专利名称：大生物分子流通纯化方法
技术领域：
本发明至少部分涉及新的及改良的用于使样品中大生物分子如例如包囊的病毒、病毒样颗粒以及结合疫苗(conjugate vaccine)与一或多种污染物分离的流通 (flow-through)纯化方法。
背景技术：
在大生物分子如例如包囊的病毒、感染的宿主细胞或卵中的病毒样颗粒或者结合疫苗产生后，希望将所述生物分子与感染的宿主细胞或者卵的其它成分例如DNA、RNA及宿主细胞蛋白分离以获得所述生物分子的基本纯的群体。此外，所产生的生物分子需要与通常用于促进该生物分子产生的一些添加剂分离，因为所述添加剂常能与该生物分子共纯化。常规地，许多技术如超速离心、层析和膜过滤已经用于纯化浓缩大生物分子如包囊的病毒和病毒样颗粒(见例如PCT公开W02008/073490和W02004/112707)。用于纯化这种生物分子的各种类型的层析技术包括例如大小排阻层析(SEC)、阴离子交换层析(AEX) 和亲和层析(见例如 W02004/112707 ;Transfiguracuin et al.，J Virol Methods 142 21-28(2007)和 Kalbfuss et al. Biotech. Bioeng. 96 :932-944 (2007))。虽然前述技术在一定程度上用于纯化大分子如包囊的病毒和病毒样颗粒，但是所有这些层析技术一般以结合和洗脱模式使用。特别地，由于这种生物分子的大尺寸(例如 15-400nM)，其不能穿透大多数可商购的介质的孔，且因此其通常与该介质的外部结合并随后被洗脱。然而，污染物和杂质一般结合至颗粒的内表面，但有时部分地与所述大生物分子一起洗脱。此外，一或多种这些技术有时以非连续模式使用，然而总产量一般较差。发明概述本发明至少部分提供了改良的用于使样品中大生物分子如例如包囊的病毒、病毒样颗粒及结合疫苗与一或多种污染物分离的流通方法。本发明利用一或多种层析技术以流通模式纯化大生物分子如包囊的病毒、病毒样颗粒、结合疫苗以及细菌细胞表面多糖，所述层析技术包括例如阴离子交换层析(AEX)、阳离子交换层析(CEX)及疏水性相互作用层析 (HIC)。本发明的方法通常使用单一连续流通方法致使大生物分子如病毒、病毒样颗粒或者结合疫苗的回收改良，这种方法远远优于本领域目前常用的一般为结合和洗脱模式且非连续的常规方法。本发明的方法至少部分基于使用至少一种类型的层析颗粒(例如固体多孔珠)，其每单位体积外表面积被最小化而相对于通常用于层析方法中而其每单位体积外表面积未被最小化的相似层析颗粒，其每单位体积内表面积未降低25%以上。一般而言，本发明至少部分依赖于反向模式操作，即通过以流通模式使用一或多种AEX、CEX和HIC层析介质，其中至少一种这样的介质包含致使回收改良的特性，例如最小化的每单位体积外表面积以及未降低25%以上的每单位体积内表面积。本发明的方法使得可以在单一步骤中回收大生物分子以及提供了与需要许多纯化前和纯化后步骤的常规层析方法相比最少的进料(feed)和产物流的上游和下游处理。 此外，本发明的方法在含有大生物分子的样品中存在和不存在宿主细胞蛋白质的情况下均导致所述大生物分子回收的改良。在本发明的一个方面，提供了用于从包含大生物分子和一或多种污染物的样品中对所述大生物分子的回收进行改良的流通方法。这种方法包括使样品与具有小于所回收的大生物分子的分子量截断值的一或多种固体多孔颗粒群接触，其中所述流通方法中使用的至少一种固体多孔颗粒群的每单位体积外表面积是最小化的并且其中每单位体积内表面积相对于不包含最小化的每单位体积外表面积的固体多孔颗粒群未降低25%以上，从而改良所述大生物分子的回收。在一些实施方案中，将所述一或多种固体多孔颗粒群填充在层析柱中。与不使用包含最小化的每单位体积外表面积以及每单位体积内表面积未降低 25%以上的至少一种固体多孔颗粒群的流通方法的大生物分子的回收相比，本发明的流通方法导致大生物分子的回收改良例如至少10 %、或至少20 %、或至少30 %、或至少40 %、或至少50 %、或至少60 %、或至少70 %、或至少80 %、或至少90 %。