人乳头瘤病毒6bE7蛋白表达及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供人乳头瘤病毒6bE7蛋白表达纯化方法，通过设计HPV-6bE7的扩增引物，并从HPV-6b型全病毒质粒中有效扩增出该基因，插入到载体pGEX-4T2和pEGFP-C1中，获得重组载体，转染，收集上清与4B磁珠结合，再用凝血酶切除GST标签，获取HPV-6bE7蛋白，行多点免疫，获得纯化的多克隆抗体。本发明增加了该蛋白原核表达时的可溶性，从而降低下游大规模生产成本以及分离纯化难度，在提高表达量的同时也有利于分离纯化，使该蛋白在工业化放大生产时降低难度，减少成本，并经纯化、免疫，得到高特异性、高效价比的多克隆抗体，能提高检测的准确率，为进一步研究治疗尖锐湿疣疾病奠定基础。
【专利说明】人乳头瘤病毒6bE7蛋白表达及应用
【技术领域】
[0001]本发明属生物【技术领域】，涉及病毒蛋白的诱导表达和抗体制备，具体涉及抑制人乳头瘤病毒6b型E7蛋白原核表达及在制备多克隆抗体中的应用。
【背景技术】
[0002]尖锐湿疣是一种危害我国人民健康和家庭幸福的性传播疾病，由人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus, HPV)引起。HPV不仅可引起皮肤粘膜上皮的抚状增生,还与多种鳞状细胞癌的发生发展有关，亚洲地区尖锐湿疣的病原体主要为人乳头瘤病毒6b型(Human Papillomavirus type 6b, HPV~6b)和 11 型(Human Papillomavirus type 11,HPV-1I)。HPV-6bE7蛋白的表达成功可为疫苗的研制提供技术支持，也可作为感染干预性研究提供理论方法。目前临床上缺乏可靠的检测方法，HPV-6bE7蛋白抗体的发明可为HPV临床检测提供新的方法，同时为科学研究提供新的方法学基础。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供人乳头瘤病毒6bE7蛋白表达、纯化方法，通过以下步骤实现:
(1)"/v-份济7基因的调取及扩增:设\\HPV-6bE7的扩增引物，并从HPV-6b型全病毒质粒中有效扩增出该基因，其中用于扩增用于原核表达的///V-份济7序列的上游引物序列为SEQ ID N0.1:5，-GAATTCCGCTGCCTACACTGCTGGACAA C-3’，划线部分为 &oR I 酶切位点，下游引物序列为 SEQ ID N0.2:5，-CTCGAGCTACCTGAATCGTCCGCC ATCGTT-3’，划线部分为ZAo I酶切位点；
用于扩增用于真核表达的规序列的上游引物序列为SEQ ID N0.3:5，_GAATTCTATGCATGGAAGACATGTTACCC-3’，划线部分为&oR I酶切位点，下游引物序列为SEQ ID N0.4:5’ -GGATCCTTAGGTCTTCGGTGCGCAGAT-3’,划线部分为沒ag?H I 酶切位点；
(2)///V-份济7基因原核及真核表达载体的构建:将步骤(1)中得到的这两个含不同酶切位点的"/V-份济7基房序列按照先后顺序插入到载体pGEX-4T2和pEGFP-Cl中，获得用于后续实验的重组载体 pGEX-4T2-(HPV-6bE7)和 pEGFP_Cl_ (HPV_6bE7)；
(3)GST-(HPV-6bE7)融合蛋白的原核表达:将步骤(2)中构建的重组载体pGEX-4T2-(HPV-6bE7)转入大肠埃希菌DH5 α，待细菌OD值介于0.6-0.8之间，加IPTG至终浓度为0.2mM,并在26-28°C的诱导温度下，诱导4_6h后收集细菌，在250-300W超声功率下，超声时间9秒，间歇时间9秒，总时长约3min以破碎细菌，收集上清；
(4)GST-(HPV-6bE7)融合蛋白的纯化及HPV_6bE7蛋白的获得:通过(3)步骤获得的上清与Glutathione-Sepharose 4B磁珠(GE healthcare)结合，再用凝血酶(GEhealthcare)切除GST标签，获取HPV_6bE7蛋白，PBS透析过夜获得纯化的HPV_6bE7蛋白。
[0004] 本发明的另一个目的是提供人乳头瘤病毒6bE7蛋白在制备多克隆抗体中的应用。本发明获得的人类乳头瘤病毒HPV-11E7蛋白，通过免疫动物获得血清并经过纯化获得高特异性、高效价比的多克隆抗体，为进一步研究治疗尖锐湿疣奠定基础。
