一种银杏内酯b的分离纯化方法
【专利摘要】本发明涉及中药领域，公开了一种银杏内酯B的分离纯化方法。该方法的特征是应用动态轴向压缩工业色谱柱系统(BM-DAC工业色谱柱系统)从银杏内酯粗品中分离出一定纯度的银杏内酯B，再应用有机溶剂进行重结晶，最后得到高纯度的银杏内酯B。本发明的方法对银杏内酯B的分离纯化具有较好的选择性，分离操作工艺简单、易实施，分离周期短、效率高，对于天然活性成分单体的制备具有重要意义。
【专利说明】-种银杏内醒B的分离纯化方法
[000。 本申请要求于2013年09月22日提交中国专利局、申请号为201310454410. 9、发 明名称为；"一种银杏内醋B的分离纯化方法"的中国专利申请的优先权，其全部内容通过 引用结合在本申请中。
【技术领域】
[0002] 本发明属于中药领域，涉及一种工业化分离纯化银杏内醋B的方法。
【背景技术】
[0003] 银杏内醋为银杏叶提取物中主要的药效成分之一，主要包括银杏内醋A、B、C和白 果内醋。银杏内醋是天然的血小板活化因子枯抗剂，其中W银杏内醋B的活性最高（苏静， 等.逆流色谱法分离纯化银杏叶中白果内醋和银杏内醋A、B、C[J],中草药，2008,39(11): 1644-1648.)。银杏内醋B是迄今发现的最强的血小板活化因子枯抗剂，可在临床用于血 栓、中风、器官移植排斥反应、血液透析和休克等的治疗，其效果大大高于银杏内醋混合物 (冯汉林，等.银杏苦内醋B及其同系物的药理作用[J].中草药，1997, 28 (2) =752-755.)。
[0004] 在现有技术中，章晨峰等在论文《银杏内醋B的提取、分离与纯化研究》中公开了 采用醇提水沉、树脂吸附、重结晶等方法对分离纯化银杏内醋B的技术，采用该技术得到的 银杏内醋B纯度为95%。肖晓霞等在论文《银杏内醋B的制备及纯化工艺研究》中公开了 采用高速逆流萃取富集，聚醜胺和大孔树脂柱层析分离与己醇重结晶相结合纯化银杏内醋 B的技术，采用该技术得到的银杏内醋B纯度为96. 3 %，但该技术不适合工业化生产。董新 荣等在论文《银杏内醋的提取纯化与分离》中公开了采用娃胶柱层析的方法分离银杏内醋 B，采用该方法得到的银杏内醋B纯度仅为90%。专利号为化200310104958. 7的发明专利 公开了一种模拟移动床色谱分离提纯银杏内醋B的方法，应用该方法收率达64%、纯度为 90 %，但是模拟移动床色谱系统比较复杂，所需设备较多，不可控因素相对比较多。
[0005] 现有技术应用的是模拟移动床色谱（SMBC)，属于连续色谱。金贵顺在论文《模拟 移动床色谱》中分析，SMBC是W色谱为操作单元的连续色谱系统，将多根色谱柱用多位阀和 管子连接在一起，每根柱子均设有样品的进出口，并通过多位阀沿着流动相的流动方向，改 变样品的进出口位置，W此来模拟固定相与流动相之间逆流移动，实现两种组分的连续分 离。它的进样通过粟来控制，进样过程与色谱冲洗过程同时进行，每一个切换周期在一个进 样口持续进样，进样流速对过程有重要影响，如果进样流速控制不当，就会造成部分柱子中 样品浓度不均匀的现象，因此SMBC系统分离条件的选择是一个有相当难度的问题。
