专利名称：用于相互作用分析的方法和系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及分析感测表面处的分子结合相互作用的方法，并且更具体地说，涉及 使用生物传感器来确定分析物与配位体之间的相互作用的一个或多个相互作用参数的方法。
背景技术：
能够实时地监视分子(例如，生物分子)之间的相互作用的分析传感器系统正得 到渐增的关注。这些系统往往基于光学生物传感器，且常常称为相互作用分析传感器或生 物特定相互作用分析传感器。代表性的此类生物传感器系统是Biacore AB (乌普萨拉，瑞 典)销售的BIAC0RE 仪器，其使用表面等离子共振(SPR)来检测样本中的分子与感测表面 上固定化的分子结构之间的相互作用。随着样本在传感器表面上方通过，结合的进度直接 地反映相互作用发生的速率。在注入样本之后是缓冲液流，在此期间检测器响应反映表面 上的复合物离解的速率。来自BIAC0RE 系统的典型输出是描述分子相互作用随时间的进 度、包括缔合阶段部分和离解阶段部分的曲线图或曲线。常常在计算机屏幕上显示的此结 合曲线往往称为“传感器谱图(sensorgram) ”。因此，利用BIAC0RE 系统(和模拟传感器系统)，在未使用标记以及往往没有对所 包含的物质进行纯化的情况下，不仅可能实时地确定样本中具体分子(分析物)的存在和 浓度，而且可能实时地确定附加相互作用参数，包括分子相互作用中结合(缔合)和离解的 动力学速率常数以及表面相互作用的亲和度。缔合速率常数GO和离解速率常数(kd)可 以通过将对多种不同样本分析物浓度得到的结果动力学数据拟合到微分方程形式的相互 作用模型的数学描述来获得。可以由缔合速率常数和离解速率常数来计算亲和度(表示为 亲和度常数ka或离解常数kd)。但是，许多时候，可能难以获得明确的动力学数据，并且因 此往往通过平衡结合分析来测量亲和度更为可靠，这包括对一系列分析物浓度确定平衡或 稳态处的结合水平，平衡或稳态假定处于或接近结合相互作用的缔合阶段的结束。为了确 保结合曲线的缔合阶段确实可能已经达到稳态，往往预先确定在为用于亲和度测量预设的 条件下已结合的分析物达到平衡的必要样本注入时间长度(即，与传感器芯片表面的样本 接触时间)。因为达到平衡所花的时间和分析物离解所花的时间都主要通过离解速率常数 来控制，所以还可以由离解常数估计近似注入时间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新方法和生物传感器系统，用于使用生物传感器确定 分析物与配位体之间的相互作用的一个或多个相互作用参数，该方法和生物传感器系统克 服了现有技术的一个或多个缺点。这通过独立权利要求中定义的方法和生物传感器系统来 实现。本发明的方法的一个优点在于，它允许对低亲和度分析物进行改进且更可靠的相 互作用参数的确定。
通过参考下文详细描述和附图将获得对本发明及其进一步特征和优点的更全面 的理解。
图1是基于SPR的生物传感器系统的侧视示意图。图2是其中结合曲线具有可见的缔合阶段和离解阶段的代表性传感器谱图。图3示出“正常”亲和度分析物曲线拟合的示例。图4示出基于图3的数据点的较低范围的、“低”亲和度分析物曲线拟合的示例。图5示出根据本发明的一个实施例的方法的示意框图。图6示出如图4中的对应拟合。图7a_7c示出具有多种水平的方法噪声的模拟数据集的拟合。图8a_8b示出具有二次非常低亲和度(非特定)结合的模拟数据集的拟合。图9不出注入之后具有抬闻的基线的响应曲线的不例。图10示出显示注入期间渐增的响应的响应曲线的示例。
