专利名称：一种生物分子的固定方法
技术领域：
本发明涉及一种生物传感器识别元件的制备方法，特别是涉及一种生物分子的固
定方法。
背景技术：
生物传感器是利用生物物质(如酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原、生物膜、微生物、细 胞等)作为识别元件，将生化反应转变成可定量的物理、化学信号，从而能够进行生命物质 和化学物质检测和监控的装置。生物传感器对生物物质敏感，它以生物活性单元(如酶、抗体、核酸、细胞等)作为 生物敏感单元，对目标待测物具有高度选择性。其识别元件通常是固定在基底材料上的固 定化生物分子(生物敏感材料，包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物 质)。为了研制价格低廉、灵敏度高、选择性好和寿命长的生物传感器，固定化技术已成为世 界各国竞相研究和探索的目标。目前，固定生物分子(生物活性单元)的方法主要有吸附法、 交联法、共价键合法、包埋法、组合法等。但吸附法不稳定，组合法重现性较差，共价键合法 操作过程比较复杂，交联法戊二醛的量难以控制，这些固定方法难以让基底物质以均一、稳 定、单层分散的形式存在在电极等表面，从而也难以让生物分子在修饰电极上形成单层有 序的排列。近年来利用液液界面法来合成高度单分散的功能纳米结构或二维纳米结构组装 体引起了一些研究者的兴趣与关注。例如，第三世界科学院院长C. N. R. Rao研究小组将 含有Au (PPh3) Cl的甲苯溶液与NaOH的水溶液混合后，慢慢加入四羟甲基氯化磷(THPC) 溶液作为还原剂，得到了高质量的Au纳米薄膜。与其它合成方法相比，液液界面法不需要 昂贵的仪器和设备，操作简单安全，在普通的化学实验室即可进行。最重要的是，利用该方 法不仅可以合成高度单分散的功能纳米材料，而且通过控制反应参数还可使其在界面上 原位组装得到高度有序的、大面积的纳米薄膜或超晶格膜(Superlattice membrane),将所 得纳米薄膜有效转移到固体基底或电极上，有利于构建纳米基电子装置和传感器件。
发明内容
为了解决现有的生物分子固定化技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种 简便、新颖、独特的生物分子的固定方法，通过形成生物分子-金属复合单分散膜，生物分 子在基底材料上定向排列形成单层有序的固定。本发明直接用液液界面方法来合成金属纳米材料，然后在水相中将生物分子通过 键合作用固定到液液界面上，从而得到生物分子-金属纳米复合材料。通过Iangmuir技术， 或直接用固体基底(如导电玻璃)可以很容易地提取在液液界面上形成的薄膜。本发明采用的技术方案是，一种生物分子的固定方法，包括以下步骤
(1)、液液界面法制备纳米金属粒子；
(2)、在液液界面上生物分子与纳米金属发生键合作用，在界面上形成生物分子-金属
3复合单分散膜；
(3)、通过Iangmuir技术，或直接用固体基底提取液液界面上的生物分子-金属复合单 分散膜。所述的纳米金属粒子包括液液界面法合成的纳米金属，如Au、Ag、Pd等。在液液 界面合成法中，常用的两相(非极性相一极性相)体系包括甲苯-水、苯-水、氯仿-水、环己 烷-水、十八碳烯-甘油和石蜡-甘油等。添加合适的表面活性剂可使纳米材料在界面上 有序的排列并稳定在界面上，常用的表面活性剂有十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、四辛基 溴化胺(TOAB)、双十八烷基二甲基氯化铵(DODA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等。在制备纳米 金属时，常用的还原剂有水合胼、抗坏血酸、柠檬酸钠、THPC等。实施例中采用的纳米金，可按下述方法由液液界面法制得将氯金酸与三苯基磷 (摩尔比为1:1)超声混合并溶解于甲苯中形成有机相，再将氢氧化钠与十六烷基三甲基溴 化铵分别溶于二次蒸馏水中形成水相，待两相分别稳定后将有机相加入到水相形成液液界 面，待稳定后向水相中加还原剂水合胼。