[0005]利用本领域周知的方法可以完成同源重组载体的构建，在引物的两端引入酶切位点，通过酶切产生粘性末端，可克隆到所需载体。所用标准的分子克隆过程见(J.萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2008.)。
[0006]大肠埃希菌DH5 α购于大连宝生物TaKaRa公司，pGEX_4T2原核表达载体购于GEhealthcare, HPV_6b型全基因质粒购于美国模式培养物集存库(American type culturecollection, ATCC)，293T细胞购于中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。
[0007]转化重组质粒至宿主细菌中可用通常的方法，如电穿孔、制备感受态细胞等。成功转化的细胞可通过人们熟知的技术加以鉴定，如细菌经收集并裂解，提取质粒，然后PCR鉴定、酶切鉴定或测序鉴定。
[0008]体外获得HPV_6bE7蛋白，是通过基因工程手段先在大肠埃希菌中进行原核表达GST-HPV-6bE7融合蛋白，经过纯化，并切除GST标签蛋白，最终得到HPV_6bE7蛋白。该蛋白在尖锐湿疣发病机制研究中极具前景，是HPV诊断试剂开发和疫苗研发的基础。
[0009]病毒蛋白一般具有不同程度的毒性，原核表达极容易形成不溶性的包涵体， 申请人:前期在大量的实验条件下，摸索可溶性蛋白的表达方式。后采用引入GST标签，并降低IPTG浓度，降低诱导时的温度，缩短诱导时间等措施。增加了该蛋白原核表达时的可溶性，从而降低下游大规模生产成 本以及分离纯化难度，在提高表达量的同时也有利于分离纯化，使该蛋白在工业化放大生产时降低难度，减少成本。为进一步研究治疗尖锐湿疣奠定基础。
[0010]HPV 6b型是引起尖锐湿疣的主要原因之一，目前的检测手段很有限，如PCR，容易造成假阳性，或假阴性。HPV-6b抗体的发明可通过免疫组化，免疫荧光，酶联免疫吸附反应等技术来检测HPV 6b型病毒的感染，并且可与PCR技术联用，来检测HPV 6b型的感染，能大大提高检测的准确率。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1为重组质粒pGEX-4T2-(HPV-6bE7)的电泳示意图。图中泳道Ml:TaKaRa DL15，000 DNA marker ;泳道1: HPV_6bE7基因(用PCR法从HPV_6b型全基因质粒中扩增得到);泳道 2:重组 pMD-18T-HPV-6bE7 质粒；泳道 3:重组 pMD-18T-HPV_6bE7 经 AcoR I 和Xho I酶切；泳道4: pGEX-4T2质粒；泳道5: pGEX_4T2质粒经I和沿ο I酶切；泳道 6:重组 pGEX-4T2-HPV-6bE7 ;泳道 7:重组 pGEX-4T2-HPV_6bE7 经FcoR I 和 ZAo I 酶切；泳道 M2:TaKaRa DL 2,000 DNA marker。
[0012]图2为重组质粒pEGFP-Cl-(HPV_6bE7)的电泳示意图。图中泳道Ml:TaKaRa DL15，000 DNA marker ;泳道1: HPV_6bE7基因(用PCR法从HPV_6b型全基因质粒中扩增得至丨J);泳道 2:重组 pMD-18T-HPV-6bE7 质粒；泳道 3:重组 pMD-18T-HPV_6bE7 经&oR I和I酶切；泳道4: pEGFP-Cl质粒；泳道5: pEGFP-Cl质粒经&oR I和I酶切；泳道 6:重组 pEGFP-Cl-(HPV-6bE7);泳道 7:重组 pEGFP-Cl-(HPV_6bE7)经&oR I和 I 酶切；泳道 M2 =TaKaRa DL 2, 000 DNA marker。(
图3为重组蛋白GST-HPV-6bE7诱导表达、纯化、酶切的PAGE分析。图中泳道M:蛋白预染marker ;泳道1:含pGEX_4T2质粒的细菌经诱导超声破碎后离心所得的上清；泳道2:含pGEX-4T2-6bE7质粒的细菌经诱导超声破碎后离心所得的上清；泳道3:纯化酶切后的HPV-6bE7蛋白；泳道4:透析后的HPV-6bE7蛋白。
[0013]图4为兔抗HPV_6bE7蛋白多克隆抗体的Western-Blot效价鉴定。图中泳道1:兔抗HPV-6bE7多克隆抗体(稀释比1:5000);泳道2:兔抗HPV_6bE7多克隆抗体(稀释比1:1000)。
