专利名称：基于虾夷扇贝毒素对细胞磷酸二酯酶的激活检测鱼产品中的这种毒素的定量方法以及这 ...的制作方法
技术领域：
本发明描述了依据虾夷扇贝毒素(yessotoxins)激活其细胞靶之一——磷酸二酯酶的能力来对所述毒素进行的体外检测和定量。它也描述了从虾夷扇贝毒素-磷酸二酯酶结合衍生的治疗应用。
海洋藻毒素是藻类产生的，代表一个严重公共健康问题的物质。这些毒素以一定方式聚集在软体动物和鱼体内，从而当人摄入软体动物和鱼时它们就会导致食物中毒。依据藻毒素所产生的中毒类型将其分成五大组麻痹性毒素(PSP)、腹泻性毒素(DSP)、神经毒性毒素(NSP)、雪卡毒素(CFP)和遗忘性毒素(ASP)(Van Dolah，2000)。还有一些会产生不同症状且不包含在前述组中的其他藻毒素组，它们是扇贝毒素(pectenotoxin)(PTXs)、azaspiracids和虾夷扇贝毒素(YTXs)(Van Dolah，2000)。最初PTXs和YTXs与DSPs分在一组，因为它们都是亲脂性毒素，经常在中毒事件中共存。但是，最近十年，却认为它们是不同的组，因为它们不会导致腹泻，口服毒性低，且分子量也不同(Draisci，Lucentini等人，2000)。在这些最近确定的组中，虾夷扇贝毒素(下文称为YTXs)代表一个严重的经济问题，因为它们最近且普遍存在，而且缺乏检测它们的敏感且特异的方法。
在日本、欧洲、新西兰和智利已经检测到了YTXs，且它们由网状原角藻(Protoceratium reticulatum)和Lingulodinium polyedrum(多边膝沟藻(Gonyaulaxpolyedra))甲藻产生。这些毒素聚集在海洋软体动物体内，且具有热稳定性，因此在烹饪海产品的过程中不会受到破坏。虽然大鼠口服YTXs后，在其肝脏和胰腺内检测到到组织病理改变，但YTXs从消化道的吸收低，因此口服摄入不会中毒(Terao，Ito等人，1990)。然而腹膜内注射这些毒素后则会引起严重的心脏中毒效应，并显现出高致死性潜能(Draisci，Lucentini等人，2000)。必须考虑这些腹膜内效应，因为前面已经提到，YTXs与DSP毒素共存，且当在生物测定中检测后者时，YTXs可能产生导致检测呈假阳性的干扰。因为这一原因，当制备鱼产品提取物时，为监测这些毒素的存在，需要用分离YTXs和DSP毒素的有机溶剂来进行额外的提取。可是这些改良意味着提取出大量的脂肪酸，其也可能产生假阳性(Yasumoto，Murata等人，1984)。
海洋产品提取物样品中的藻毒素的检测方法被分为测定方法和分析方法。测定方法是那些通过测量包括了样品中所有毒素活性的单一生物或生物化学反应，来提供总毒素含量值的方法。分析方法是那些关于仪器反应对样品中毒素进行分离、鉴定和个体定量的方法。第一种方法包括大鼠或小鼠的体内测定方法，以及体外测定方法，其中必须强调的是酶抑制测定方法、细胞测定方法、受体测定方法等。在这些情形中，用每组中的一种代表性的毒素来获取剂量-反应曲线，依据该曲线来确定毒性。其中，可通过比色测定、荧光测定、发光、偏振荧光方法或利用生物传感器实时确定配体-受体的相互作用来对反应进行定量。第二种方法是需要先用每种毒素的已知浓度标准来校准仪器设备的体外测定方法。这些测定包括化学方法，例如高效液相层析(HPLC)、质谱法或毛细管电泳。一般来说，当需要对样品中存在的每一种毒素进行鉴定和定量时，就使用仪器化学方法。但是在监控或健康检查项目中，这种潜在的总毒性知识被给予了更大的关联性，因此使用测定方法，也称为功能方法(Fernández，Míguez等人，2002)。
