一组用于鉴定拟谷盗类储粮害虫的引物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一组用于鉴定拟谷盗类储粮害虫的引物及其应用。本发明公开一组引物，为如下所示的引物对中的至少一种：(1)SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4所示的DNA分子组成的引物对；(2)SEQ?ID?No.5和SEQ?ID?No.6所示的DNA分子组成的引物对；(3)SEQ?ID?No.7和SEQ?ID?No.8所示的DNA分子组成的引物对。采用本发明的引物对检测6种常见拟谷盗类储粮害虫的方法，与传统形态鉴定方法相比，该方法不需要形态分类学基础且实现了对非成虫态的鉴定，而与其它分子生物学鉴定方法相比，该方法简化了鉴定拟谷盗类储粮害虫的分子检测步骤，具有操作简便、耗时较短、灵敏度高且较稳定，结果直观等特点，为进一步鉴定拟谷盗属近缘种的研究奠定了基础。
【专利说明】—组用于鉴定拟谷盗类储粮害虫的引物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一组引物及其应用；特别涉及一组用于鉴定拟谷盗类储粮害虫的引物及其应用，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]拟谷盗隶属于鞘翅目(Coleoptera)、拟步甲科(Tenebr1nidae)、拟谷盗属(Tribolium)，该属国内外共记述有30余种，其中为害储粮的拟谷盗约为10种，赤拟谷盗、杂拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗、弗氏拟谷盗和短角拟谷盗这6种在世界范围内分布较为广泛。
[0003]拟谷盗属Tribolium Macleayl825是鞘翅目储粮害虫中分布广泛、危害较重，具有重要经济意义的一个类群，在拟谷盗的已知种类中约有10种为储粮害虫，能为害面粉、谷物、玉米、豆类、油料作物等。除我国已报道的3种(赤拟谷盗、杂拟谷盗和弗氏拟谷盗)外，其余7种在我国尚无分布，具有一定的检疫重要性，应提高警惕。这类储粮害虫除直接取食为害外，其成虫体表的臭腺可分泌含苯醌等致癌物质的臭液，使被害物结块、变色、发臭而不能食用，造成严重的经济损失。近年来，随着国际贸易的日益频繁，我国口岸截获拟谷盗的次数也明显增多， 对国际贸易的影响日趋严重。面对严峻的国际贸易形势，加强检验检疫工作，对外来有害生物进行节流，抵御检疫性有害生物入侵显得越来越重要。建立方便、快捷、准确的有害生物分类方法对检验检疫工作是非常必要的，在进境植物检疫工作中，害虫的鉴定是一项重要的基础性工作，鉴定的准确性和所需时间直接影响到检疫决策。长期以来，昆虫鉴定都是以外部形态为依据，形态学鉴定虽然具有直观、简便、国际标注统一等优点，但却难以区分具有细微差异的近似种，尤其是非成虫态昆虫，如卵、幼虫和蛹等。拟谷盗因其个体较小(体长约2-7mm)，国内外形态学鉴定专家队伍急剧缩减等特点，开展成虫形态鉴定存在一定困难，非成虫态拟谷盗更是难以进行鉴定，给检疫工作造成很大困难。因此，储粮保护和检验检疫部门急需一种快速、准确、有效的鉴定方法来确定拟谷盗的种类，进而采取有效的害虫防治和检疫除害处理措施。利用现代分子生物学进行昆虫鉴定研究时，基因序列的信息代表了遗传本质，不受标本个体发育状态和环境条件影响，能够提供充分的可定量测度的进化信息，在不同的类群间有较好的可比性，是一种理想的共同尺度。
[0004]近几年发展起来的针对昆虫的分子生物学鉴定方法主要包括:随机扩增多态性DNA(RAPD)标记技术、限制性片段长度多态性(RFLP)分析技术、扩增片段长度多态性(AFLP)技术、单链构象多态性(SSCP)分析技术及特异引物PCR技术。相比较其他技术，特异引物PCR技术具有操作简便、灵敏度高、可重复性强等优点，是近缘种昆虫鉴定的理想方法。截至目前，未见应用特异引物PCR技术针对赤拟谷盗、杂拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗、弗氏拟谷盗和短角拟谷盗这6种世界常见拟谷盗类储粮害虫进行分子鉴定的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一组用于鉴定拟谷盗类储粮害虫的引物及其应用。
[0006]本发明提供一组引物，为如下(1)-(6)所示的引物对中的至少一种:
[0007](I) SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的DNA分子组成的引物对；
[0008](2) SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的DNA分子组成的引物对；
[0009](3) SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的DNA分子组成的引物对；
[0010](4) SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示的DNA分子组成的引物对；
[0011](5) SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12所示的DNA分子组成的引物对；
[0012](6) SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14所示的DNA分子组成的引物对。
[0013]上述引物中，所述引物由如下(1)-(6)所示的引物对组成:
[0014](I) SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的DNA分子组成的引物对；
[0015](2) SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的DNA分子组成的引物对；
[0016](3) SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的DNA分子组成的引物对；
[0017](4) SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示的DNA分子组成的引物对；
[0018](5) SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12所示的DNA分子组成的引物对；
[0019](6) SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14所示的DNA分子组成的引物对。
[0020]一种鉴定或辅助鉴定拟谷盗的试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒包含上述任一所述的引物；
[0021]所述拟谷盗为赤拟谷盗、杂拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗、弗氏拟谷盗和/或短角拟谷盗。
[0022]一种鉴定或辅助鉴定拟谷盗的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤:是以待鉴定的拟谷盗的基因组DNA为模板，分别以如下(1)-(6)任意所示的引物对为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果以如下⑴所示的引物对为引物得到的PCR扩增产物I为337bp，则待鉴定的拟谷盗候选为赤拟谷盗，如果以如下(2)所示的引物对为引物得到的PCR扩增产物2为238bp，则待鉴定的拟谷盗候选为杂拟谷盗，如果以如下(3)所示的引物对为引物得到的PCR扩增产物3为450bp，则待鉴定的拟谷盗候选为褐拟谷盗，如果以如下(4)所示的引物对为引物得到的PCR扩增产物4为490bp，则待鉴定的拟谷盗候选为黑拟谷盗，如果以如下(5)所示的引物对为引物得到的PCR扩增产物5为170bp，则待鉴定的拟谷盗候选为弗氏拟谷盗，如果以如下(6)所示的引物对为引物得到的PCR扩增产物6为354bp，则待鉴定的拟谷盗候选为短角拟谷盗:
[0023](I) SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的DNA分子组成的引物对；
[0024](2) SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的DNA分子组成的引物对；
[0025](3) SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的DNA分子组成的引物对；
[0026](4) SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示的DNA分子组成的引物对；
[0027](5) SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12所示的DNA分子组成的引物对；
[0028](6) SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14所示的DNA分子组成的引物对。
[0029]上述方法中，所述PCR扩增的体系中引物的浓度比均为1:1 ；
[0030]所述PCR扩增的程序中退火温度均为54°C。
[0031]上述任一所述的方法中，所述PCR扩增的体系均具体如下:2XPCR扩增缓冲液
12.5μ L, CldH2Ol0.5 μ L，模板 I μ L，浓度为 10 μ M 的引物各 0.5 μ L ；
[0032]所述2XPCR扩增缓冲液的商品名称具体为2XTaq PCR MasterMix，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；
[0033]所述PCR扩增的程序均具体如下:94°C预变性3min ;94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s, 35个循环；72°C反应1min0
[0034]上述任一所述的方法中，所述PCR扩增的体系中模板的质量> 0.1ng0
[0035]上述任一所述的引物在制备鉴定或辅助鉴定拟谷盗的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0036]上述试剂盒在鉴定或辅助鉴定拟谷盗中的应用也属于本发明的保护范围。
[0037]上述任一所述的应用中，所述拟谷盗为赤拟谷盗、杂拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗、弗氏拟谷盗和/或短角拟谷盗。
[0038]本发明设计并筛选出了针对6种常见拟谷盗类储粮害虫(赤拟谷盗、杂拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗、弗氏拟谷盗和短角拟谷盗)的特异引物对，采用本发明的引物对检测6种常见拟谷盗类储粮害虫的方法，与传统形态鉴定方法相比，不需要形态分类学基础且实现了对非成虫态的鉴定，而与其它分子生物学鉴定方法相比，该方法简化了鉴定拟谷盗类储粮害虫的分子检测步骤，具有操作简便、耗时较短、灵敏度高且较稳定，结果直观等特点，为进一步鉴定拟谷盗属近缘种的研究奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1为用于鉴定赤拟谷盗的引物对Tca33F26/Tca346R24的特异性检测结果。