[0014]图5为Western blotting检测HPV_6bE7在293T细胞中的表达。图中泳道1:293T ;泳道 2:293T 转染 pEGFP-Cl 质粒；泳道 3:293T 转染 pEGFP_Cl-HPV_6bE7 质粒。
[0015]图6为免疫荧光检测HPV_6bE7在293T细胞中的表达。
[0016]图7为免疫组化检测HPV_6bE7病理标本中的表达。图中白色箭头:未感染HPV-6bE7的细胞，黑色箭头:感染HPV-6bE7的细胞。
[0017]【具体实施方式】 本发明结合附图和具体实施例做进一步的说明。
[0018]实施例1:HPV 6b型E7基因原核表达载体的构建
用 PCR 方法从 HPV-6b purified plasmid DNA(ATCC:45150D)扩增出 HPV_6b 基因(SEQID N0.5)，所用的引物逆K-份?^7_P up (SEQ ID N0.1), HPV~6bE7J> dn (SEQ ID N0.2)由上海生工合成。用于原核表达的上下游引物分别引入&01? I和通O I酶切位点HPV-6bE7_? up:5’ -GAATTCCGCTGCCTACACTGCTGGACAAC-3’
HPV-6bE7_? dn:5’ -CTCGAGCTACCTGAATCG TCCGCCATCGTT-3，
PCR反应条件:50 μ L反应体系中，加入IyL HPV_6b全病毒基因质粒，20 μ mol/L的上下游引物各 I U L, 2.5mmol/L 的 dNTP mixture 4 μ L, 5XBuffer (Mg2+ plus) 10 μ L, rTaq聚合酶0.5 μ L，剩余用ddH20补足。用ABI公司的(型号为2720) PCR仪，PCR反应条件为94°C预变性5min ;94°C变性30s ;56°C退火30s ;72°C延伸30s，共40个循环以后，再72°C延伸7min。通过1.5%凝胶电泳分析得到预期为340bp的用与原核表达的HPV_6bE7序列(SEQID N0.6)。
[0019]将上述扩增的产物电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。连接至pMD?18-T Vector (TaKaRa:D101A)，转化入 DH5 α 后，铺于含 100 μ g/ mL Amp 的 LB 琼脂平皿，37°C培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种5mL含IOOyg/ mL Amp的LB液体培养基中，37°C培养过夜。用质粒抽提试剂盒提取pMD-18T-HPV-6bE7质粒，并用I和通ο I双酶切进行初步鉴定，阳性克隆送上海博尚进一步测序验证正确。
[0020]将测序正确的pMD-18T-HPV_6bE7 (原核)用I和Xho I双酶切，酶切后的产物电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。
[0021]原核表达质粒pGEX-4T2也用I和沿ο I双酶切，电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。以适当比例将上述线性PGEX-4T2和HPV-6bE7基因片段混合，用T4 DNA连接酶在16°C水浴中连接过夜。，转化入DH5a后，铺于含100 μ g/ mL Amp的LB琼脂平皿，37°C培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种5mL含100μ g/ mL Amp的LB液体培养基中，37°C培养过夜。用质粒抽提试剂盒提取pGEX-4T2-(HPV-6bE7)质粒，并用EcoR I和通ο I双酶切进行初步鉴定，阳性克隆送上海博尚进一步测序验证正确。从而完成HPV-6bE7基因原核表达载体的构建(见图1)。
[0022]实施例2:HPV 6b型E7基因真核表达载体的构建用 PCR 方法从 HPV-6b purified plasmid DNA (ATCC:45150D)扩增出 HPV_6b 基因，所用的引物规KM7_E up (SEQ ID N0.,HPV~6bE73 dn (SEQ ID N0.4)由上海生工合成。用于真核表达的上下游引物分别引入及I和ifeMl I酶切位点。
[0023] HPV-6bE73 即:5’ ~GAATTCTATGCATGGAAGACATGTTACCC~3?