有几种检测污染的软体动物体内YTXs的液相层析-质谱法(Draisci，Palleschi等人，1999；Goto，Igarashi等人，2001)和荧光HPLC(Ramstad，Larsen等人，2001；Yasumoto和Takizawa，1997)分析方法。在检测这些毒素的体外功能测定方法中有两种新近的方法E-钙粘着蛋白检测测定(Pierotti，Malaguti等人，2003；Rossini，2002)和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活测定(Malaguti，Ciminello等人，2002)。但是依照2002年3月15日的委员会决定(CommissionDecision)2002/225/EEC，官方接受的唯一方法是小鼠生物测定方法。这项决定提供的软体动物样品中YTXs的最高水平为lmgYTXs/kg软体动物肉。生物测定方法在于观察腹膜内接种了提取物的三只小鼠24小时，其中提取物相当于5g通常会蓄积YTXs的软体动物消化腺或25g全软体动物。因为腹膜内施用允许的最大量YTX在6小时内会导致死亡，因此通过缩短观察时间和在该方法中导入另外的提取物对这种测定进行了改良。(Yasumoto，Murata等人，1984)。虽然这些另外的提取物意味着提取出大量的脂肪酸，但它们允许从YTXs中分离出DSP、PTX和azaspiracid毒素。如果三只接种小鼠中的两只死亡，就认为提取物中有YTX。这种方法意味着要杀死动物，不能提供毒素浓度的准确值，几乎不可重复，会产生假阳性，且为了能与其他毒素的存在相区别需要额外的提取过程。提到的其他检测YTXs的生物方法是比较慢的方法，其在少于24-48小时的时间里不能获得结果，而且需要仔细的毒素提取过程。更进一步地，因为其他的DSPs和这些毒素一起被检测，所以这些方法不是基于YTXs的特殊和独特的特性的。
为了确定YTXs的细胞靶，并因此进而确定其作用机制，已经进行了几项研究。YTX具有一个亲脂性分子，该亲脂性分子由通过醚基与不饱和侧链和两个磺酸酯结合的十一个环组成。
图1中显示了一些侧链取代基不同的YTXs天然类似物，虽然最近已经描述了超过50种天然衍生物，但还没有鉴定出它们的结构。在体外对YTX的研究中已经观察到YTX能产生凋亡，但其潜能比一种通常和YTX相关联的DSP毒素——甲基软海绵酸的潜能低(Leira，Alvarez等人，2001)；而且与甲基软海绵酸相反，YTX不抑制细胞磷酸酶(Draisci，Lucentini等人，2000)。因为YTX能抑制人肝细胞癌细胞(HEP-G2)的生长，所以其具有细胞毒性效应，并因此可以用作抗肿瘤药物。也有人描述YTX会改变淋巴细胞的胞质钙水平(De la Rosa，L.A.，Alfonso，A.等人.，2001)，并增加这些细胞中maitotoxin诱导的钙流动(De la Rosa，L.A，Alfonso，A.等人，2001)。最近也观察到YTX能通过激活破坏cAMP的细胞磷酸二酯酶(PDEs)来降低环腺苷酸(cAMP)第二信使的细胞内水平，这表明磷酸二酯酶可能是YTXs的细胞靶之一(Alfonso，de la Rosa A.等人，2003)。另一方面，已经观察到YTX是大鼠肥大细胞中由免疫学刺激激活的组胺释放抑制剂，且因此可将其用作抗变应性药或止喘药。