[0040]图2为用于鉴定杂拟谷盗的引物对Tco261F23/Tco474R25的特异性检测结果。
[0041]图3为用于鉴定褐拟谷盗的引物对Tde25F20/Tde451R24的特异性检测结果。
[0042]图4为用于鉴定黑拟谷盗的引物对Tma41F22/Tma508R23的特异性检测结果。
[0043]图5为用于鉴定弗氏拟谷盗的引物对Tfr379F22/Tfr526R23的特异性检测结果。
[0044]图6为用于鉴定短角拟谷盗的引物对Tbr63F23/Tbr394R23的特异性检测结果。
[0045]图7为用于鉴定赤拟谷盗的引物对Tca33F26/Tca346R24的灵敏度检测结果。
[0046]图8为用于鉴定杂拟谷盗的引物对TC0261F23/TC0474R25的灵敏度检测结果。
[0047]图9为用于鉴定褐拟谷盗的引物对Tde25F20/Tde451R24的灵敏度检测结果。
[0048]图10为用于鉴定黑拟谷盗的引物对Tma41F22/Tma508R23的灵敏度检测结果。
[0049]图11为用于鉴定弗氏拟谷盗的引物对Tfr379F22/Tfr526R23的灵敏度检测结果。
[0050]图12为用于鉴定短角拟谷盗的引物对Tbr63F23/Tbr394R23的灵敏度检测结果。
【具体实施方式】
[0051 ] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0052]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0053]下述实施例中的赤拟谷盗(T.castaneum)涉及如下地理种群=Prague (捷克)种群、Rakovnik (捷克)种群、Osi jek (克罗地亚)种群、Bordeaux (法国)种群、Kansas (美国)种群、广东广州(中国)种群、河南许昌(中国)种群、广西北海(中国)种群、新疆阿克苏(中国)种群。
[0054]杂拟谷盗(T.confusum)涉及如下地理种群:Prague (捷克)种群、Herink (捷克)种群、Kyjov (捷克)种群、Bordeaux (法国)种群、Kansas (美国)种群；
[0055]褐拟谷盗(Τ.destructor)涉及如下地理种群:Prague (捷克)种群；
[0056]黑拟谷盗(T.madens)涉及如下地理种群=Kansas (美国)种群；
[0057]弗氏拟谷盗(T.freemani)涉及如下地理种群:Kansas (美国)种群；
[0058]短角拟谷盗(T.brevicornis)涉及如下地理种群:York(英国)种群。
[0059]上述6种拟谷盗类储粮害虫的各种群在文献“张生芳，周玉香.拟谷盗属重要种的分布、寄主及鉴别.植物检疫，2006:6(16).” “张生芳，刘永平.拟谷盗属赤拟谷盗组重要种的鉴定.植物检疫，1992:6(4).” “Angelini，D.R.,Jockusch,E.L.,2008.Relat1nships among pest flour beetles of thegenus Tribolium(Tenebr1nidae) inferred from multiple molecular markers.Molecular Phylogenetics and Evolut1n46, 12 7-141.” u MeS trovic,N., Mravinac, B., Plohl, M., Ugarkovic, D., Bruvo-Madaric, B., 2006.Preliminary
phylogeny of Tribolium beetles (Coleoptera:Tenebr1nidae)resolved by combinedanalysis of mitochondrial genes.European Journal of Entomologyl03, 709-715.，，文献中公开过，公众可从中国农业大学获得。
[0060]实施例1、针对6种拟谷盗类储粮害虫的特异引物的设计与合成
[0061]一、提取赤拟谷盗、杂拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗、弗氏拟谷盗和短角拟谷盗的各单头拟谷盗成虫胸部 (包括腿节)或单头非成虫态整个虫体的基因组DNA。
[0062]二、以步骤一得到的各基因组DNA为模板，以通用引物对LCO1490和HC02198为引物，进行PCR扩增，得到各拟谷盗的mtDNA COI基因序列，不同种扩增产物长度约为700bp。
[0063]PCR扩增体系(总体积为25 μ L):2XTaq PCR MasterMix (购自生工生物工程(上海)股份有限公司)12.5L，CldH2Ol0.5 μ L，浓度为50ng/ μ L的模板I μ L，浓度为10 μ M的LC01490 和 HC02198 各 0.5 μ L。
[0064]PCR 扩增程序:94°C预变性 3min ；94°C 30s,52°C 30s, 72°C 30s, 35 个循环；最后在72°C反应1min后结束。
[0065]LC01490:5’ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’ ； (SEQ ID N0.1)