在一些实施方案中，本发明的流通方法导致大生物分子的纯度改良至少20%。在一些实施方案中，本发明的流通方法导致一或多种污染物减少至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%或更多。在一些实施方案中，所述一或多种固体多孔颗粒群选自用于阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水性相互作用层析的一或多种珠。可以使用本发明的方法回收的大生物分子选自由包囊的病毒、病毒样颗粒和结合疫苗组成的组。在一些实施方案中，所述一或多种污染物选自由核酸、蛋白质、赋形剂和细胞培养添加剂组成的组。在一些实施方案中，所述一或多种污染物是宿主细胞蛋白质。在一些实施方案中，本发明的流通方法用于将病毒样颗粒与一或多种污染物分离。示例的病毒样颗粒包括但不限于BSA包被的苯乙烯颗粒。在一些实施方案中，本发明的流通方法用于将包囊的病毒与一或多种污染物分离。示例的包囊的病毒包括但不限于流感病毒(例如Hmi株)、腺病毒和噬菌体。在一些实施方案中，所述大生物分子在细胞培养物或者卵中产生。在一些实施方案中，所述细胞培养物包含MDCK细胞。在一些实施方案中，包含大生物分子和一或多种污染物的样品是细胞培养上清，对其进行本发明的流通方法。在本发明的流通方法的各种实施方案中，所述方法中包括的至少一种固体多孔颗粒群包含在200 μ m-600 μ m范围的平均直径。在各种实施方案中，本发明的流通方法使得能够从样品中回收至少50 %、或至少 55 %、或至少60 %、或至少65 %、或至少70 %、或至少75 %、或至少80 %、或至少85 %、或至少90%的大生物分子。附图简述
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图1是对通过0. 5ml柱的Wii6与BSA的溶液混合物中的噬菌体Wii6的流通效价进行测量的示例性实验结果的图，所述柱含有如下之一 S4FF(对照)珠、QS4FF(90ym)珠、 或QSBBQOOym)珠。X轴表示经过每个柱处理的进料的柱体积而Y轴表示每个柱的流通液中的Wii6效价。图2是对通过Iml柱的含有B型流感病毒、宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白质、胎牛血清及其它细胞培养添加剂的溶液混合物中B型流感病毒的流通效价进行测量的示例性实验结果的图，所述柱含有如下之一Qkpharose HP (30 μ m)珠、Qkpharose 4FF(90ym) 珠、或QS印harose BB (200 μ m)珠。X轴表示经过每个柱处理的进料的柱体积而Y轴表示每个柱的流通液中的B型流感病毒效价。图3是对通过0. 8ml柱的宿主细胞蛋白质与DNA的混合物中A型流感病毒的临界点(breakthrough)进行测量的示例性实验结果的图，所述柱含有如下之一 S4FF(对照) 珠、QS4FF(90 μ m)珠、或QSBB (200 μ m)珠。X轴表示经过每个柱处理的进料的体积而Y轴表示每个柱的流通液中的A型流感病毒效价。图4是对通过0. 8ml柱的A型流感病毒与DNA的溶液混合物中宿主细胞蛋白质 (HCP)的临界点进行测量的示例性实验结果的图，所述柱含有如下之一S4FF(对照)珠、 QS4FF(90ym)珠、或QSBB QOO μ m)珠。X轴表示经过每个柱处理的进料的体积而Y轴表示每个柱的流通液中的HCP效价。图5是对通过柱的HCP与宿主细胞DNA的溶液混合物中A型流感病毒的临界点进行测量的示例性实验结果的图，所述柱含有如下之一 0. 8ml的QS4FF(90ym)珠；0. 8ml 的 QSBB (200 μ m)珠；连续的 0. 8ml 的 QSBB 和 0. 8ml 的 SP Sepharose 大珠(200 μ m) (AC)； 连续的 0. 8ml 的 QSBB 和 0. 8ml 的 Phenyl Sepharose 大珠(200 μ m) (AH)；连续的 0. 8ml 的 QSBB、0. 