在哺乳动物细胞中大约有含有不同同工型的11个家族的PDE(Houslay和Adams，2003)。这些酶能够调节并维持cAMP和环鸟苷酸(cGMP)的水平稳定，cGMP是参与多种生命机能的细胞发挥其功能所必需的第二信使(Soderling和Beavo，2000)。从制药观点来说，这些酶家族是非常重要的，因为它们的调节涉及到治疗疾病，例如哮喘、类风湿关节炎和癌症(Houslay和Adams，2003)。因为这个原因，对影响PDEs的天然或合成分子的描述，以及可用于HTS(高通量筛选)方案的研究这些分子活性的方法，是发现对这些疾病的新治疗方法的非常重要的工具。从这一点上来说，描述YTXs对肿瘤细胞生长的抑制效应和其对组胺释放的调节是这些分子对于其可能的治疗应用的药理学重要性的两个指征。
利用最近对YTX作用机制的描述，本发明开发了一种基于这些毒素对细胞PDEs的特异性亲和力，来检测鱼产品提取物中这些毒素的方法。这些方法是功能测定方法，在这些方法中，存在的其他作用机制不同的毒素时不会产生干扰，也就是说，这些其他毒素不对PDEs产生作用，但它们与YTX在中毒事件中共存。更进一步地，这种方法避免了假阳性和杀死动物，且因为在1-2小时内就能获得准确的毒素浓度，所以加快了所述产品的污染监控进程。
基于YTX是PDE激活剂并能将这种激活转化成可测量信号的发现，本发明描述了三种用途。
用途1利用亲和传感器确定PDE-YTX生物分子结合的方法利用生物传感器实时确定分子间的相互作用是一种新技术，其应用正延伸到不同的研究领域(Hide，Tsutsui等人，2002；Lee，Mozsolits等人，2001；Mariotti，Minunni等人，2002；Tsoi和Yang，2002)。使用的生物传感器是检测被称为配体的生物活性分子，与另一种和它结合的被称为受体的分子之间的分子反应的设备。配体与这种设备的支持表面结合，所述设备通常为杯或板。在发生结合的支持表面上生成对质量变化非常灵敏的电磁场，也称为渐消场(evanescentfield)。生物传感器能将由配体-受体结合导致的支持表面上的质量变化转换成电信号。可用于本发明的商业生物传感器是那些由Biacore或Thermo Labsystems公司在市场上销售的传感器。在本发明中，将作为配体起作用的PDEs和作为受体起作用的含有YTX的样品加在一起。依赖于附着到PDEs上的毒素的量，并因此也依赖于样品中存在的YTX，生物传感器的信号将变得更大或更小。
作为配体起作用的细胞PDEs与支持表面结合。接下来将已知浓度的作为受体起作用的YTX加入到这个表面上。利用平面表面或基质形成的表面能很好地实施这一技术。PDE-YTX结合遵循调节为准一级方程的动力学，从所述方程可获得被称为表观结合速率(Rap)的常数，且毒素的每个浓度的Rap不同。利用Rap和毒素浓度数据画出了校正线。将检测样品(鱼产品的提取物)加入到表面上，计算出该样品的Rap，将这个Rap值放到校正线上就可获得检测样品中的YTX浓度。
发明的实施方案在22-37℃的温度下实施该方法。
a.将pH值为7.7，浓度为0.1-0.24mg/ml的PDEs溶液加入到活化的二室表面。通过不可离解的共价键将这些酶结合到支持表面上。接着用不同的封闭溶液(BSA、Etanolamine、Tris-HCl...)封闭没有结合PDEs的活性基团。
b.将已知浓度的含有YTX的溶液加入到一室中。另一室中用作空白，并向其中加入毒素溶剂。记录PDE和YTX的结合动力学15分钟。
c.用pH值为7.7的缓冲溶液洗涤二室来实施配体受体的离解，从而从PDEs上离解YTX。
d.为了彻底去除YTX，用酸或碱溶液来再生所述室。这样PDEs将容易接近新加入的YTX。
e.使用5中不同浓度的YTX，重复步骤b、c和d。
f.从每一种浓度的毒素的结合动力学来获得表观结合速率(Rap)。作出的Rap值对YTX浓度的图遵循回归系数大于0.9的线性拟合。因此可获得一条线，当知道一个样品的Rap时，利用这条线就能够确定所述样品中YTX的浓度。
