(PF-00447880)、4- [6-(6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7，8-二氢吡啶并[2，3_d]嘧啶-2-基氨基)-吡啶-3-基]-哌嗪-1-羧酸叔丁基酯(PF-00310864)。
[0008]本发明所涉及的一种帕布昔利布原料有关物质的检测方法主要是针对以上其中帕布昔利布已知杂质进行有效的检测和分离。其中，4-(6-氨基吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯、6-溴-2-氯-8-环戊基-5-甲基-吡啶并[2，3-D]嘧啶-7(8H)_酮为起始原料;叔丁基4-(6-(6-溴-8-环戊基-5-甲基-7-氧-7 ,8-二氢吡啶[2，3-d]嘧啶-2-yl氨基)吡啶-3-yl)哌嗪-1-羧酸盐、叔丁基4-(6-(6-(1-丁氧基乙烯)-8-环戊基-5-甲基-7-氧-7，8-二氢吡啶[2，
3-d]嘧啶-2-yl氨基)吡啶-3-yl)哌嗪-1-羧酸盐为合成中间体；8-环戊基-5-甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-6-乙烯基吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮、8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮、4- [6-(6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7，8_二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-吡啶-3-基]-哌嗪-1-羧酸叔丁基酯为降解产物。
[0009]目前，中国药典及国外药典未收录帕布昔利布原料有关物质测定方法。在已公开的专利中，未查询到相关有关物质的检测条件。中国专利申请CN 105541832 A公开了一种羟乙基磺酸盐帕布昔利布的制备方法、另一中国专利申请CN 105418603 A公开了一种高纯度帕布昔利布及其反应中间体的制备方法、中国专利CN 105748435 A公开了一种帕布昔利布药物组合物及其制备方法、中国专利CN 104887641 A公开了一种帕布昔利布胃漂浮片及其制备方法。以上四个四个专利均未对帕布昔利布原料药有关物质检测方法进行研究和阐述。此外，在PCT专利申请W0/2016/0662420A1、W0/2016/0662429A1、US20160024084等中均未对帕布昔利布原料药有关物质测定方法进行研究。本发明所提供的检测方法可对上述七种杂质中的一种或多种进行有效检测。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种采用高效液相色谱法测定帕布昔利布原料药有关物质的检测方法，从而准确有效测定帕布昔利布原料中的有关物质，精确控制广品质量。
[0011 ]针对上述目的，本发明提供技术方案如下:
本发明提供一种帕布昔利布有关物质的检测方法，其中所述帕布昔利布有关物质包括
4-(6-氨基吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯、6-溴-2-氯-8-环戊基-5-甲基-吡啶并[2，3-D]嘧啶-7(8H)_酮、叔丁基4-(6-(6-溴-8-环戊基-5-甲基-7-氧-7，8-二氢吡啶[2，3-d]嘧啶-2-yl氨基)吡啶-3-yl)哌嗪-l-羧酸盐、叔丁基4-(6-(6-(l-丁氧基乙烯)-8-环戊基-5-甲基-7-氧-7，8_ 二氢吡啶[2，3-d]嘧啶-2-yl氨基)吡啶-3-yl)哌嗪-1-羧酸盐为、8-环戊基-
5-甲基-2- ((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-6-乙烯基吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮、8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶-2-基氨基)-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮、4- [6-(6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-吡啶-3-基]-哌嗪-1-羧酸叔丁基酯中的一种或多种，该方法是采用高效液相色谱法进行的，包括下述步骤:
(I)配制帕布昔利布样品溶液，所述的帕布昔利布样品溶液包括供试品溶液；
(2 )将步骤(I)所得样品溶液注入高效液相色谱仪，采用流动相A和流动相B作为流动相进行梯度洗脱，并记录色谱图；
其中，所述供试品溶液的制备方法包括下述步骤:精密称取帕布昔利布原料药样品，加稀释液溶解并稀释至帕布昔利布的浓度为0.2mg/ml?2mg/ml，得到供试品溶液；
