专利名称：一种高灵敏检测生物分子的方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种高灵敏度检测生物分子的方法。
然而，纳米金颗粒标记方法存在的矛盾是，从提高标记效率的角度，需要纳米金颗粒的粒径越小越好，从易于观察和提高检测灵敏度的角度，则需要纳米金颗粒的粒径越大越好。以往人们主要利用硝酸银和对苯二酚作为增强剂来解决这一矛盾(Hayat，M.A.Ed.Colloid GoldPrinciples，Methods and Applications，vol.1.；AcademicPress，New York，1989.)，并将这一方法应用于微孔滤膜上，开发出微孔滤膜免疫金银法(L.A.Dykman，V.A.Bogatyrev，FEMS Immunol.Med.Microbiol.2000，27，135-137；M.G.Sumi，A.Mathai，C.Sarada，V.V.Radhakrishnan，J.Clin.Microbiol.1999，37，3925-3927.)。其基本原理为将待检测的抗体、抗原或蛋白质固定在微孔滤膜的表面，然后用金标记的与待检测的抗体、抗原或蛋白质相对应的抗原、抗体或受体处理微孔滤膜，再用硝酸银和对苯二酚作为增强剂来处理微孔滤膜。若在微孔滤膜的表面存在待检测的抗体、抗原或蛋白质，则会出现具有一定灰度的斑点，以此作为检测的依据。此法的优点是操作简单，而且不需要特殊的仪器；缺点是检测灵敏度只有ng/mL，远低于荧光标记、放射性标记、酶标显色法的检测灵敏度，限制了此法的实际应用。
一种高灵敏检测生物分子的方法，是用扩增试剂来处理用微孔滤膜免疫金银法得到的微孔滤膜；所述扩增试剂为浓度大于0.001％的氯金酸水溶液或缓冲液溶液及浓度大于0.01mmol/L的羟胺水溶液或缓冲液溶液。
所述氯金酸缓冲液溶液的缓冲液为Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液或HEPS缓冲液。缓冲液溶液的pH＝3-9。
所述羟胺缓冲液溶液的缓冲液为Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液或HEPS缓冲液。缓冲液溶液的pH＝3-9。
所述氯金酸水溶液或缓冲液溶液中氯金酸的优选浓度为0.01-10％。
所述羟胺水溶液或缓冲液溶液中羟胺的优选浓度为0.01-10mmol/L。
通过比较，考虑检测的灵敏度、成本、所用时间等因素，用扩增试剂处理微孔滤膜两次为较好的选择。
所述用扩增试剂处理微孔滤膜的时间每次均大于0.5分钟，优选为1-30分钟。
用微孔滤膜免疫金银法得到微孔滤膜的步骤如下(1)将颗粒度小于50nm的金颗粒水溶液与浓度大于0.01g/mL，pH＝3～9的与待检测的抗体、抗原或蛋白质相对应的抗原、抗体或受体缓冲溶液，按照金颗粒与待检测的抗体、抗原或蛋白质相对应的抗原、抗体或受体摩尔比为1∶1～1000的比例，在20～60的条件下混合5分钟以上，制备成纳米金颗粒标记的生物探针；(2)将待检测的抗体、抗原或蛋白质点加在微孔滤膜的表面，在30-90的条件下固定20分钟以上；(3)用与纳米金颗粒标记的生物探针不发生作用的蛋白溶液，在20～60的条件下封闭20分钟以上；(4)用纳米金颗粒标记的生物探针处理滤膜，在室温下反应20分钟以上。
在操作过程中，作为氧化剂的氯金酸溶液与作为还原剂的羟胺溶液可以先后分别使用，也可以同时使用，为保证测试效果，一般应采用过量的羟胺溶液。
使用本发明的方法，可以显著提高抗体、抗原或蛋白质的检测灵敏度，只要生物分子的含量达到10pg/mL，即可准确检出。本发明的方法操作简便、快捷、不需要特殊的仪器设备，可以广泛用于临床诊断、抗体、抗原的检测、卫生检疫、环境检测等领域，具有十分广泛的应用前景与开发价值。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
(2)将人IgG溶液2L点加在微孔滤膜的表面，在60℃的条件下固定60分钟；(3)用3％牛血清白蛋白溶液(Tris-HCl缓冲液，pH7.4)，在55℃的条件下封闭60分钟；(4)用第(1)步得到的纳米金颗粒标记的生物探针处理滤膜，在室温下反应，时间60分钟；(5)用浓度为0.1％的氯金酸水溶液及0.01mmol/L的羟胺水溶液作为扩增试剂，混合处理微孔滤膜二次，每次5分钟，人IgG的最低检出限为10pg/mL。