8ml 的 SP Sepharose 大珠和 0. 8ml 的 Phenyl Sepharose 大珠(ACH)；或者 2. 4ml 的QSBB、SP S印harose大珠和Phenyl S印harose大珠的混合物(MACH)。X轴表示经过每个柱处理的进料的体积而Y轴表示每个柱的流通液中的B型流感病毒效价。图6是对通过柱的A型流感病毒与宿主细胞DNA的溶液混合物中HCP的临界点进行测量的示例性实验结果的图，所述柱含有如下之一 0. 8ml的QS4FF(90ym)珠；0. 8ml 的 QSBB (200 μ m)珠；连续的 0. 8ml 的 QSBB 和 0. 8ml 的 SP Sepharose 大珠(200 μ m) (AC)； 连续的 0. 8ml 的 QSBB 和 0. 8ml 的 Phenyl Sepharose 大珠(200 μ m) (AH)；连续的 0. 8ml 的 QSBB、0. 8ml 的 SP Sepharose 大珠和 0. 8ml 的 Phenyl Sepharose 大珠(ACH)；或者 2. 4ml 的QSBB、SP S印harose大珠和Phenyl S印harose大珠的混合物(MACH)。X轴表示经过每个柱处理的进料的体积而Y轴表示每个柱的流通液中HCP的效价。发明详述本发明提供了改良的将样品中大生物分子(例如包囊的病毒、病毒样颗粒或者结合疫苗)与一或多种污染物分离的流通方法，其使用至少一种类型的层析珠，该层析珠包含最小化的每单位体积外表面积且相对于相似类型的层析珠每单位体积内表面积未降低 25%以上，所述相似类型的层析珠不包含最小化的每单位体积外表面积且每单位体积内表面积未降低。I.定义为了使本公开更易于理解，首先定义某些术语。另外的定义在详细描述中阐述。
术语“流通方法”、“流通模式”和“流通层析”在本文可互换使用，是指产物分离技术，其中与一或多种污染物一起包含于样品中的至少一种产物(例如大生物分子如本文描述的那些)流经层析树脂或者介质，而至少一种潜在的污染物或者杂质结合所述层析树脂或者介质。所述“流通模式”通常是无梯度操作(即期间移动相的组成成分不变的层析方法)。这种流通层析方法可以使用单一柱、连续或者平行的多个柱、串联柱、模拟移动床 (SMB)及其组合来进行操作。术语“结合及洗脱模式”及“结合及洗脱方法”在本文可互换使用，是指产物分离技术，其中样品中包含的至少一种产物(例如大生物分子，如本文描述的那些)结合层析树脂或者介质并随后被洗脱。术语“污染物”、“杂质”和“碎片”在本文可互换使用，是指任何异种或者不适宜的分子，包括生物大分子如DNA、RNA，一或多种宿主细胞蛋白质，内毒素，脂质及一或多种添加剂，其可存在于含有感兴趣的大生物分子的样品中，所述感兴趣的大生物分子使用本发明的流通方法与一或多种异种或者不适宜的分子分离。此外，这种污染物可包括可在分离方法之前进行的步骤中使用的任何试剂。通常，含有所述大生物分子的样品中存在的污染物的大小小于所述大生物分子。例如，大多数宿主细胞蛋白质的范围在大约3KD到150KD，其小于使用本文所述方法分离的大多数大生物分子的大小。如本文所用，术语“大生物分子”是指感兴趣的生物材料，其具有的平均直径为至少15nm，或者至少20nm，或者至少25nm，或者至少30nm，或者至少35nm，或者至少40nm， 或者至少45nm,或者至少50nm,或者至少55nm,或者至少60nm,或者至少65nm,或者至少 70nm,或者至少75nm，或者至少80nm，或者至少90nm，或者至少lOOnm，或者至少1 IOnm,或者至少120nm，或者至少130nm，或者至少140nm，或者至少150nm，或者至少160nm，或者至少 170nm,或者至少180nm，或者至少190nm，或者至少200nm，或者至少210nm，或者至少220nm， 或者至少230nm，或者至少MOnm，或者至少250nm，或者至少沈0歷，或者至少270nm，或者至少观0歷，或者至少四0歷，或者至少300nm，或者至少310nm，或者至少320nm，或者至少 330nm,或者至少340nm，或者至少350nm，或者至少360nm，或者至少370nm，或者至少380nm， 或者至少390nm，或者至少400nm，使用本文所述的流通方法将其与含有所述生物材料的样品中存在的一或多种污染物分离。