[0006] 张健等在论文《半制各高效液相色谱分离测定银杏内醋》中公开了应用半制备高 效液相色谱从银杏内醋中分离A、B。但是半制备高效液相色谱具有一定的局限性，为了能 在较低的压力条件下进行大流量洗脱，一般的半制备柱装填的是大颗粒填料；但是为了满 足必要的分离度要求，又不得不维持一定的色谱柱长度，该不仅使分离时间延长，而且降低 产率，使生产成本升高。在半制备柱中装填小颗粒填料虽然很容易满足分离度的要求，并具 有较大的柱负载量，但在此条件下，色谱系统呈现很高的压力，因而妨碍其应用。
[0007] 苏静等在论文《高速逆流色谱法分离纯化银杏叶中白果内醋和银杏内醋A、B、C》 中公开了使用高速逆流色谱法分离银杏内醋和白果内醋的方法，该方法所得银杏内醋B的 纯度在97. 3% W上。不过，高速逆流色谱法是利用溶质在两种互不相溶的溶剂系统中分配 系数的不同，从而进行分离的色谱法，因此如何选择溶剂系统的组成及比例是一个难题。此 夕F，如何正确选择转向和转速、流速、操作温度等参数及如何提高GB的制各量等问题，都是 将来研究的重点。
[0008] 研究发现，在常用的工业色谱技术中，动态轴向压缩工业色谱柱系统值AC)是一 种高效、操作简便的分离技术。间家牒在《辅酶Qi。低成本生产的技术支持》一文中提到， DAC在纯化合成辅酶化。所需的茄尼醇的过程中，显现出了很好的效果。粗品茄尼醇经一次 动态轴向压缩色谱纯化，产品纯度达到> 96 %，收率> 97%。该是目前生产高纯度茄尼醇 最简便、成本最低的方法。朱靖博等应用DAC分离丹参脂溶性单体化合物，最终制备得到4 个丹参丽类化合物，其中BC-2、BC-4、D-2分别鉴定为纯度达98. 5%的丹参丽IIA、96. 2%的 丹参丽I W及97. 8%的隐丹参丽，化合物的BC-3纯度为95. 4%，结构需进一步鉴定。该实 验结果证明，动态轴向压缩制备色谱是一种天然活性成分制备的操作简单、分离周期短、效 率高的分离设备。
[0009] DAC在分离方面的优势己被业界认可，但是还没有关于DAC分离银杏内醋B的报 道。如果应用DAC技术，那么分离参数需要进一步考察，W便得到高纯度的银杏内醋B。
[0010] 因此，研究一种适合工业化生产、操作简单、易实施、分离度高、所得银杏内醋B纯 度高的制备方法是目前急需解决的课题。
【发明内容】
[0011] 本发明的目的在于提供一种银杏内醋B的精制方法，本发明提供的方法适用于工 业化大生产，操作简单，能够得到高纯度银杏内醋B。
[0012] 本发明提供了一种银杏内醋B的精制方法，包括W下步骤：
[0013] (1)银杏内醋B粗品制备；银杏叶药材用50%?95%己醇回流提取，减压回收己 醇并浓缩至相对密度为1.0-1. 12的清膏，放冷，用5%?15%盐酸溶液，调节抑值1-2， 揽拌充分，放置18?36h，己酸己醋振摇提取，取己酸己醋层回收并浓缩至相对密度为 1. 15-1. 28的稠膏，冷藏离也，沉淀中加入丙丽，揽拌溶解，滤过，析晶，连续2?5次，晶体干 燥，即得银杏内醋粗品；
[0014] (2)银杏内醋B分离；将步骤（1)中所得粗品用流动相超声溶解，放置室温后定 容，将粗品上工业色谱柱，用流动相W 200?400mL/min的体积流量进行梯度洗脱，每2? 化收集一次，并应用薄层色谱法CTLC)跟踪检测，合并色谱带相同组分，色谱带无显示时， 更换流动相比例，洗脱后回收流动相；
[0015] (3)银杏内醋B纯化；在步骤（2)中得到的组分中加入溶剂，加热溶解，放冷析晶， 滤过，沉淀用纯化水洗涂，干燥恒重，得到高纯度银杏内醋B。