g.对待研究的鱼产品的肉进行提取。依据2002年3月15日的决定2002/225/EEC或任何其他官方方法(D.O.G.A，1986)中确定的最高水平和不同鱼产品中某种海洋毒素的分析方法来实施提取。取等分试样的提取物(检测样品)，并将其加入到结合在表面上的PDE上。获取结合动力学，并据此计算出Rap。将检测的Rap值放在获得的回归线上，就能够确定样品中YTX的浓度。
图2显示这种方法中所使用的步骤的曲线图，所述步骤从表面活化到加入检测样品。图3显示了Rap值对已知YTX浓度的回归线。
用途2利用荧光分子确定YTX激活PDE的方法检测细胞PDE活性的常规方法是观察它们破坏cAMP的能力。有一种cAMP荧光衍生物——邻氨基苯甲酰cAMP(激发波长350nm，发射波长445nm)，当它降解时，其荧光下降。荧光随时间推移的下降可表现为cAMP的破坏速率。在PDEs存在时，破坏速率增加，而且如果这些酶被活化，则降解速率将会更高。在本发明中确定了PDEs存在时荧光指示剂邻氨基苯甲酰cAMP的降解速率，也研究了在加入含有YTX的样品时，所述降解速率的变化。用为读取微量滴定板而准备的荧光计读出所述荧光。确定几种已知浓度的YTX存在时的破坏速率。破坏速率对毒素浓度的图遵循回归系数大于0.9的线性拟合。因此可获得一条回归线，在这条线中可将从鱼产品样品(检测样品)中获得的破坏速率值转换成YTX浓度。
发明的实施方案在22-37℃的温度下，在微量滴定板中实施该方法，且在360nm的激发波长和460nm的发射波长处测量荧光。
有四种类型的孔，且每一种孔都重复实验2次。
A孔用来计算cAMP浓度的孔。往其中加入5个浓度的邻氨基苯甲酰cAMP(荧光指示剂)，浓度范围为2-10μM。
B孔含有8μM荧光指示剂和酶的对照孔。
C孔含有8μM荧光指示剂、酶和已知浓度YTX的校正孔。
D孔含有8μM荧光指示剂、酶和任何鱼产品提取物样品的检测样品孔。
a.在所有孔中加入检测缓冲液(10mM Tris HCl+1mM CaCl2，pH7.4)使最终的温育体积为100μL。依据孔的类型加入相应量的邻氨基苯甲酰cAMP。第一次读数2分钟。
b.在B孔、C孔和D孔中加入2-5μg的PDEs，并再一次读数2分钟。
c.在C孔和D孔中加入已知浓度YTX或从鱼产品中获得的样品。加入的YTX浓度范围为0.1-10μM。依据2002年3月15日的决定2002/225/EEC或任何其他官方方法(D.O.G.A，1986)中确定的最高水平和不同鱼产品中某种海洋毒素的分析方法来获得提取物样品。
d.加入这些物质后，振荡所述板，进行15分钟的连续荧光测量，从而获取每分钟的数据。
e.用从A孔中获得的荧光数据对每一孔中的指示剂浓度作图，可获得回归系数大于0.999的线。
f.利用前面在邻氨基苯甲酰cAMP浓度方面的线将从其他孔中获得的在邻氨基苯甲酰cAMP浓度的荧光数据进行转换。从毒素加入时，即零时间的cAMP浓度和10分钟后的浓度可获得每单位时间被破坏的指示剂的量，也就是AMPc的破坏速率。
g.将B孔获得的破坏速率数据视为对照破坏速率。
h.将从C孔中获得的破坏速率对YTX浓度作图可获得YTX浓度标准线。在这条线上用从D孔中获得的破坏速率进行替换可确定所述样品中的YTX。
图4代表针对邻氨基苯甲酰cAMP浓度的荧光单位校正线。图5代表用于标准测定方法的cAMP破坏速率对YTX浓度的标准线。
用途3利用磷酸二酯酶作为YTX的治疗靶以及诱导激活磷酸二酯酶的化合物。
a.1.YTX作为肥大细胞和嗜碱性粒细胞的免疫学激活抑制剂的用途。