示例性的大生物分子包括例如包囊的病毒、病毒样颗粒及结合疫苗。在一些实施方案中，使用本发明的方法分离的大生物分子从层析珠的孔中排出或者仅结合至珠的外表面。如本文所用，术语“包囊的病毒”是指包括壳体内核酸分子(例如DNA或者RNA)且通常仅结合至层析珠外表面的任何病毒。在一些实施方案中，所述壳体在壳体周围有脂质包膜。在一些实施方案中，包囊的病毒包括封闭在复杂膜结构内的RNA或者DNA分子(例如来自痘病毒科的天花病毒)。通常，大多数包膜的病毒具有15-400nm的大小范围。如本文所用，术语“病毒样颗粒”是指其大小和/或免疫原性类似于病毒但缺乏如病毒那样复制能力的颗粒或者物质(例如人乳头瘤病毒(HPV)疫苗)。如本文所用，术语“结合疫苗”是指通过将细菌细胞表面多糖与蛋白质或者毒素反应产生的疫苗。示例性的结合疫苗包括但不限于肺炎球菌(Pneumococcal)疫苗和肺炎链球菌(Streptococcal pneumoniase)疫苗。如本文所用，术语“层析”是指将感兴趣的大生物分子(例如包囊的病毒，病毒样颗粒或者结合疫苗)与样品中与所述感兴趣的大生物分子一起存在的一或多种污染物分离的任何种类的技术。如本文所用，术语“阴离子交换层析”或者“ACE”是指使用带正电的珠将感兴趣的生物分子(例如大生物分子如包囊的病毒、病毒样颗粒或者结合疫苗)与样品中的一或多种污染物分离的层析方法。示例性的可商购的AEC介质包括购自GE Healthcare的 Q SepharoseFF、Q Sepharose XL、CaptoQ、Q Sepharose HP;购自 EMD Chemicals Inc 的 Fractogel EMD TMAE^Fractogel EMD DEAE 以及购自 TOSH Bioscience 的 Toyopearl DEAE> Toyopearl QAE 禾口 Toyopearl SuperQ0AEC已常规用于使用珠、膜和块体(monolith)的病毒纯化。AEC通常基于这样的原理，即包囊的病毒如例如流感病毒和腺病毒在大于5.5的pH是带负电的。因此，在高于 5. 5的pH下，其可以使用带正电的树脂通过离子相互作用结合及洗脱。通常，由于大多数包囊的病毒的大小，其不能透过大多数可商购的AEC介质且仅可以结合至介质的外表面，从而限制层析柱的病毒容量。因此，克服柱容量问题的一般方法是降低AEC介质的大小(见例如 PCT 出版物 W02004112707)。如本文所用，术语“阳离子交换层析”或者“CEC”是指层析方法，其使用带负电的珠将感兴趣的生物分子(例如大生物分子如包囊的病毒、病毒样颗粒或者结合疫苗)与样品中的一或多种污染物分离。示例性的可商购CEC介质包括得自GE Healthcare的SP Sepharose> SP Sepharose HP，得自 EMD Chemicals Inc 的 Fractogel EMD SO” 以及得自 TOSH Bioscience 的 Toyopearl SP 禾口 Toyopearl CM0如本文所用，术语“疏水性相互作用层析”或者“HIC”是指层析方法，其使用固定有芳香族或者脂肪族碳氢化合物作为疏水性基团的珠来分离感兴趣的生物分子。在一个实施方案中，HIC用于将大生物分子如例如结合疫苗与样品中的一或多种污染物分离。示例性的可商购的HIC介质包括得自GE Healthcare的Phenyl S印harose，得自EMD Chemicals Inc^FractogelEMD Propyl 650、Fractogel EMD Phenyl 650,g TOSH Bioscience 白勺 Toyoperal Phenyls Toyopearl Butyl> Toyopearl Hexyl 禾口 Toyopearl Ether。