[0016] 所述步骤（2)中的工业色谱柱为动态轴向压缩工业色谱柱系统炬M-DAC工业色谱 柱系统），反向Ci8填料，W 13?15GPa的压力轴向压缩柱床。
[0017] 所述步骤（2)中的流动相为水-甲醇[V(水）：V(甲醇）=10?5 : 5?10]。 [001引所述步骤似中银杏内醋B粗品上样量为30?50g。
[001引所述步骤（3)中的溶剂为甲醇-水、己醇-水、己膳-水中的任意一种。
[0020] 优选的，步骤（1)为；银杏叶药材用60%?80%己醇回流提取，减压回收己醇并浓 缩至相对密度为1.03-1.08的清膏，放冷，用8%?12%盐酸溶液，调节抑值1-2,揽拌充 分，放置20?30h，己酸己醋振摇提取，取己酸己醋层回收并浓缩至相对密度为1. 18-1. 23 的稠膏，冷藏离也，沉淀中加入丙丽，揽拌溶解，滤过，析晶，连续2?5次，晶体干燥，即得银 杏内醋粗品。
[0021] 优选的，步骤（2)为；将步骤（1)中所得粗品用流动相超声溶解，放置室温后定容， 将40?50g的粗品上工业色谱柱，用流动相W 250?350mL/min的体积流量进行梯度洗脱， 每2?化收集一次，并应用薄层色谱法CTLC)跟踪检测，合并色谱带相同组分，色谱带无显 示时，更换流动相比例；
[0022] 优选的，步骤（2)中工业色谱柱为动态轴向压缩工业色谱柱系统炬M-DAC工业色 谱柱系统），反向Ci8填料，W 13. 50?14. 50GPa的压力轴向压缩柱床。
[0023] 优选的，步骤（3)为；在步骤（2)中得到的组分中加入甲醇-水、己醇-水、己 膳-水其中任意一种溶剂，加热溶解，放冷析晶，滤过，沉淀用纯化水洗涂，干燥恒重，得到 高纯度银杏内醋B;
[0024] 优选的，有机溶剂的比例为甲醇-水巧?4 : 2?6v/v)或己醇-水巧?4 : 2? 6v/v)或己膳-水巧?4 ; 2?6v/v);
[00巧]优选的，有机溶剂为甲醇-水巧?4 : 2?6v/v)。
[0026] 为实现本发明，发明人做了如下实验。W下实验用于进一步说明本发明的技术效 果，但不限制本发明。
[0027] 一、实验材料与仪器
[0028] 1 材料
[0029] 银杏叶（山东鄉城产），己醇，己酸己醋（11121911647,南京化学试剂有限公司）， 甲醇（11123011741，南京化学试剂有限公司），己膳（011330141，上海星可高纯溶剂有限公 司）等。
[0030] 2 仪器
[0031] BM-DAC工业色谱柱系统（大连博迈科技有限公司）；20cmX 100cm高压色谱柱 系统，反相填料；高效液相色谱仪（Waters2695)色谱柱；十八焼基键合娃胶为填充剂 (Hypersil Cis5 y m250X4. 6mm)。
[0032] 二、银杏内醋B粗品的制备
[0033] 银杏叶药材用60%?80%己醇回流提取，减压回收己醇并浓缩至相对密度为 1. 03-1. 08的清膏，放冷，用5%?15%盐酸溶液，调节抑值1-2,揽拌充分，放置18?36h， 己酸己醋振摇提取，取己酸己醋层回收并浓缩至相对密度为1. 18-1. 23的稠膏，冷藏离也， 沉淀中加入丙丽，揽拌溶解，滤过，析晶，连续2?5次，晶体干燥，即得银杏内醋粗品。
[0034] H、柱色谱流动相选择