HPV-6bE73 dn:5’ -GGATCCTTAGGTCTTCGGTGCGCAGAT-3，
PCR反应条件:50 μ L反应体系中，加入IyL HPV_6b全病毒基因质粒，20 μ mol/L的上下游引物各 I U L, 2.5mmol/L 的 dNTP mixture 4 μ L, 5XBuffer (Mg2+ plus) 10 μ L, rTaq聚合酶0.5 μ L，剩余用ddH20补足。用ABI公司的(型号为2720) PCR仪，PCR反应条件为94°C预变性5min ;94°C变性30s ;56°C退火30s ;72°C延伸30s，共40个循环以后，再72°C延伸7min。通过1.5%凝胶电泳分析得到预期为310bp的用于真核表达的HPV_6bE7序列(SEQID N0.7)。
[0024]将上述扩增的产物电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。连接至pMD?18-T Vector (TaKaRa:D101A)，转化入 DH5 α 后，铺于含 100 μ g/ mL Amp 的 LB 琼脂平皿，37°C培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种5mL含IOOyg/ mL Amp的LB液体培养基中，37°C培养过夜。用质粒抽提试剂盒提取pMD-18T-HPV-6bE7质粒，并用I和汉.Η I双酶切鉴定重组质粒，阳性克隆送上海生工进一步测序验证正确。
[0025]将测序正确的pMD-18T-HPV_6bE7 (真核)用&oR I和I双酶切，酶切后的产物电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。
[0026]真核表达质粒pEGFP-Cl也用I和I双酶切，电泳纯化后用DNA片段回收试剂盒回收纯化目的条带。以适当比例将上述线性pEGFP-Cl和HPV-6bE7基因片段混合，用T4 DNA连接酶在16°C水浴中连接过夜。转化入DH5a后，铺于含50yg/ mL kana的LB琼脂平皿，37°C培养过夜。挑选平皿上数个克隆接种5mL含50 μ g/ mL kana的LB液体培养基中，37°C培养过夜。用质粒抽提试剂盒提取pEGFP-Cl-(HPV-6bE7)质粒，并用EcoR I和及I双酶切进行初步鉴定，阳性克隆送上海博尚进一步测序验证正确。从而完成HPV-6bE7基因真核表达载体的构建(见图2)。
[0027]实施例3:HPV 6b型E7蛋白的诱导表达
pGEX-4T2-(HPV-6bE7)质粒分别转化至大肠杆菌DH5 α，接种于含氨苄青霉素(Amp)100 μ g/mL的LB培养液，待细菌OD值介于0.6-0.8之间，加IPTG至终浓度为0.2mM,诱导温度:26-28°C，诱导4-6h后收集细菌，冰浴超声裂解菌体，4°C 12000 rpm IOmin离心分离上清和沉淀，并经15%聚丙烯凝胶电泳鉴定(见图3)。
[0028]实施例4:HPV 6b型E7蛋白的纯化和酶切
取菌体上清与Glutathione-Sepharose 4B磁珠结合,再用凝血酶切除GST标签,获取HPV-6bE7蛋白，PBS透析蛋白过夜，并经聚丙烯凝胶电泳鉴定(见图3)。
[0029]实施例5:HPV 6b E7蛋白兔多克隆抗体的制备和纯化
用纯化后的HPV-6bE7蛋白免疫新西兰雌兔，体重为2.5kg为宜。初次免疫用含E7蛋白500 μ g的抗原完全弗氏佐剂乳化剂1.6mL于兔子背部多点皮内注射，以后每隔IOd用含E7蛋白500 μ g的抗原不完全弗氏佐剂乳化剂加强免疫3次。耳缘静脉采血，双向免疫扩散法测定血清中多价抗血清效价(I:8以上符合要求)。IOd后，E7蛋白500 μ g直接腹股沟区肌肉注射。5d后麻醉下心脏取血，分离血清后分装并置-20°C保存。血清按rPiOtein GAgaros说明书操作,亲和层析获得抗体IgG。