如本文所用，术语“大小排阻层析”或者“SEC”是指层析方法，其基于这样的原理，即当含有不同大小溶质的溶液经过具有适当孔大小的多孔介质时，较小的溶质花费较长时间在介质中扩散并因此具有较长的保留时间，而较大的溶质迅速扩散，从而使得可以将其与所述较小溶质分离。示例性的可商购的SEC介质包括Toyopearl HW, Sepharose, Sephacryl 禾口 Fractogel EMD BioSEC0由于大多数病毒的大小，其不能透过大多数可商购的SEC介质并通常在SEC层析柱的空隙体积中洗脱。然而，SEC—般有一些缺点，例如通常SEC层析需要长的柱长度，最大荷载容量不可超过20%，处理时间非常长且经常导致感兴趣产物的稀释。术语“混合模式层析”或者“双模(bimodal)层析”或者“多模(multimodal)层析”在本文可互换使用，是指使用在单一珠上具有一个以上官能团和/或不同官能团组合的珠的层析方法。这种珠可以称作为混合模式树脂或珠、双模树脂或珠或者多膜树脂或珠。 例如，单一珠可在同一珠上具有带正电的基团和带负电的基团或者具有带正电的基团和疏水性基团或者具有带负电的基团和疏水性基团或者具有带正电的基团、带负电的基团和疏水性基团的每一个。这种珠可用于使感兴趣的生物分子与样品中的一或多种杂质分离。示例性的可商购的混合模式介质包括例如得自GE healthcare的Captoadhere，得自I^all Corporation 的 HPA 和 PPA HyperCel 。如本文所用，术语层析介质的“动态结合容量”是指在未结合的生物分子的显著临界点发生之前在流通方法中所述介质结合的靶生物分子的量。层析介质的动态容量反映随着流速增加可发生的传质限制(mass transfer limitations)的影响且其可用于预测与介质的饱和或者静态结合容量确定相比的实时进程情况。一般，介质的动态结合容量低于静态结合容量。如本文可互换使用的术语层析介质的“静态结合容量”和“饱和结合容量”是指如果珠上每一可用结合位点均被利用时，介质(例如填充在柱中的珠)在静态平衡条件下可结合的靶生物分子的量。静态结合容量可以通过例如以非常慢的流速或者在柱中珠的密闭系统中延长时间温育之后加载大量过量的靶生物分子而确定。实际上，静态结合容量在使用填充柱的处理条件下是从不可得的。如本文所用，术语“每单位体积外表面积”是指可用于结合感兴趣的生物分子的层析颗粒群(例如珠)的外表面的总面积。例如，在一些实施方案中，每单位体积外表面积定义为填充在柱中的固体多孔颗粒群可用于结合大生物分子的外表面的总面积。评估珠的每单位体积外表面积可以通过数学或者经验计算。例如，从数学上，可以使用如下等式估计每单位体积外表面积4^= (等式 I)
α其中，Aes7v =每单位体积外表面积；d =使用的珠的直径；而η =柱的填充密度。 对于充分填充的柱，假设珠是六方密填充(HCP)，其等于0. 74。此外，η =1-空隙体积。柱的空隙体积可以使用与珠不相互作用且从珠的孔排出的分子实验确定(见例如 Gel filtration-Principles and Methods, Amersham Biosciences)。经验上，如下所述估计每单位体积外表面积。通常，使用与所述大生物分子相同大小和电荷的球形纳米粒子进行经验计算。所获得的纳米粒子的浓度通常由厂商指定或者可以通过使用用于确定病毒颗粒的标准技术获得，所述标准技术如动态光散射或者UV-Vis 光谱学(见例如Wolfgang Haiss et al. ,Determination of Size and Concentration of Gold Nanoparticles from UV-Vis Spectra，2007，79，4215-4221)。所述纳米粒子与固定体积的珠的结合通过使用例如本文所述的静态结合容量实验来研究。与珠结合的纳米粒子的量可以使用如下公式估算Nn= (Cin-Cf) ν (等式 II)其中，Ns =饱和时与珠结合的纳米粒子的量；Cin =测量为单位体积颗粒的溶液中纳米粒子的初始浓度；Cf =测量为单位体积颗粒的溶液中纳米粒子的终浓度；ν =使用的溶液的体积。含有纳米粒子的柱的每单位体积外表面积可以如下确定J =AT xix丄(等式 III)