具体实施例方式如上文提到的，本发明涉及评估第一物种与第二物种之间的分子结合相互作用的 稳态结合数据以确定该相互作用的亲和度，其中使用第一与第三控制物种之间的结合相互 作用的稳态结合数据来估计第一物种与第二物种之间的相互作用的最大响应R_。通常，通 过基于传感器的技术获得试验结合数据，该技术研究分子相互作用并实时地将结果呈示为 相互作用进度。但是，在更详细地描述本发明之前，将描述预设要使用本发明于其中的一般 上下文。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明相关领域中的 技术人员所共识的相同的含义。再有，除非另外说明，否则单数形式“一”和“该”意味着包 括复数个的引述。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考书目通过引用全部并入。如上文提到的，本发明涉及由分子结合相互作用的多个数据集评估该相互作用的 稳态结合数据以确定该相互作用的一个或多个相互作用参数，其中使用来自数据集的稳态 结合数据以外的其他相互作用数据来估计该数据集的稳态结合数据的可靠性。通常，通过 基于传感器的数据获得试验结合数据，该试验结合数据研究分子相互作用并实时地将结果 呈示为相互作用进度。但是，在更详细地描述本发明之前，将描述预设要使用本发明于其中 的一般上下文。化学传感器或生物传感器通常基于非标记技术，检测传感器表面的属性的变化， 例如质量、折射率或固定化层的厚度，但是也有传感器依赖于某种类型的标记。典型的传感 器检测技术包括但不限于，质量检测方法，如光学，热光和压电或声波方法(包括，例如表 面声波(SAW)和石英晶体微天平(QCM)方法)；以及电化学方法，如电位测量、电导测量、电 流测量和电容/阻抗方法。就光检测方法来说，代表性的方法包括检测质量表面浓度的那 些方法，如反射型光学方法，包括外部和内部反射型方法，它们是角度、波长、偏振或相位分 辨的，例如瞬逝波椭圆偏振法和瞬逝波光谱法(EWS或内部反射型光谱法)，二者均可以包CN 102667448 A说明书2/10 页 通过参考下文详细描述和附图将获得对本发明及其进一步特征和优点的更全面 的理解。括经由表面等离子共振(SPR)的瞬逝场增强、布鲁斯特角折射仪、临界角测折射率法、受抑 全反射(FTR)、散射的全内反射(STIR)(其可以包括散射增强标记)、光波导传感器；外部反 射成像、基于瞬逝波的成像(如临界角分辨的成像)、布鲁斯特角分辨的成像、SPR角分辨的 成像等。再者，可以提到“本身的”或与反射型方法组合的测光和成像/显微镜检查方法， 其基于例如，表面增强的拉曼光谱法(SERS)、表面增强的谐振拉曼光谱法(SERRS)、瞬逝波 荧光(TIRF)和磷光法，以及波导干涉仪、波导泄漏模光谱法、反射干涉光谱法(RIfS)、透射 干涉测量法、全息光谱法和原子力显微镜检查法(AFR)。可商业购得的生物传感器包括前文提到的Biacore AB(乌普萨拉，瑞典)销售的 BIAC0RE 仪器，其基于表面等离子共振(SPR)并允许实时地监视结合的配位体与关注的分 析物之间的表面结合相互作用。在此上下文中，“配位体”是对于给定分析物具有已知或未 知亲和度的分子，且包括固定化在表面上的任何捕获或捕捉试剂，而“分析物”包括其任何 特定结合的配对物。虽然下文的详细描述和示例是在SPR光谱法以及更具体为BIACORE 系统的上下 文中说明本发明的，但是要理解，本发明并不局限于此检测方法。更确切地，可以采用其中 分析物结合到固定化在感测表面上的配位体的任何基于亲和度的检测方法，只要感测表面 处的变化能够被测量，该变化是分析物到其上固定化的配位体的结合的量化指示即可。SPR的现象是众所周知的，足以说当在某些条件下光在不同折射率的两种介质之 间的介面反射时出现SPR，并且该介面涂覆以金属膜(通常为银或金)。