肥大细胞和嗜碱性粒细胞的免疫学激活需要临时增加cAMP。这种增加对细胞反应激活是必不可少的(Botana和MacGlashan，1994)。PDE激活消除了这种开始的cAMP峰，并因此能防止细胞激活。在YTX存在时，也就是激活的PDEs存在时，细胞反应将被抑制。所述抑制效应可用于抗变应性药或止喘药治疗策略中，所述变态反应和哮喘是肥大细胞起主要作用的两种病理状态(Metcalfe，Baram，D.等人，1997)。此处的用途描述了YTX对细胞激活的抑制的定量，所述细胞激活由在大鼠体内肥大细胞的免疫学刺激所诱导。可参照文献中描述的不同方案来确定细胞反应抑制。下面列出一种方案，在该方案中依据大鼠肥大细胞释放到细胞外基质中的组胺来对反应进行定量(Alfonso，Cabado，A.G.等人，2000；Estévez，Vieytes等人，1994)。
发明的实施方案a.在进行实验前15天致敏大鼠。将每只大鼠皮下注射含有150mg卵清蛋白和109个百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的1ml生理血清。
b.从致敏大鼠的胸和腹提取肥大细胞。将获得的两种群体混合得到细胞悬浮液。
c.将细胞悬浮液与各种浓度的YTX一起预温育10分钟，接着在5mg/ml的卵清蛋白存在时温育10分钟。
d.在低温条件下终止反应，并通过离心从细胞中残留的组胺中分离出释放的组胺。
e.移去含有释放到培养基中的组胺的上清液，并用盐酸和超声波切割细胞以使其释放对刺激作用不敏感的组胺。
f.用三氯乙酸去除两种培养基中的蛋白。
g.最后对组胺进行定量，从而通过在含有邻苯二醛(o-phthalic dialdehyde)的基础培养基中反应，将其转换成荧光分子。用盐酸终止反应，并在360nm激发处和460nm的发射处读出荧光。
图6显示几种浓度的YTX存在时，卵清蛋白诱导的组胺释放被抑制的百分比。
a.2.YTX作为赘生性细胞增殖抑制剂的用途。
赘生性细胞生长抑制是一个描述抗肿瘤活性的指标，广泛用于描述新药物的抗肿瘤特性。已经发现YTX对人肝细胞癌细胞具有细胞毒性，更进一步地，也已经描述这种毒素在成神经细胞瘤细胞中能诱导细胞凋亡(程序性细胞死亡)(Leira，Alvarez等人，2001)，这些都表明YTX容易被用作抗肿瘤药物。在此项用途中定量分析了YTX作为肝癌肿瘤细胞的细胞毒性药物的能力。可参照文献中描述的不同方案来确定细胞的生长抑制。下面列出这些方案中的一种，在该方案中通过结晶紫染色和接下来的乙酰化作用在HEP-G2细胞系中对反应进行定量。
发明的实施方案a.在微量滴定板上以10000个细胞/孔的密度接种HEP-G2细胞。用生长培养基在37℃和5％CO2的条件下温育细胞24小时。
b.加入不同浓度的YTX，在37℃和5％CO2的条件下温育48小时。
c.加入10μL 11％的戊二醛以固定细胞，并将其温育15分钟。用蒸馏水洗涤3-4次。
d.加入0.1％的结晶紫溶液，并振荡所述板15分钟。
e.通过用蒸馏水洗涤去除染料，接着进行干燥。
f.加入10％的乙酸，并维持振荡15分钟。
g.在595纳米处用分光光度计读出吸光度。
h.用这种方案发现10μM的YTX可以诱导大约82+/-1％的细胞生长抑制。
文献Alfonso，A.，Cabado，A.G.，Vieytes，M.R.and Botana，L.M，(2000).″Calcium-pHcrosstalks in rat mast cellscytosolic alkalinization，but not intracellular calcium release，is a sufficient signal for degranulation.″Br J Pharmacol 130(8)1809-1816.
