基于微间距阵列电极的免疫定量传感器、制作方法及检测食品中大肠杆菌o157：h7的方法

基于微间距阵列电极的免疫定量传感器、制作方法及检测食品中大肠杆菌o157：h7的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于微间距阵列电极的免疫定量传感器、制作方法及检测食品中大肠杆菌O157：H7的方法。传感器包括由叉指式双电极组成的微间距阵列电极，微间距阵列电极包括一对梳形微电极，每个梳形微电极均有多个叉指，一对梳形微电极上的多个叉指交叉排列；微间距阵列电极的正电极和负电极的梳形齿宽均为1-100μm，电极间隙为1-100μm，微间距阵列电极的表面固定有200μL的大肠杆菌O157：H7单克隆抗体；碱性磷酸酯酶标记的大肠杆菌O157：H7单克隆抗体在检测时加到微间隙阵列电极上，同被检样品中的大肠杆菌O157：H7及碱性磷酸酶标记的大肠杆菌O157：H7多克隆抗体发生免疫夹心反应。本发明能够用于食品中大肠杆菌O157：H7的快速、高效检测。
【专利说明】基于微间距阵列电极的免疫定量传感器、制作方法及检测食品中大肠杆菌0157:H7的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，更具体的说，特别涉及一种基于微间距阵列电极的免疫定量传感器、制作方法及检测食品中大肠杆菌0157:H7的方法。
【背景技术】
[0002]大肠杆菌0157:H7 (Escherichia coli 0157:H7)属于肠杆菌科埃希氏菌属，它是肠出血性大肠杆菌的主要血清型，通过食物传播能引起人的出血性肠炎、腹泻、溶血性尿毒症等症状，其显著特征是产生大量的类志贺氏毒素(Shiga-Like Toxin, SLT)，引起体内的微血管变化。随着我国城乡经济的发展与人民生活水平的提高，食品的数量与种类日益丰富，如何提高食品的质量与安全性的问题日益突出。在食品加工、贮存、运输、销售、直到食用的整个过程中，每一个环节都有可能受到生物污染，危害人体健康。按照美国亚特兰大疾病控制与预防中心的估计，在美国每年有650万人因食品中的细菌污染而中毒，有9000人因此丧生。其中，大肠杆菌是在污染食品中对人危害较大的一种细菌。它是婴儿腹泻的主要病原菌，有高度传染性，严重者可致死。1982年确认E.Coli0157:H7为肠出血性大肠杆菌(缩写为EHEC)，产生强毒素，造成肠出血，约有10%可发展成肾出血。主要症状是突发性腹痛，并危及肝肾。在小儿中常导致溶血性尿毒综合症，威胁生命。如何保证人们不会食用被细菌污染，尤其是对人体有害的细菌污染的食品显得至关重要，关系到人们的身体健康甚至社会的稳定。因此，食品工业急需一种快速简便的分析方法，以对食品中的微生物污染物，如大肠杆菌0157:H7进行检测。
[0003]现有大肠杆菌0157:H7检测技术大多采用常规检测方法:平板分离培养法、纸片法)；基于PCR的分子生物学方法；免疫学检测方法；酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫层析法(ICT)、免疫磁珠分离法(IMS)、落射荧光技术、固相荧光毛细管免疫分析技术等。被广泛应用的酶联免疫吸附法的检测限为0.lCFU/ml (CFU/g)。而我国目前现有检测方法标准有GB4789.3-2003、GB4789.3-2008、GB4789.3-2010等。常规的检测方法所需检测周期长、操作步骤繁琐、检测工作量大以及较难实现对样品进行及时有效的检测，具有应用推广困难的局限性。因此，建立一种简便、快速、高效和成本低廉的食源性致病菌检测手段，成为了目前食品安全事故现场快速检测的迫切需求。近年来，免疫学检测技术得到广泛地应用，酶联免疫吸附(ELISA)、胶体金免疫层析技术(GICA)、免疫磁珠分离法(IMS)和免疫传感器等是利用抗原抗体的特异性结合，并通过对抗体进行酶、荧光或放射性物质进行标记，从而放大免疫反应信号，因此其具有高度灵敏性和特异性的特点，在食源性致病菌检测方面得到了广泛应用。