[0030] 实施例6:HPV 6b型E7多克隆抗体IgG的Western-Blot效价分析
将诱导表达的蛋白及牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)作为空白对照,经15% SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，5%脱脂奶粉封闭2h，以多个稀释滴度的兔抗HPV 6b型E7多克隆抗IgG为一抗、I:5000羊抗兔IgG-HRP为二抗进行免疫印迹，ECL显色。(见图4)实施例7:HPV 6b型E7蛋白多克隆抗体IgG的特异性鉴定(Western blot)
转染24h前将293T细胞以5父106个/1^浓度接种于IOcm的培养皿(含10%FBS和双抗的DMEM培养基、5%C02、37°C )。转染前，培养基换成无血清的DMEM。转染按Lipofectamine2000说明书操作，将质粒pEGFP-Cl、重组质粒pEGFP-Cl-(HPV_6bE7)各取10 μ g分别与20 μ I转染试剂Lipofectamine 2000在DMEM培养基中形成复合物，混合室温放置30min后覆盖于IOcm的培养皿，293T未转染细胞做转染空白对照。转染6h后，将培养基换成含10%FBS的DMEM，培养24h后，荧光显微镜下观察转染效率，终止转染。用RIPA细胞裂解液提取蛋白，用BCA试剂盒(碧云天)测蛋白浓度，以每孔40 μ g的总蛋白经95°C变性后5min后，以10% SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，5%脱脂奶粉封闭2h，以兔抗HPV 6b型E7多克隆抗IgG为一抗，稀释比1:5000,1:5000羊抗兔IgG-HRP为二抗进行免疫印迹，ECL显色。(见图5)
实施例8:HPV 6b型E7蛋白多克隆抗体IgG的特异性鉴定(免疫荧光)
转染24h前将293T细胞以2.5X IO5个/mL浓度接种于放有细胞爬片的6孔板(含10%FBS和双抗的DMEM培养基、5%C02、37°C )。转染前，培养基换成无血清的DMEM。转染按Lipofectamine 2000 说明书操作，将质粒 pEGFP-Cl、重组质粒 pEGFP-Cl-(HPV_6bE7)各取4ug分别与8 μ I转染试剂Lipofectamine 2000在DMEM培养基中形成复合物，混合室温放置30min后覆盖于6孔板中，293T未转染细胞做转染空白对照。培养24h后，荧光显微镜下观察转染效率，终止转染。将6孔板中的细胞爬片用PBS洗3遍后依次4%多聚甲醛室温固定10min、0.l%TritonX-100室温孵育7min，期间PBS洗3遍，每次5min。置于4°C保存或进行免疫荧光分析。免疫荧光实验在暗盒中进行。取出上述爬有293T细胞(未转染的作对照)盖玻片于10%山羊血清室温封闭2h，I:500 (5%山羊血清稀释)的HPV-6bE7兔多克隆抗体IgG为一抗4°C孵育过夜，1:500 (5%山羊血清稀释)的Alexa Flour555羊抗兔IgG为二抗室温孵育IhjjygAil DAPI染色8min，期间用PBS洗3遍每次5min。封片后荧光显微镜观察(见图6)
实施例9:HPV 6b型E7蛋白多克隆抗体IgG的特异性鉴定(免疫组化)