所述高效液相色谱法的色谱柱固定相填充剂为氟苯基间隔硅胶或苯基键合硅胶，优选固定相填充剂为氟苯基键合硅胶。
[0012]所述杂质加样溶液的制备方法包括下述步骤:精密称取帕布昔利布对照品，加稀释液溶解并稀释至帕布昔利布的浓度为20ug/ml?5mg/ml，得到帕布昔利布对照品储备液;另分别取4-(6-氨基吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯、6-溴-2-氯-8-环戊基-5-甲基-吡啶并[2，3-D]嘧啶-7(8H)_酮、叔丁基4-(6-(6-溴-8-环戊基-5-甲基-7-氧-7，8_二氢吡啶[2，3-d]嘧啶-2-yl氨基)吡啶-3-yl)哌嗪-1-羧酸盐、叔丁基4-(6-(6-( 1-丁氧基乙烯)-8-环戊基-5-甲基-7-氧-7，8_二氢吡啶[2，3-d]嘧啶-2-yl氨基)吡啶-3-yl)哌嗪-1-羧酸盐为、8-环戊基-5-甲基-2 - ((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-6-乙烯基吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮、8-环戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪-1-基-吡啶_2_基氨基)_8H_吡啶并[2，3_d]嘧啶-7-酮、4- [6-(6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2，3-(1]嘧啶-2-基氨基)_吡啶-3-基]-哌嗪-1-羧酸叔丁基酯标准品，精密称定，分别用稀释液溶解并稀释至浓度为20ug/ml?5mg/ml，得到各杂质对照品溶液母液;精密量取帕布昔利布多照片储备液和帕布昔利布各杂质对照品母液，混合，加稀释液稀释，得到帕布昔利布杂质加样溶液；
优选地，其中所述稀释液为水:乙腈:高氯酸=60:40:0.05。
[0013]优选地，其中帕布昔利布供试品溶液中帕布昔利布的浓度为1.0mg/ml。
[00?4 ]优选地，其中帕布昔利布各杂质对照品母液浓度为100ug/ml。
[0015]优选地，在高效液相色谱法检测步骤(2)中，首先将自身对照溶液注入液相色谱仪，首先将对照溶液注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20%;再将供试品溶液和杂质加样溶液分别注入液相色谱仪，采用流动相A和流动相B作为流动相进行梯度洗脱，并记录色谱图；优选地，注入液相色谱仪中样品溶液的量均为2ul。
[0016]本发明的检测方法在同一液相条件下测定帕布昔利布原料中的有关物质，所述检测方法操作简便，帕布昔利布主峰保留时间较为合适，其中一只杂质均能得到有效检测，分离度高，测定方法专属性强，检测结果准确可信，为帕布昔利布原料的质量控制、杂质研究提供了一种简便合理的检测方法。本发明方法适用于帕布昔利布原料药中有关物质的测定和样品检验。
【具体实施方式】
[0017]下列实施例是对本发明的进一步解释与说明，但并不意味它以任何方式限制本发明的范围。
[0018]通过大量实验和探索，本发明的帕布昔利布原料有关物质的检测方法可以有效分离帕布昔利布与其相关的七种已知杂质，方法可靠，测定准确。
[0019]实施例1
本发明帕布昔利布原料有关物质检测方法
1.检测仪器及检测条件仪器:戴安 Ultimate3000 ；戴安 VWD-3100 色谱柱:氟苯基柱(1.711111，2.ImmX 10mm) 流动相:A: 0.05%( v/v)高氯酸水溶液 B:甲醇
流速:0.4ml/min ；检测波长:220nm ；
柱温:55 °C ;自动进样器温度为25 0C。
[0020] 2.溶液配制:取帕布昔利布原料样品，加稀释剂溶解制成每Iml约含帕布昔利布Img的供试品溶液。
[0021 ]精密量取供试品溶液Iml，置10ml容量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液。
[0022]取帕布昔利布对照品约10mg，置50ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即为帕布昔利布对照品储备液；另分别取SM 1、SM2、PALBO1、PALBO 2、PF-O 66 5146 4、PF-00447880、PF-00310864标准品各10mg，精密称定，置1ml量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，即为各杂质溶液母液;精密量取帕布昔利布对照品储备液5.0ml和各杂质溶液母液1.0ml，置1ml量瓶中混合，用稀释液稀释至刻度，摇匀，值得帕布昔利布杂质加样溶液。
[0023]3.测定方法:去自身对照溶液2ul注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为记录仪满量程的20%。另取供试品溶液和杂质加样溶液各2ul注入液相色谱仪，按照表I进行梯度洗脱，记录色谱图至主成分峰保留时间的3~4倍。