[0004]免疫传感器开始应用于食源性致病菌的检测要追溯到上世纪70年代，是利用抗原抗体特异免疫反应与高灵敏传感器件相结合构成的一种生物传感器件，它具有制备简便、特异性好、操作快速、灵敏的特点，因此将免疫传感技术用于食品中大肠杆菌0157:H7的检测是当前一个新的发展方向。目前，国内外有食品中致病菌的免疫分析已有一些文献报告，但大多采用酶联免疫分析(ELISA)法测定。有关免疫传感技术的研究也有一定报道，如采用免疫磁珠捕获法结合经典PCR技术检测食品中的沙门氏菌、单增李斯特氏菌、大肠杆菌0157:H7、志贺氏菌等致病菌；但这些工作离实际应用仍有相当距离，因此，用微间距叉指阵列电极方法开展食品中大肠杆菌0157:H7高通量的快速分析检测是一项非常有意义的工作。

【发明内容】

[0005]本发明的目的在于提供一种能够对食品中大肠杆菌0157:H7的快速、高效的检测的基于微间距阵列电极的免疫定量传感器、制作方法及检测食品中大肠杆菌0157:H7的方法。
[0006]为了解决以上提出的问题，本发明采用的一个技术方案为:基于微间距阵列电极的免疫定量传感器，包括由叉指式双电极组成的微间距阵列电极，所述微间距阵列电极包括一对梳形微电极，每个梳形微电极均有多个叉指，所述一对梳形微电极上的多个叉指交叉排列，形成叉指形状；所述微间距阵列电极的正电极和负电极的梳形齿宽均为1-100 μ m,电极间隙为1-100μπι，且微间距阵列电极的表面固定有200yL的大肠杆菌0157:H7单克隆抗体，该大肠杆菌0157:H7单克隆抗体浓度为8 μ g/mL ;其中，碱性磷酸酯酶标记的大肠杆菌0157:H7单克隆抗体在检测时加到微间隙阵列电极上，同被检测样品中的大肠杆菌0157:H7及碱性磷酸酶标记的大肠杆菌0157:H7多克隆抗体发生免疫夹心反应。
[0007]根据本发明的一优选实施例:所述组成微间距阵列电极的叉指式双电极为16-96孔。
[0008]根据本发明的一优选实施例:所述每个叉指的长度为l_3mm，宽度为1_100 μ m。
[0009]本发明还提供一种基于微间距阵列电极的免疫定量传感器的制造方法，该方法包括:微间距阵列电极的制作步骤，以及在微间距阵列电极的表面固定有200 μ L的大肠杆菌0157:Η7单克隆抗体的步骤；
[0010]所述微间距阵列电极的制作步骤具体包括:
[0011]S1、采用光刻法在陶瓷片上形成具有正电极和负电极的一对梳形微电极，且每个梳形微电极均有多个叉指，所述一对梳形微电极上的多个叉指交叉排列，形成微间距叉指阵列电极；
[0012]S2、对所述微间距叉指阵列电极硅烷化处理；
[0013]所述在微间距阵列电极的表面固定有200 μ L的大肠杆菌0157:Η7单克隆抗体的步骤具体包括:
[0014]S3、将上述步骤S2中经硅烷化处理过的微间距叉指阵列电极浸入5%的戊二醛溶液中，在室温条件下活化I小时；
[0015]S4、将上述微间距叉指阵列电极用水淋洗干净，并用超纯水清洗三次后，在电极上滴加200 μ L大肠杆菌0157:Η7单克隆抗体；
[0016]S5、用PBS将上述步骤S3中制作的微间距叉指阵列电极清洗三次，将清洗后的电极的每孔加入浓度为1%的300 μ LBSA溶液中，在温度为37°C的环境下培育I小时，制成免
疫定量传感器，最后将免疫定量传感器保存于4°C备用。[0017]根据本发明的一优选实施例:所述步骤S2的具体包括以下步骤:
[0018]S21、将微间距叉指阵列电极在无水乙醇及丙酮中浸泡15min ；
[0019]S22、将微间距叉指阵列电极在piranha溶液中浸洗lOmin，IM的NaOH溶液中浸泡30min,并用水冲洗干净，晾干；
[0020]S23、将经步骤S22处理后的微间距叉指电极浸入含2.5%APTES、1%H20的无水乙醇中，在温度为4°C的条件下硅烷化24小时；
[0021]S24、硅烷化后的微间距叉指阵列电极用乙醇清洗干净，在氮气流下吹干并在温度为4°C的条件下老化I小时。
[0022]本发明还提供一种采用基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测食品中大肠杆菌0157:H7的方法，该方法具体包括以下步骤:
[0023]S10、分别取一系列不同浓度的大肠杆菌0157:H7样品溶液，将所述每一种浓度的大肠杆菌0157:H7菌悬液和作为阴性对照的沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和阪崎杆菌菌悬液、PBST分别加入到包埋有大肠杆菌0157:H7单克隆抗体的免疫定量传感器上，并在37 °C恒温箱中反应60min ；
[0024]S20、用PBS缓冲液洗脱三次后加入出血性大肠杆菌0157:H7多克隆抗体作为一抗，并在37°C恒温箱中反应60min后再用PBS洗脱三次，加入AP标记山羊抗兔IgG (H+L)作为二抗，并在37°C恒温箱中反应60min后再用PBS缓冲液洗脱三次；
[0025]S30、在免疫定量传感器的每孔中加入100 μ L AgN03,并在37°C恒温箱中避光反应15min后再用PBS缓冲液洗脱三次，
[0026]S40、将上述步骤的S30的免疫定量传感器的工作电极的正电极与电化学工作站(如:CHI760A电化学工作站)的工作电极连接，电化学工作站对电极与参比电极复合，再与免疫定量传感器工作电极的负电极连接，并采用线性扫描伏安法在O?50mV电位范围检测，记录免疫定量传感器电流随电位变化的响应曲线，得出电导值。
[0027]根据本发明的一优选实施例:在所述步骤SlO中，所述大肠杆菌0157:H7样品溶液的浓度为0.1 μ g/mL、10.0 μ g/mL或10000.0 μ g/mL，所述沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和阪崎杆菌菌悬液、PBST各为100 μ L0
[0028]与现有技术相比，本发明的有益效果在于:
[0029]1、本发明的基于微间距阵列电极的免疫定量传感器制备简单，成本低廉，可大批量低成本生产；
[0030]2、本发明的检测方法操作步骤简单，检测时间在3小时内，检测所需要的仪器可用一般的电阻量测装置；
[0031]3、本本发明的基于微间距阵列电极的免疫定量传感器特异性强、灵敏度高，可实现浓度为0.1ng/mL的食品中大肠杆菌0157:H7的检测，达到我国食品中大肠杆菌0157:H7的限量标准，且背景干扰小，可以对食品中大肠杆菌0157:H7进行快速筛查和检测；
[0032]4、检测温度适宜范围宽，在4°C _40°C都可使用，结果正常。
[0033]5、本发明可以方便的对食品样品中的大肠杆菌0157:H7进行检测，适合于卫生、质监、海关、家畜养殖场、食品企业等单位或个人对动物源性食品样品中的大肠杆菌0157:H7进行快速检测。【专利附图】

【附图说明】
[0034]图1为本发明的基于微间距阵列电极的免疫定量传感器的俯视结构示意图。
[0035]图2为本发明的基于微间距阵列电极的免疫定量传感器的制造方法流程图。
[0036]图3为本发明中的微间距叉指阵列电极硅烷化处理的方法流程图。
[0037]图4为本发明中的检测食品中大肠杆菌0157:H7的方法流程图。
[0038]图5为本发明的电化学电导值图；(其中，0157:H7菌电导率强，其他对照菌则具有很低的电导率)。
[0039]图6为本发明的大肠杆菌0157:H7浓度梯度电导图(浓度越高，其电导值越大)。
[0040]附图标记说明:1、正电极，2、负电极，3、叉指。
【具体实施方式】
[0041]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0042]一、基于微间距阵列电极的免疫定量传感器的制作过程如下:
[0043]1、微间距阵列电极的制作:
[0044]如图1?图3所示，本发明的传感器在陶瓷片(99.7%的Al2O3)上用光刻方法制作，具体步骤包括由叉指式双电极组成的微间距阵列电极，所述微间距阵列电极包括一对梳形微电极，每个梳形微电极均有多个叉指3，所述一对梳形微电极上的多个叉指3交叉排列，形成叉指形状。这些叉指3长3mm，宽1-100 μ m，相邻叉指尖3的间距也为1-100 μ m，在将生物分子固定到相邻电极之间的间隙里前，并且整个传感器的俯视图为圆形的，微间距叉指电极阵列需要按下述方法进行硅烷化处理，具体为:
[0045]I)微间距叉指电极在无水乙醇及丙酮中各浸泡15min，以除去电极表面可能存在的有机物；
[0046]2)在piranha溶液中浸洗lOmin, IM的NaOH溶液中浸泡30min,用水冲洗干净,晾干;
[0047]3)将经步骤2)处理后的微间距叉指电极浸入含2.5%APTES、1%H20的无水乙醇中，4 °C硅烷化24小时；
[0048]4)硅烷化后的电极用乙醇清洗干净，在氮气流下吹干并在4°C老化I小时。
[0049]2、在微间距阵列电极的表面固定有200 μ L的大肠杆菌0157:Η7单克隆抗体的步骤:
[0050]I)将经硅烷化处理过的微间距叉指电极浸入5%的戊二醛溶液中，室温条件下活化I小时；
[0051]2)用水淋洗干净，用超纯水清洗三次；在上述电极上滴加200 μ L大肠杆菌0157:Η7单克隆抗体(用50mmol/L碳酸盐缓冲液进行1:500稀释)，37°C I小时；单抗浓度为8 μ g/mL ；
[0052]3)用PBS清洗三次，清洗后的电极每孔加入300μ L1%BSA溶液中于37°C，培育I小时来封闭电极表面蛋白质的非特异性位点，包埋好抗体的微间距叉指电极保存于4°C备用，制成免疫定量传感器。
[0053]二、下面举例说明利用本发明的传感器对食品中0157:H7的检测过程，其过程参考图4所示。
[0054]1、阴性对照菌种的复苏:
[0055]将大肠杆菌0157:H7、沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和阪崎杆菌接种于营养肉汤培养基中，37°C培养12小时，分别划线接种于VRBA培养基、HE培养基、MYP培养基、BK培养基、CN培养基和阪崎杆菌显色培养基，37°C培养24h，挑取单个菌落37 °C分别培养于BHI，培养18h。
[0056]2、大肠杆菌0157:H7菌悬液的制备:
[0057]将上述培养后的菌悬液倒入离心管中，离心后倒掉上清液，并用无菌生理盐水冲洗后再次离心，倒掉上清液，重复两次，得到菌悬液。通过麦氏比浊管粗测大肠杆菌0157:H7的数目，然后进行系列稀释制成0.1 μ g/mL、10.0 μ g/mL、10000.0 μ g/mL浓度的菌悬液。滴到包埋有大肠杆菌0157:H7单克隆抗体的电化学免疫定量传感器的电极表面，从该电极获取与大肠杆菌0157:H7浓度相关的电导信号，记录变化值。结果表明，大肠杆菌0157:H7的浓度越高，其电导值越大，且只对大肠杆菌0157:H7菌悬液有明显变化，其余菌悬液均无明显电导值变化，说明本发明的传感器可以对大肠杆菌0157:H7进行快速、准确检测。
[0058]3、阴性样本的制备:
[0059]将沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和阪崎杆菌增菌后，制成菌悬液与PBST —起作为阴性对照，如图5、图6所示。
[0060]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.基于微间距阵列电极的免疫定量传感器，其特征在于:包括由叉指式双电极组成的微间距阵列电极，所述微间距阵列电极包括一对梳形微电极，每个梳形微电极均有多个叉指(3)，所述一对梳形微电极上的多个叉指(3)交叉排列，形成叉指形状；所述微间距阵列电极的正电极(I)和负电极(2)的梳形齿宽均为1-100μπι，电极间隙为1-100μπι，且微间距阵列电极的表面固定有200 μ L的大肠杆菌0157:Η7单克隆抗体，该大肠杆菌0157:Η7单克隆抗体浓度为8μ g/mL ;其中，碱性磷酸酯酶标记的大肠杆菌0157:H7单克隆抗体在检测时加到微间隙阵列电极上，同被检测样品中的大肠杆菌0157:H7及碱性磷酸酶标记的大肠杆菌0157:H7多克隆抗体发生免疫夹心反应。
2.根据权利要求1所述的基于微间距阵列电极的免疫定量传感器，其特征在于:所述组成微间距阵列电极的叉指式双电极为16-96孔。
3.根据权利要求1所述的基于微间距阵列电极的免疫定量传感器，其特征在于:所述每个叉指(3)的长度为l_3mm，宽度为1-100 μ m。