在BIACORE 仪器 中，该介质是样本和通过微流控流系统与样本接触的传感器芯片的玻璃。该金属膜是芯片 表面上的薄金层。SPR导致特定反射角处反射的光的强度降低。最小反射光强度的此角度 随靠近与反射光相反一侧(在BIACORE 系统中为样本侧)表面的折射率而变化。图1中示出BIACORE 系统的示意图。传感器芯片1具有金膜2支撑捕获分子(配 位体)3，例如抗体，捕获分子(配位体)3暴露于经由流通道5的含有分析物4 (例如，抗原) 的样本流。来自光源7 (LED)的单色p-偏振光6通过棱镜8耦合到玻璃/金属介面9，在玻 璃/金属介面9中光被完全反射。由光检测单元11 (光检测器阵列)来检测反射光束10 的强度。BIACORE 仪器的技术方面以及SPR现象的详细论述可以参见美国专利号 5，313，264。有关生物传感器感测表面的基质涂层的更详细信息在例如美国专利号 5，242，828和5，436，161中给出。此外，与BIACORE 仪器结合使用的生物传感器芯片的技 术方面的详细论述可以参见美国专利号5，492，840。当样本中的分子结合到传感器芯片表面上的捕获分子时，表面处的浓度改变， 并且由此表面处的折射率改变，并且检测到SPR响应。绘制相互作用过程期间响应对时 间的曲线图将提供相互作用的进度的量化测量。此类绘图或动力学或结合曲线(结合 等温线)常常称为传感器谱图，有时在本领域中也称为“亲和度轨迹”或“亲和度谱图 (affinogram) ”。在BIACORE 系统中，以共振单位表示SPR响应值。一个RU表示最小反射 光强度的角度中0.0001°的变化，对于大多数蛋白质和其他生物分子，这对应于传感器表 面上约1 pg/mm2的浓度变化。当包含分析物的样本接触传感器表面时，在称为“缔合”的步 骤中，结合到传感器表面的捕获分子(配位体)与分析物相互作用。此步骤在传感器谱图 上由样本最初接触到传感器表面时RU的增加指示。相反，“离解”通常发生在样本流被例如缓冲液流置换时。此步骤在传感器谱图上由分析物从表面结合的配位体离解时随时间推移 RU下降来指示。图2中呈示传感器芯片表面处可逆相互作用的代表性传感器谱图(结合曲线)，该 感测表面具有固定化的捕获分子或配位体，例如抗体，其与样本中的结合配对物或分析物 相互作用。生物传感器系统基于上文提到的其他检测原理产生的结合曲线将具有相似的外 观。垂直轴(y轴)指示响应(此处以共振单位RU计)，而水平轴(x轴)指示时间(此处 以秒计)。最初，缓冲液通过感测表面上方，这得到传感器谱图中的基线响应A。在样本注 入期间，由于分析物的结合，观察到信号增加。结合曲线的此部分B常常称为“缔合阶段”。 最后，处于或接近缔合阶段结束处达到稳态条件，其中共振信号在C处平稳(但是可能不总 是达到此状态)。要注意，本文的术语“稳态”与术语“平衡”作为同义词来使用(在其他上 下文中，术语“平衡”可能被保留来描述理想相互作用模型，因为实践中结合可以随时间推 移而恒定，即使系统未处于平衡中)。在样本注入结束时，以持续的缓冲液流置换样本，信号 的下降反映分析物从表面离解或释放。结合曲线的此部分D常常称为“离解阶段”。通过再 生步骤结束此分析，在再生步骤中，在传感器表面上注入能够从表面移除结合的分析物的 溶液，同时(理想地)保持配位体的活性。这在传感器谱图的部分E中指示。缓冲液的注 入恢复基线A，并且现在表面已为新的分析准备就绪。从缔合阶段B和离解阶段D的外形，分别获得有关结合和离解动力学的信息，并且 C处的共振信号的高度表示亲和度(由相互作用得到的响应与表面上质量浓度的变化相关 联)。下文将对此作更详细的解释。表面结合速率
假定分析物A与表面结合(固定化)的捕获分子或配位体B之间的可逆反应，这不是 扩散或质量转移受限的，并且遵循准一阶动力学
权利要求