实施例2检测伴刀豆球蛋白(1)将30nm的金颗粒水溶液5mL与浓度50g/mL的pH＝6.5的亲和素(Tris-HCl缓冲液，pH7.4)溶液2mL混合15min，制备成纳米金颗粒标记的生物探针；(2)将生物素标记的伴刀豆球蛋白溶液2L点加在微孔滤膜的表面，在60℃的条件下固定120分钟；(3)用马血清溶液(Tris-HCl缓冲液，pH7.0)，在30℃的条件下封闭60分钟；(4)用纳米金颗粒标记的生物探针处理滤膜，在室温下反应，时间30分钟；(5)用浓度5％的氯金酸缓冲液(Tris-HCl缓冲液，pH7.0)及3mmol/L的羟胺水溶液作为扩增试剂，在步骤4的基础上，分别处理微孔滤膜，各15分钟，伴刀豆球蛋白的最低检出限为15pg/mL。
实施例3(1)将5nm的金颗粒水溶液5mL与浓度300g/mL的pH＝8.2的兔抗羊IgG(Tris-HCl缓冲液，pH8.2)溶液1mL混合8min，制备成纳米金颗粒标记的生物探针；(2)将羊IgG溶液2L点加在微孔滤膜的表面，在80℃的条件下固定30分钟；(3)用5％牛血清白蛋白溶液(Tris-HCl缓冲液，pH7.4)，在37℃的条件下封闭120分钟；(4)用纳米金颗粒标记的生物探针处理滤膜，在室温下反应，时间120分钟；(5)用浓度10％的氯金酸水溶液及10mmol/L的羟胺缓冲液(PBS缓冲液pH7.0)。作为扩增试剂。在步骤4的基础上，混合处理微孔滤膜二次，每次25分钟，羊IgG的最低检出限为12pg/mL。
权利要求
1.一种高灵敏检测生物分子的方法，是用扩增试剂至少一次处理用微孔滤膜免疫金银法得到的微孔滤膜；所述扩增试剂为浓度大于0.001％的氯金酸水溶液或缓冲液溶液及浓度大于0.01mmol/L的羟胺水溶液或缓冲液溶液。
2.根据权利要求1所述的高灵敏检测生物分子的方法，其特征在于所述氯金酸缓冲液溶液的缓冲液为Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、或HEPS缓冲液。
3.根据权利要求2所述的高灵敏检测生物分子的方法，其特征在于所述氯金酸缓冲液溶液的pH＝3-9。
4.根据权利要求1所述的高灵敏检测生物分子的方法，其特征在于所述羟胺缓冲液溶液的缓冲液为Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液、或HEPS缓冲液。
5.根据权利要求4所述的高灵敏检测生物分子的方法，其特征在于所述羟胺缓冲液溶液的pH＝3-9。
6.根据权利要求1所述的高灵敏检测生物分子的方法，其特征在于所述氯金酸水溶液或缓冲液溶液中氯金酸的浓度为0.01-10％。
7.根据权利要求1所述的高灵敏检测生物分子的方法，其特征在于所述羟胺水溶液或缓冲液溶液中羟胺的浓度为0.01-10mmol/L。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的高灵敏检测生物分子的方法，其特征在于用扩增试剂处理微孔滤膜两次。
9.根据权利要求1-7中任意一项所述的高灵敏检测生物分子的方法，其特征在于所述用扩增试剂处理微孔滤膜的时间每次均大于0.5分钟，优选为1-30分钟。
10.根据权利要求1-7中任意一项所述的高灵敏检测生物分子的方法，其特征在于所述用微孔滤膜免疫金银法得到微孔滤膜的步骤如下(1)将颗粒度小于50nm的金颗粒水溶液与浓度大于0.01g/mL，pH＝3～9的与待检测的抗体、抗原或蛋白质相对应的抗原、抗体或受体缓冲溶液，按照金颗粒与待检测的抗体、抗原或蛋白质相对应的抗原、抗体或受体摩尔比为1∶1～1000的比例，在20～60的条件下混合5分钟以上，制备成纳米金颗粒标记的生物探针；(2)将待检测的抗体、抗原或蛋白质点加在微孔滤膜的表面，在30-90的条件下固定20分钟以上；(3)用与纳米金颗粒标记的生物探针不发生作用的蛋白溶液，在20～60的条件下封闭20分钟以上；(4)用纳米金颗粒标记的生物探针处理滤膜，在室温下反应20分钟以上。
全文摘要
本发明的名称为一种高灵敏检测生物分子的方法，涉及生物检测技术领域。本发明的目的是提供一种在微孔滤膜免疫金银法的基础上，利用纳米金颗粒原位扩增技术，高灵敏度检测生物分子的方法。本发明的技术方案是一种高灵敏检测生物分子的方法，是用扩增试剂来处理用微孔滤膜免疫金银法得到的微孔滤膜；所述扩增试剂为浓度大于0.001％的氯金酸水溶液或缓冲液溶液及浓度大于0.01mmol/L的羟胺水溶液或缓冲液溶液。使用本发明的方法，可以显著提高抗体、抗原或蛋白质的检测灵敏度，只要生物分子的含量达到10pg/mL，即可准确检出。本发明的方法操作简便、快捷、不需要特殊的仪器设备，可以广泛用于临床诊断、抗体、抗原的检测、卫生检疫、环境检测等领域，具有十分广泛的应用前景与开发价值。
文档编号G01N33/543GK1410773SQ0114141
公开日2003年4月16日 申请日期2001年9月24日 优先权日2001年9月24日
发明者马占芳, 隋森芳 申请人:清华大学