4.一种基于微间距阵列电极的免疫定量传感器的制造方法，其特征在于:该方法包括微间距阵列电极的制作步骤，以及在微间距阵列电极的表面固定有200 μ L的大肠杆菌0157:Η7单克隆抗体的步骤；所述微间距阵列电极的制作步骤具体包括: 51、采用光刻法在陶瓷片上形成具有正电极(I)和负电极(2)的一对梳形微电极，且每个梳形微电极均有多个叉指(3)，所述一对梳形微电极上的多个叉指(3)交叉排列，形成微间距叉指阵列电极； 52、对所述微间距叉指阵列电极硅烷化处理； 所述在微间距阵列电极的表面固定有200 μ L的大肠杆菌0157:Η7单克隆抗体的步骤具体包括: 53、将上述步骤S2中经硅烷化处理过的微间距叉指阵列电极浸入5%的戊二醛溶液中，在室温条件下活化I小时； 54、将上述微间距叉指阵列电极用水淋洗干净，并用超纯水清洗三次后，在电极上滴加200 μ L大肠杆菌0157:Η7单克隆抗体； 55、用PBS将上述步骤S3中制作的微间距叉指阵列电极清洗三次，将清洗后的电极的每孔加入浓度为1%的300 μ LBSA溶液中，在温度为37°C的环境下培育I小时，制成免疫定量传感器，最后将免疫定量传感器保存于4°C备用。
5.根据权利要求4所述的基于微间距阵列电极的免疫定量传感器的制造方法，其特征在于:所述步骤S2的具体包括以下步骤: 521、将微间距叉指阵列电极 在无水乙醇及丙酮中浸泡15min； 522、将微间距叉指阵列电极在Piranha溶液中浸洗IOmin，IM的NaOH溶液中浸泡30min,并用水冲洗干净，晾干； 523、将经步骤S22处理后的微间距叉指电极浸入含2.5%APTES、1%H20的无水乙醇中，在温度为4°C的条件下硅烷化24小时； 524、硅烷化后的微间距叉指阵列电极用乙醇清洗干净，在氮气流下吹干并在温度为4°C的条件下老化I小时。
6.一种采用基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测食品中大肠杆菌0157:H7的方法，其特征在于:该方法具体包括以下步骤:S10、分别取一系列不同浓度的大肠杆菌0157:H7样品溶液，将所述每一种浓度的大肠杆菌0157:H7菌悬液和作为阴性对照的沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和阪崎杆菌菌悬液、PBST分别加入到包埋有大肠杆菌0157:H7单克隆抗体的免疫定量传感器上，并在37 °C恒温箱中反应60min ； S20、用PBS缓冲液洗脱三次后加入出血性大肠杆菌0157:H7多克隆抗体作为一抗，并在37°C恒温箱中反应60min后再用PBS洗脱三次，加入AP标记山羊抗兔IgG (H+L)作为二抗，并在37°C恒温箱中反应60min后再用PBS缓冲液洗脱三次； S30、在免疫定量传感器的每孔中加入IOOyL AgN03，并在37°C恒温箱中避光反应15min后再用PBS缓冲液洗脱三次； S40、将上述步骤的S30的免疫定量传感器的工作电极的正电极(I)与电化学工作站的工作电极连接，电化学工作站对电极与参比电极复合，再与免疫定量传感器工作电极的负电极(2)连接，并采用线性扫描伏安法在0-50mV电位范围检测，记录免疫定量传感器电流随电位变化的响应曲线，得出电导值。
7.根据权利要求6所述的基于微间距阵列电极的免疫定量传感器检测食品中大肠杆菌0157:H7的方法，其特征在于: 在所述步骤SlO中，所述大肠杆菌0157:H7样品溶液的浓度为0.1 μ g/mL、10.0 μ g/mL或10000.0 μ g/mL，所述沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和阪崎杆菌菌悬液、PBST各为100 μ L0
【文档编号】G01N33/577GK103558389SQ201310547395
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】彭新凯, 李乐, 王淑娟, 彭瑞乾 申请人:彭新凯, 李乐