1.ー种使用生物传感器来确定分析物与配位体之间的相互作用的ー个或多个相互作用參数的方法，所述方法包括如下步骤 A :提供将所述配位体与之固定化的传感器表面， B :将所述传感器表面与控制分析物接触， C :根据所述控制分析物至所述配位体的结合位点的结合登记所述传感器响应， D :确定所述控制分析物与所述配位体之间的所述相互作用的控制饱和响应(Rmax。)， E :使用所述分析物与所述控制分析物的相对摩尔响应贡献将所述控制饱和响应(Rmaxc)转换到分析物饱和响应(RmaxA) F :将所述传感器表面与包含不同浓度的所述分析物的一个或多个样本接触， G :根据所述分析物至所述结合位点的结合登记所述传感器响应，以及H:使用所述分析物饱和响应(RmaxA)将所登记的传感器响应拟合到预定相互作用模型以确定所述相互作用參数。
2.如权利要求I所述的方法，其中，以使之能够占据所有结合位点的浓度提供所述控制分析物，从而根据ー个相互作用事件提供所述控制饱和响应(Rmaxe)的直接确定。
3.如权利要求I所述的方法，其中，根据所述控制分析物与所述配位体之间的非稳态相互作用确定所述控制饱和响应(Rmaxc)。
4.如权利要求I至3中任一项所述的方法，其中，通过所述分析物与所述控制分析物之间的摩尔量比来逼近步骤E中所述分析物和所述控制分析物的所述相对摩尔响应贡献。
5.如权利要求I至4中任一项所述的方法，其中，对多个分析物重复步骤E至H。
6.如权利要求5所述的方法，其中，在对预定数量的分析物执行步骤E至H之后，重复步骤B至D。
7.如权利要求I至6中任一项所述的方法，其包括如下步骤 1 :从根据所述分析物的不同浓度下登记的传感器响应进行全局确定Rmaxeltjbal以及使用控制分析物和关联的Rmaxe进行确定RmaxA中选择用于确定每个分析物的Rmax的方法； J :通过选自如下集合的一个或多个结合行为准则来评估所述分析物-配位体相互作用的结合行为 a)高登记的R b)注入之后抬闻的基线 c)注入期间渐增的响应d)RmaxGlobal与RmaxA之间的比率 K :基于步骤J中的评估，建议用于计算每种分析物的所述相互作用參数的结合模型。
8.ー种用于检测分子结合相互作用的分析系统，包括 (i)生物传感器，其包括至少ー个感测表面、用于检测所述至少一个感测表面处分子结合相互作用的检测部件、以及用于产生表示结合曲线的检测数据的部件，其中每个曲线表示结合相互作用随时间推移的进度，以及 (ii)用于按权利要求I至7中任一项中定义的执行如权利要求I所述的步骤A至H的数据处理部件。
9.ー种包括程序代码部件的计算机程序，在所述程序在计算机上运行吋，所述程序代码部件用于根据权利要求I至7中任ー项来确定分析物与配位体之间的相互作用的ー个或多个相 互作用參数。
全文摘要
一种使用生物传感器来确定分析物与配位体之间的相互作用的一个或多个相互作用参数的方法，方法包括如下步骤A提供将配位体与之固定化的传感器表面，B将传感器表面与控制分析物接触，C根据控制分析物至配位体的结合位点的结合登记传感器响应，D确定控制分析物与配位体之间的相互作用的控制饱和响应(RmaxC)，E使用分析物与控制分析物的相对摩尔响应贡献将控制饱和响应(RmaxC)转换到分析物饱和响应(RmaxA)。F将传感器表面与包含不同浓度的分析物的一个或多个样本接触，G根据分析物至结合位点的结合登记传感器响应，以及H使用分析物饱和响应(RmaxA)将登记的传感器响应拟合到预定相互作用模型以确定相互作用参数。
文档编号G01N33/53GK102667448SQ201080053950
公开日2012年9月12日 申请日期2010年11月29日 优先权日2009年11月30日
发明者O.卡尔森 申请人:通用电气健康护理生物科学股份公司