[0035] 根据色谱分离溶剂选择的"H角形法则"和某些溶剂的分离特性，选用水、甲醇、异 丙醇与四氨巧喃适当配比，对样品液进行单向展开。W点数、分离度、拖尾现象作为柱色谱 分离能力的判断指标，对分离溶剂系统进行评价、筛选。
[0036] 鉴于工业色谱体积较大，且出于经济、精细方面的考虑，发明人采用薄层色谱法进 行流动相考察。选择薄层色谱展开系统时，应使样品在TLC板上全程展开，目标化合物的Rf 值在0. 2?0. 3。表1给出了 4种溶剂系统不同比例下的展开效果。最终选择分离度好、不 脱尾的水-甲醇系统作为柱层析的流动相。柱色谱分离的流动相极性应比TLC检测条件极 性大，目标化合物Rf值在0. 1?0. 3。根据所建立的薄层色谱检测条件，调整水-甲醇体系 的比例，降低Rf值，最终选择V(水）：V(甲醇）=8 : 2作为柱色谱分离时初始流动相 的比例。结果见表1
[0037] 表1不同展开剂的TLC分离结果
[0038]
【权利要求】
1. 一种银杏内酯B的精制方法，其特征在于，该精制方法包括以下步骤： (1) 银杏内酯B粗品制备：银杏叶药材用50%?95%乙醇回流提取，减压回收乙醇并 浓缩至相对密度为1.0-1. 12的清膏，放冷，用5%?15%盐酸溶液，调节pH值1-2,搅拌充 分，放置18?36h，乙酸乙酯振摇提取，取乙酸乙酯层回收并浓缩至相对密度为1. 15-1. 28 的稠膏，冷藏离心，沉淀加入丙酮，搅拌溶解，滤过，析晶，连续2?5次，晶体干燥，即得银杏 内醋粗品； (2) 银杏内酯B分离：将步骤（1)中所得粗品用流动相超声溶解，放置室温后定容，将 粗品上工业色谱柱，用流动相以200?400mL/min的体积流量进行梯度洗脱，每2?4L收 集一次，并应用薄层色谱法跟踪检测，合并色谱带相同组分，色谱带无显示时，更换流动相 比例，洗脱后回收流动相； ⑶银杏内酯B纯化：在步骤⑵中得到的组分中加入溶剂，加热溶解，放冷析晶，滤 过，沉淀用纯化水洗涤，干燥恒重，得到高纯度银杏内酯B。
2. 如权利要求1所述的精制方法，其特征在于，步骤（1)可优选为：银杏叶药材用 60%?80%乙醇回流提取，减压回收乙醇并浓缩至相对密度为1. 03-1. 08的清膏，放冷，用 8 %?12 %盐酸溶液，调节pH值1-2,搅拌充分，放置20?30h，乙酸乙酯振摇提取，取乙 酸乙酯层回收并浓缩至相对密度为1. 18-1. 23的稠膏，冷藏离心，沉淀中加入丙酮，搅拌溶 解，滤过，析晶，连续2?5次，晶体干燥，即得银杏内酯粗品。
3. 如权利要求1所述的精制方法，其特征在于，步骤（2)中的工业色谱柱为动态轴向压 缩工业色谱柱系统，反向C18填料，以15?17GPa的压力轴向压缩柱床。
4. 如权利要求1所述的精制方法，其特征在于，步骤⑵中的流动相为水-甲醇，体积 比10?5 : 5?10。
5. 如权利要求1所述的精制方法，其特征在于，步骤（2)中银杏内酯B粗品上样量为 30 ?50g。
6. 如权利要求1所述的精制方法，其特征在于，步骤（3)中的溶剂为甲醇-水、乙 醇-水、乙腈-水中的任意一种。
【文档编号】C07D493/22GK104447790SQ201410195200
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年5月2日 优先权日:2013年9月22日
【发明者】萧伟, 王振中, 李雪峰, 徐振秋, 章晨峰, 徐丰果, 于丹 申请人:江苏康缘药业股份有限公司