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权利要求
1.一种检测鱼产品中虾夷扇贝毒素(YTXs)的定量方法，该方法基于所述毒素对细胞磷酸二酯酶的激活，以及这种激活的治疗应用；以及YTX和其化学类似物(YTXs)对磷酸二酯酶活性的激活作用在检测YTXs(或具有类似活性的化合物)的定量方法中的用途，或者作为以PDEs为治疗靶的策略的用途。
2.权利要求1所述的检测鱼产品中YTXs的方法，所述方法基于YTX对PDEs的激活，其特征在于使用与平面或基质支持表面结合的PDEs作为配体的亲和生物传感器，在所述传感器上加入作为受体起作用的YTXs，所述传感器在20-37℃的温度范围内通过渐消效应能产生可定量的分子相互作用，从而调节这种结合为准一级动力学，从所述动力学特征获得表观YTX-PDE结合速率(Rap)。
3.权利要求2所述的方法，其特征在于确定已知浓度的YTXs的表观结合速率并绘制校正线，在知道鱼产品提取物检测样品的表观结合速率时，利用校正线可计算出该样品的YTX浓度。
4.权利要求1所述的检测鱼产品中YTXs的方法，其特征在于利用类似的cAMP荧光底物通过PDE活性荧光来进行检测，并利用从已知浓度的YTX获得的荧光底物破坏速率制备出的校正线计算出鱼产品样品中的YTX浓度。
5.权利要求4所述的方法，其特征在于利用邻氨基苯甲酰cAMP作为底物通过PDE活性荧光来进行检测。
6.权利要求4所述的方法，其特征在于确定YTX结合PDEs时偏振的荧光强度的变化。
7.权利要求2、3或6所述的方法，其用于检测天然或合成的化学化合物中等同于YTX的活性(PDE激活)。
8.权利要求7所述的方法，其在HTS(高通量筛选)方案中利用PDEs活性。
9.权利要求1所述的用途，其为YTXs作为抗变应性药或止喘药化合物对肥大细胞的作用的用途。
10.权利要求1所述的用途，其为YTXs作为抗肿瘤化合物对赘生性细胞的作用的用途。
全文摘要
本发明涉及检测鱼产品中虾夷扇贝毒素的定量方法，该方法基于所述毒素对细胞磷酸二酯酶的激活以及这种激活的治疗有效性。虾夷扇贝毒素(YTX)和其类似物的细胞靶是激活磷酸二酯酶(PDEs)。PDEs－YTX结合产生可测量的信号。利用亲和生物传感器或荧光可以对这种结合进行定量。生物传感器能检测生物分子之间的相互作用，并使得可能利用YTX和PDEs的相互作用来确定YTX的存在。平板荧光使得可能确定荧光衍生物邻氨基苯甲酰cAMP的降解速率的变化。当YTX存在时，PDEs降解所述分子的速率增加。YTX抑制大鼠肥大细胞的免疫学激活，而且在人肝癌细胞中能诱导细胞毒性作用，这提供了YTX可作为抗变应性药和抗肿瘤化合物的两种治疗用途。
文档编号G01N21/64GK1852988SQ200480021338
公开日2006年10月25日 申请日期2004年7月21日 优先权日2003年7月25日
发明者L·M·博塔纳洛佩斯, A·阿方索兰卡尼奥, M·J·帕索斯古尔德里斯, M·罗德里格斯比埃特斯, M·I·罗萨加西亚, J·M·维埃特斯巴普蒂斯塔德索萨 申请人:圣地亚哥德·冈波忒拉大学