待反应结束后即可在液液界面上得到单层的金纳 米粒子。将含有特殊官能团的生物分子与纳米金属发生相互作用，可在界面上形成生 物-金属复合单分散膜。所述的生物分子包括含有特定官能团如-SH，-S-S-, -C00H, -NH2 等的目标生物大分子，如辣根过氧化物酶(HRP)，血红蛋白(Hb)，肌红蛋白(Mb)，抗原，抗 体，DNA等。如HRP可以制成纳米金与HRP复合膜，方法是向制备好金纳米粒子的水相中加 入HRP，然后将其放置在4 0C条件下M小时，在此过程中，HRP被吸附到界面上并且形成单 层有序的阵列进而形成了金与HRP的复合纳米材料。设计适当的液液界面反应体系，选择合适的反应原料，可控合成金属纳米粒子 (如=Au, Ag，Pd等)薄膜后，注入含特定官能团(如-SH，-S-S-，-C00H, -NH2等)的目标生 物大分子，使之组装到金属纳米粒子薄膜上，将得到生物分子一金属纳米粒子复合薄膜。采 用液液界面自组装成膜然后转移至电极等固体基底上，金属纳米粒子高度有序排列，其密 度和粒子间距可通过调节合成参数加以控制；生物活性分子可在高度密集的金属纳米粒子 薄膜上定向富集。除了生物分子与金属纳米粒子间配位作用的驱动外，生物分子自身之间 的静电相互作用、氢键、η - η堆积(stacking)以及亲疏水相互作用都将驱使生物分子在 界面上高度取向排列，有利于协同和集合性质的体现。液液界面上的生物分子-金属复合单分散膜可以采用Iangmuir技术来提拉，或直 接用固体基底(如导电玻璃)也可以很容易地提取在液液界面上形成的薄膜。本发明提供了一种生物分子的固定方法，通过液液界面法制备纳米金属粒子，将 生物分子在液液界面上与纳米金属键合并固定，形成生物-金属复合单分散膜。由于液液 界面法合成的纳米材料能够单层、有序的分散，使得生物分子也能有序地固定，所以用本发 明方法构建的生物传感器检测的灵敏度大大提高，同时达到简便、快速、稳定地固定生物分 子的目的。本发明方法具有反应迅速、条件温和，工艺简单，产率高，生物分子定向排列和重 现性好等特点。更具体地说，本发明的效果有
1.液液界面法合成纳米材料通常只需一个合成过程，不需要复杂的后期处理过程；
2.液液界面可以很好的让反应生成的纳米粒子形成有序的单层膜；
43、液液界面为生物分子有序的自组装提供一个良好的环境；
4.液液界面法合成的单层有序的纳米粒子薄膜可以使生物分子被有序的固定从而制 备生物传感器。下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。本发明的保护范围并不以具体实施 方式为限，而是由权利要求加以限定。
图1为本发明所用液液界面法合成金纳米粒子的实验装置图2为本发明所用液液界面法合成HRP-金纳米复合膜的扫描电镜图。
具体实施例方式实施例1辣根过氧化物酶(HRP)的固定方法 (1)、制备纳米级金
超声条件下将AuCl3. HCl. 4H20(2. 49 mg，6. 05 mmoL)与三苯基磷(1. 6 mg, 6. 05 mmoL) 混合，混合后加甲苯(5 mL)超声下分散溶解得有机相A; CTAB (0.8 mg, 2. 2 mmoL)加8 mL 二次蒸馏水，溶解后，加入NaO!K2 mg，50 mmoL)完全溶解得水相B ；将有机相A缓慢倒入 水相B中，待其稳定后，向水相B中加入还原剂水合胼(25 mg, 515 mmoL ),反应立即发 生，将其在30°C条件下放置M小时后界面有明显的紫黑色物质生成即纳米金，如图1所示。(2)、金与HRP复合膜的制备
HRP (1.5 mg)溶于ImL PBS(pH 7. 0)中，然后将其加入到制备好的纳米金的水相中， 放置在4 0C条件下M小时，在此过程中，HRP通过金与二硫键的结合被吸附到界面上并且 形成单层有序的阵列进而形成了金与HRP的复合膜，其扫描电镜图如图2所示。(3)、生物分子-金属复合膜提取