收集临床尖锐湿疣标本，通过RT-PCR鉴定HPV感染的类型。取HPV 6b型阳性的组织，通过包埋，切片，烤片，脱蜡，抗原修复(柠檬酸缓冲液)，血清封闭。一抗(1:500)，4°C孵育过夜。PBS洗三次后，滴加二抗(1:1000)，室37°C静置lh，PBS再洗三次后，DAB显色5_10min。自来水冲洗IOmin,苏木精复染,盐酸酒精分化，自来水再冲洗lOmin。脱水后封片镜检。
【权利要求】
1.人乳头瘤病毒6bE7蛋白表达纯化方法，通过以下步骤实现: (1)"/v-份济7基因的调取及扩增:设\\HPV-6bE7的扩增引物，并从HPV-6b型全病毒质粒中有效扩增出该基因，其中用于扩增用于原核表达的///V-份济7序列的上游引物序列为SEQ ID N0.1:5，-GAATTCCGCTGCCTACACTGCTGGACAA C-3’，划线部分为 &oR I 酶切位点，下游引物序列为 SEQ ID N0.2:5，-CTCGAGCTACCTGAATCGTCCGCC ATCGTT-3’，划线部分为ZAo I酶切位点； 用于扩增用于真核表达的规序列的上游引物序列为SEQ ID N0.3:5，_GAATTCTATGCATGGAAGACATGTTACCC-3’，划线部分为&oR I酶切位点，下游引物序列为SEQ ID N0.4:5’ -GGATCCTTAGGTCTTCGGTGCGCAGAT-3’，划线部分为沒ag?H I 酶切位点； (2)///V-份济7基因原核及真核表达载体的构建:将步骤(1)中得到的这两个含不同酶切位点的"/V-份济7基房序列插入到载体pGEX-4T2和pEGFP-Cl中，获得用于后续实验的重组载体 PGEX-4T2-(HPV-6bE7)和 pEGFP-Cl-(HPV_6bE7)； (3)GST-(HPV-6bE7)融合蛋白的原核表达:将步骤(2)中构建的重组载体pGEX-4T2-(HPV-6bE7)转入大肠埃希菌DH5 α，待细菌OD值介于0.6-0.8之间，加IPTG至终浓度为0.2mM,并在26-28°C的诱导温度下，诱导4_6h后收集细菌，在250-300W超声功率下，超声时间9秒，间歇时间9秒，总时长约3min以破碎细菌，收集上清； (4)GST-(HPV-6bE7)融合蛋白的纯化及HPV_6bE7蛋白的获得:通过(3)步骤获得的上清与Glutathione-Sepharose 4B磁珠(GE healthcare)结合，再用凝血酶(GEhealthcare)切除GST标签，获取HPV_6bE7蛋白，PBS透析过夜获得纯化的HPV_6bE7蛋白。
2.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒6bE7蛋白表达纯化方法，其特征在于，在设计蛋白表达载体时，选择含GST标签的pGEX-4T2，有利于蛋白表达的可溶性，且在蛋白纯化后，可将GST标签切除，使获得的蛋白更接近天然HPV-6bE7蛋白，在诱导蛋白表达时为避免形成不可溶的包涵体，采取了优化IPTG浓度，诱导时间，降低了诱导温度等措施。
3.根据权利要求1所述的人乳头瘤病毒6bE7蛋白表达纯化方法，其特征在于，步骤(I)、(2)、(3)中，大肠埃希菌宿主DH5 α、真核表达载体pEGFP_Cl购于大连宝生物TaKaRa，原核表达载体PGEX-4T2从GE health care公司购得，HPV_6b型全基因质粒购于美国模式培养物集存库。
4.根据权利要求1所述方法获得的人乳头瘤病毒6bE7蛋白在制备多克隆抗体中的应用。
【文档编号】C07K14/025GK103952427SQ201410194990
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月11日 优先权日:2014年5月11日
【发明者】程浩, 周强, 汤怡, 朱可建, 陈贤祯, 韩睿 申请人:浙江大学