es/v4 V其中，dn =纳米粒子的直径；而V =柱体积。
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如本文所用，术语层析颗粒(例如珠)群的“每单位体积内表面积”可以定义为颗粒的每单位体积总表面积减去颗粒的每单位体积外表面积并可以如下估算
权利要求
1.一种改良从包含大生物分子及一或多种污染物的样品中回收所述大生物分子的流通方法，所述方法包括使所述样品与一或多种固体多孔颗粒群接触，所述颗粒具有小于待回收大生物分子的分子量截断值，其中所述流通方法中使用的至少一种固体多孔颗粒群包含最小化的固体多孔颗粒群每单位体积外表面积以及相对于不具有最小化的每单位体积外表面积的固体多孔颗粒群，其固体多孔颗粒群的每单位体积内表面积未降低25%以上， 从而改良所述大生物分子的回收。
2.权利要求1的流通方法，其中将所述一或多种固体多孔颗粒群填充在层析柱中。
3.权利要求1的流通方法，其中与未使用包含最小化的颗粒群的每单位体积外表面积且颗粒群的每单位体积内表面积未降低的至少一种固体多孔颗粒群的流通方法的大生物分子的回收相比，所述大生物分子的回收改良至少10%、或者至少20%、或者至少30%、 或者至少40%、或者至少50%、或者至少60%、或者至少70%、或者至少80%、或者至少 90%。
4.权利要求3的流通方法，其中所述改良的回收包括大生物分子的纯度改良至少 10%。
5.权利要求3的流通方法，其中所述改良的回收包括一或多种污染物减少至少10%、 或者至少20%、或者至少30%、或者至少40%或者更多。
6.权利要求1的流通方法，其中所述一或多种固体多孔颗粒群选自用于阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水性相互作用层析的一或多种珠。
7.权利要求1的流通方法，其中所述一或多种固体多孔颗粒群包含混合模式层析珠。
8.权利要求1的流通方法，其中所述大生物分子选自由包囊的病毒、病毒样颗粒以及结合疫苗所组成的组。
9.权利要求1的流通方法，其中所述一或多种污染物选自由核酸、蛋白质、赋形剂和细胞培养添加剂所组成的组。
10.权利要求8的流通方法，其中所述蛋白质是宿主细胞蛋白质。
11.权利要求7的流通方法，其中所述病毒样颗粒是用BSA包被的苯乙烯颗粒。
12.权利要求7的流通方法，其中所述包囊的病毒是流感病毒。
13.权利要求7的流通方法，其中所述包囊的病毒是腺病毒。
14.权利要求7的流通方法，其中所述包囊的病毒是噬菌体。
15.权利要求11的流通方法，其中所述流感病毒是Hmi病毒。
16.权利要求1的流通方法，其中所述大生物分子在细胞培养物或者在卵中产生。
17.权利要求1的流通方法，其中所述样品是细胞培养上清。
18.权利要求15的流通方法，其中所述细胞培养物包含MDCK细胞。
19.权利要求1的流通方法，其中所述至少一种固体多孔颗粒群具有的平均直径在 200ym-600ym^;g。
20.权利要求1的流通方法，其中所述方法使得可以回收样品中至少50%、或者至少 55 %、或者至少60 %、或者至少65 %、或者至少70 %、或者至少75 %、或者至少80 %、或者至少85%、或者至少90%的所述大生物分子。
全文摘要
本发明至少部分涉及新的和改良的用于将样品中的大生物分子如包囊的病毒、病毒样颗粒以及结合疫苗与一或多种污染物分离的流通纯化方法，其中所述方法利用至少一种固体多孔颗粒群，该颗粒群包含最小化的颗粒每单位体积外表面积以及相对于不具有最小化外表面积的相似颗粒群未降低25％以上的每单位体积内表面积。
文档编号C12N7/02GK102154228SQ20101059777
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月15日 优先权日2009年12月16日
发明者G·耶尔, K-S·郑, S·拉马斯瓦米 申请人:米利波尔公司