用预处理好的ITO电极(纳米铟锡金属氧化物)来提取上述制好的复合膜，将其置于室 温条件下干燥，待其干燥好后，在电极上滴涂5 μ 壳聚糖，晾干，老化。实施例2 DNA的固定方法 (1)、制备纳米级银
将溶有(PPh3) 4C12的甲苯溶液作为有机相，碱性溶液作为水相，将有机相加入到水 相，待两相稳定后将四羟甲基氯化磷(THPC)溶液用注射器注入到水层，静置一段时间，便可 在液液界面上得到纳米银。具体方法参见文献(C. N. R. Rao, G. U. Kulkarni, Ved Varun Agrawal, Ujjal K. Gautam, Moumita Ghosh, Usha Tumkurkar. Use of the liquid -liquid interface for generating ultrathin nanocrystalline films of metals, chalcogenides, and oxides. Journal of Colloid and Interface Science 289 (2005) 305 - 318)。(2)、银与DNA复合膜的制备
DNA溶于PBS中，然后将其加入到制备好的纳米银的水相中，放置，在此过程中，DNA与 银结合被吸附到界面上并且形成单层有序的阵列进而形成了银与DNA的复合膜。(3)、生物分子-金属复合膜提取
用预处理好的ITO电极(纳米铟锡金属氧化物)来提取上述制好的复合膜，将其置于室温条件下干燥，待其干燥好后，在电极上滴涂5 μ 壳聚糖，晾干，老化。
权利要求
1.一种生物分子的固定方法，包括以下步骤(1)、液液界面法制备纳米金属粒子；(2)、在液液界面上生物分子与纳米金属发生键合作用，在界面上形成生物分子-金属 复合单分散膜；(3)、通过Iangmuir技术，或直接用固体基底提取液液界面上的生物分子-金属复合单 分散膜。
2.根据权利要求1所述的生物分子的固定方法，其特征在于所述的纳米金属包括Au、 Ag 和 Pd。
3.根据权利要求2所述的生物分子的固定方法，其特征在于所述的纳米金属为纳米金。
4.根据权利要求3所述的生物分子的固定方法，其特征在于所述的液液界面法制备 纳米金的方法是，将氯金酸与三苯基磷按摩尔比为1:1超声混合并溶解于甲苯中形成有机 相，再将氢氧化钠与十六烷基三甲基溴化铵分别溶于二次蒸馏水中形成水相，将有机相加 入到水相形成液液界面，待稳定后向水相中加还原剂水合胼；反应结束后在液液界面上得 到单层的金纳米粒子。
5.根据权利要求1所述的生物分子的固定方法，其特征在于所述的生物分子含有官能 团-SH、-S-S-、-COOH 或-NH2。
6.根据权利要求5所述的生物分子的固定方法，其特征在于所述的生物分子包括辣根 过氧化物酶、血红蛋白、肌红蛋白、抗原、抗体或DNA。
7.根据权利要求6所述的生物分子的固定方法，其特征在于所述的生物分子为辣根过 氧化物酶。
8.根据权利要求7所述的生物分子的固定方法，其特征在于所述的辣根过氧化物酶制 成与纳米金的复合膜，方法是向制备好金纳米粒子的水相中加入辣根过氧化物酶，然后将 其放置在4 0C条件下M小时，辣根过氧化物酶被吸附到界面上并且形成单层有序的阵列， 制得纳米金与辣根过氧化物酶的复合膜。
全文摘要
本发明提出一种简单、新颖的生物分子的固定方法，先用液液界面法合成金属纳米材料，然后将生物分子加到水相中通过键合作用固定到液液界面上，得到金属纳米材料与生物分子的复合膜，最后采用langmuir技术，或直接用固体基底提取液液界面上的生物分子-金属复合单分散膜。本发明方法固定生物分子形成的生物分子-金属纳米复合材料制备过程简单，具有生物分子单层有序分散、稳定性好的特点。
文档编号B01D67/00GK102091541SQ20101058819
公开日2011年6月15日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者刘倩, 包建春, 戴志晖, 韩敏 申请人:南京师范大学