[0024]本发明操作简便，帕布昔利布主峰保留时间约为11分钟左右，检测时间较为合适，七种已知杂质均能得到有效的检测，分离度均符合要求(大于1.5)，测定方法专属性强，检测结果准确可信。
【主权项】
1.一种帕布昔利布原料中的有关物质的检测方法，其中所述帕布昔利布原料中的有关物质包括PF-00447880、PF-06651464、PF-00310864—种或多种，该方法是采用高效液相色谱法进行的，包括下述步骤: (1)配制帕布昔利布样品溶液，所述帕布昔利布样品溶液包括供试品溶液； (2)将步骤(I)所得样品溶液注入高效液相色谱仪，采用流动相A和流动相B作为流动相进行梯度洗脱，并记录色谱图； 其中，所述供试品溶液的制备方法包括下述步骤:精密称取帕布昔利布原料样品，加稀释液溶解并稀释至帕布昔利布的浓度为0.2mg/ml?2.0mg/ml，得到供试品溶液； 所述高效液相色谱法的色谱柱固定相填充剂为氟苯基键合硅胶或苯基键合硅胶，优选固定相填充剂为氟苯基键合硅胶； 流动相A的配制为0.05%?0.5%的酸性缓冲液;流动相B的配制0.05%?0.3%的酸性缓冲液体积:甲醇体积=0~10: 100?90。2.根据权利要求1所述的检测方法，其中流动相A的配制为0.05%酸性缓冲液。3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其中流动相B的配制为0.05%缓冲液体积:甲醇体积=0:100。4.根据权利要求3中任一项所述的检测方法，其中所述高效液相色谱法的梯度洗脱顺序如下: O分钟时流动相为:90?100体积％流动相A+0?10体积％流动相B ； 0-30分钟时流动相为:45?55体积％流动相A+45?55体积％流动相B ； 30-45分钟时流动相为:O?10体积％流动相A+90?100体积％流动相B ； 45-55分钟时流动相为:90?100体积％流动相A+0?10体积％流动相B ； 优选地，所述高效液相色谱法的梯度洗脱顺序如下: O分钟时流动相为:97体积％流动相A+3体积％流动相B ; 0-30分钟时流动相为:50体积％流动相A+50体积％流动相B ; 30-45分钟时流动相为:3体积％流动相A+97体积％流动相B ; 45- 55分钟时流动相为:97体积％流动相A+3体积％流动相B。5.根据权利要求1至4中任一项所述的检测方法，其中所述的酸性缓冲液的酸为高氯酸、磷酸、三氟乙酸，优选为高氯酸； 优选地，酸性缓冲液的浓度为0.05%?0.3%(v/v)，优选为0.05%； 优选地，酸性缓冲液的pH为2.0-7.0,优选地流动相的pH为2.3; 优选地，流动相的流速为0.3?0.5ml/min，优选流动相的流速为0.4ml/min。6.根据权利要求1至5中任一项所述的检测方法，其中所述高效液相色谱法的色谱柱柱温为40?65 °C，优选55 °C ； 优选地，自动进样室温度为4?30 °C，优选25 0C ； 优选地，检测波长为220nm。7.根据权利要求1至6中任一项所述的检测方法，其中所述帕布昔利布样品溶液还包括自身对照溶液和/或杂质加样溶液； 所述自身对照溶液的制备方法包括下述步骤:精密量取供试品溶液lml，置10ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，得到自身对照溶液； 所述杂质加样溶液的制备方法包括下述步骤:精密称取帕布昔利布对照品，加稀释液溶解并稀释至帕布昔利布的浓度为0.2mg/ml?2mg/ml，得到帕布昔利布对照品储备液；另分别取PF-00447880、PF-06651464、PF-00310864，精密称定，分别用稀释液溶解并稀释至浓度为20ug/ml?5mg/ml，得到各杂质对照品溶液母液;精密量取帕布昔利布对照品储备液和帕布昔利布坦各杂质对照品溶液母液，混合，加稀释液稀释，得到帕布昔利布杂质加样溶液； 优选地，其中所述稀释液为水:乙腈:高氯酸=60:40:0.05。8.根据权利要求1至7中任一项所述的检测方法，其中帕布昔利布供试品溶液中帕布昔利布浓度为lmg/ml。9.根据权利要求7或8所述的检测方法，其中帕布昔利布各杂质对照品溶液母液浓度为100yg/ml。10.根据权利要求7至9中任一项所述的检测方法，其中，在高效液相色谱法检测步骤(2)中，首先将样品自身对照溶液注入液相色谱仪，调节检测器灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为记录仪满量程的20% ;再将供试品溶液和杂质加样溶液分别注入液相色谱仪，采用流动相A和流动相B作为流动相进行梯度洗脱，并记录色谱图；优选地，注入液相色谱仪中样品溶液的量均为2μ1。
【文档编号】G01N30/06GK106018655SQ201610618387
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月1日
【发明人】丁青竹, 刘斐, 岳娟
【申请人】合肥远志医药科技开发有限公司