一种检测生物分子的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种方法，该方法可以检测在生物材料中的生物分子，属于生物分子检测技术领域。
【背景技术】
[0002]生物分子，更具体地来自少量的生物材料的蛋白和/或肽的特异性检测，是用于研宄和医疗诊断的重要要求。
[0003]作为生命活动的基本分子和遗传信息的载体，生物分子的检测一直是人们关注的重要课题之一，如何实现生物分子简单、快速、高灵敏度和特异性检测，对于疾病的诊断与治疗、环境监测、公共安全甚至防恐等都具有非常重要的意义。
[0004]就核酸分子而言，按其检测原理一般可以分为两类:一类是基于聚合酶链式反应(PCR)的各种指数扩增技术；另一类则是基于核酸分子杂交互补原理，通过杂交反应固定靶分子进行检测。PCR技术能对靶序列进行扩增，提高检测灵敏度，但由于酶的储存运输要求严格，并且通常需要专业人员操作，操作繁琐，耗时较长，价格相对昂贵，自动化存在困难；如果采用杂交的方法，由于对靶序列没有前期的扩增，相对的检测灵敏度远不如PCR的检测方法，但操作比较简单，易于满足复杂场地的检测需要。而蛋白质分子与核酸分子不同，它不能通过扩增技术使目的蛋白分子数目增加，只能采用酶联免疫吸附法(ELISA)等方法直接测定，因此，检测灵敏度受到极大限制，且检测过程繁琐，检测时间较长。
[0005]微浓缩技术是使液滴在一疏水表面自然蒸发，通过液滴收缩作用，提高液滴中溶质分子检测灵敏度的方法。Nordhoff等(Ana Chem, 2000, 72，3436-3442)通过微加工技术在疏水性聚四氟乙烯表面制备直径200pm、间隔2.25mm的纳米金亲水阵列，然后将待测样品溶液滴在表面上，随着溶剂的蒸发，溶质生物分子将自动浓缩于亲水性纳米金位点，形成直径为200um的液斑，用免疫沉淀及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行检测，可显著提高检测灵敏度，对于MALD1-MS而言，一般情况下，对80bp的DNA分子，其检测灵敏度约为50fM，而经过微浓缩后其检测灵敏度可提尚到5fM左右。
[0006]但是目前使用的方法在检测的时候存在灵敏度不高的缺陷，因此急需提供一种新的检测生物分子的方法。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是克服现有技术存在的不足，提供一种检测生物分子的方法，可以有效提尚检测的灵敏度。
[0008]为了实现上述目的，本发明的技术方案为:
一种检测生物分子的方法，首先使目的生物分子与磁珠探针结合，实现目的生物分子的初步富集，然后选择DNA/RNA变性溶液或免疫分离溶液，使目的生物分子与磁珠探针分离，再将目的生物分子溶液滴于疏水表面上，通过微浓缩作用，使目的生物分子液滴自然蒸发形成直径为45?400um的斑点，用荧光显微镜或芯片扫描仪对斑点进行检测，具体包括以下步骤:
A.先使磁珠与探针生物分子结合，形成磁珠探针；将一端共价结合有荧光分子的生物分子溶液与磁珠探针混合，使目的生物分子与磁珠探针结合；
B.分离磁珠，梯度洗涤，磁分离，加DNA/RNA变性溶液或免疫分离溶液使目的生物分子与磁珠探针分离；
C.用磁分离器处理步骤2)得到的目的生物分子溶液，取上清液I?SuL滴于疏水表面上进行浓缩，使液滴自然蒸发，蒸干后浓缩斑点直径在45?400um之间；
D.采用荧光显微镜或芯片扫描仪对浓缩斑点进行检测。
[0009]优选的，所述磁珠探针是指通过1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、戊二醛、二硫键或链霉亲和素-生物素将探针生物分子与磁珠共价结合，形成可与目的生物分子结合的磁珠探针；所述磁珠颗粒直径在0.4?8um，磁珠表面有羧基、氨基、轻基、巯基、甲苯磺酰基、链霉亲和素或生物素包被。
[0010]更优选的，所述疏水表面是指经十七氟癸基三甲氧基硅烷、十八烷基三甲氧基硅烷、碳氟聚合物或聚四氟乙烯修饰的玻片、硅片、石英。
[0011 ] 进一步的，所述生物分子是经过修饰的。
[0012]更进一步的，所述生物分子为DNA、RNA、酶、抗原或抗体。
[0013]与现有技术相比，本发明的有益效果至少在于:
⑴本发明通过磁珠富集和微浓缩效应使检测灵敏度提高到1.6?160aM(而通常情况下荧光分析的检测灵敏度为I?1fM),大大提高了检测灵敏度；
⑵适用范围广，不仅适用于DNA、RNA等核酸分子的检测，而且还适用于抗原-抗体免疫检测及酶-底物反应等相关检测；
⑶磁珠探针和疏水表面制备简单，易于存储，且可批量制备，使检测成本显著降低；检测迅速，整个检测过程可在I小时内完成；
⑷该检测方法简单易行，操作简便，特异性和灵敏度高，且易于自动化，应用前景好。
【具体实施方式】
[0014]本发明提供一种用于检测生物分子(DNA、RNA、酶、抗原及抗体等)的方法，首先使磁珠与探针生物分子(单链DNA、酶、抗原或抗体等)结合，形成磁珠探针，再与溶液中标记有荧光基团的目的生物分子进行杂交，利用磁珠实现目的分子的初步富集；然后通过DNA/RNA变性溶液或免疫分离溶液使磁珠探针与目的分子分离，再将目的分子溶液滴于疏水表面上，通过微浓缩作用，目的生物分子溶液蒸发形成直径45?400pm的斑点，使目标分子的最终浓度较初始浓度提高103?105倍，用荧光显微镜或芯片扫描仪对斑点进行检测，显著提尚检测灵敏度。
[0015]具体的工艺过程是:①先通过1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、戊二醛、二硫键或链霉亲和素-生物素等将探针生物分子与磁珠共价结合，形成可与目的生物分子特异结合的磁珠探针；磁珠颗粒直径在0.5?1.5um，磁珠表面有竣基、氣基、轻基、疏基、链霉未和素或生物素等包被；将一端共价结合有荧光分子的生物分子溶液与磁珠探针混合，使目的生物分子与磁珠探针结合；②分离磁珠，梯度洗涤，应尽可能除去与磁珠探针不能结合的生物分子，并减少磁珠探针与目的生物分子发生分离，以提高检测的特异性；为保证随后的微浓缩过程浓缩斑点足够小，选择适宜浓度的DNA、RNA变性溶液或免疫分离溶液使目的生物分子与磁