[0066]HC02198:5，-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3，。(SEQ ID N0.2)
[0067]三、将步骤二 PCR扩增得到的不同种的拟谷盗的mtDNA COI基因序列进行测序，分别设计针对6种拟谷盗的特异引物，如表1所示。
[0068]表1 6种拟谷盗类储粮害虫的特异引物
[0069]
【权利要求】
1.一组引物，为如下(1)-(6)所示的引物对中的至少一种: (1)SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的DNA分子组成的引物对； (2)SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的DNA分子组成的引物对； (3)SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的DNA分子组成的引物对； (4)SEQ ID N0.9 和SEQ ID N0.10所示的DNA分子组成的引物对； (5)SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12所示的DNA分子组成的引物对； (6)SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14所示的DNA分子组成的引物对。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于:所述引物由如下(1)-(6)所示的引物对组成: (1)SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的DNA分子组成的引物对； (2)SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的DNA分子组成的引物对； (3)SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的DNA分子组成的引物对； (4)SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示的DNA分子组成的引物对； (5)SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12所示的DNA分子组成的引物对； (6)SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14所示的DNA分子组成的引物对。
3.一种鉴定或辅助鉴定拟谷盗的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1或2所述的引物。
4.一种鉴定或辅助鉴定拟谷盗的方法，包括如下步骤:是以待鉴定的拟谷盗的基因组DNA为模板，分别以如下(1)-(6)任意所示的引物对为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果以如下(I)所示的引物对为引物得到的PCR扩增产物I为337bp，则待鉴定的拟谷盗候选为赤拟谷盗，如果以如下(2)所示的引物对为引物得到的PCR扩增产物2为238bp，则待鉴定的拟谷盗候选为杂拟谷盗，如果以如下(3)所示的引物对为引物得到的PCR扩增产物3为450bp，则待鉴定的拟谷盗候选为褐拟谷盗，如果以如下(4)所示的引物对为引物得到的PCR扩增产物4为490bp，则待鉴定的拟谷盗候选为黑拟谷盗，如果以如下(5)所示的引物对为引物得到的PCR扩增产物5为170bp，则待鉴定的拟谷盗候选为弗氏拟谷盗，如果以如下(6)所示的引物对为引物得到的PCR扩增产物6为354bp，则待鉴定的拟谷盗候选为短角拟谷盗: (1)SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示的DNA分子组成的引物对； (2)SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6所示的DNA分子组成的引物对； (3)SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.8所示的DNA分子组成的引物对； (4)SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.10所示的DNA分子组成的引物对； (5)SEQ ID N0.11和SEQ ID N0.12所示的DNA分子组成的引物对； (6)SEQ ID N0.13和SEQ ID N0.14所示的DNA分子组成的引物对。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述PCR扩增的体系中引物的浓度比均为 1:1 ; 所述PCR扩增的程序中退火温度均为54°C。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述PCR扩增的体系中模板的质量^ 0.1ng0
7.权利要求1或2所述的引物在制备鉴定或辅助鉴定拟谷盗的产品中的应用。
8.权利要求3所述的试剂盒在鉴定或辅助鉴定拟谷盗中的应用。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于:所述拟谷盗为赤拟谷盗、杂拟谷盗、褐拟谷盗、黑拟谷盗 、弗氏拟谷盗和/或短角拟谷盗。
【文档编号】C12N15/11GK104164431SQ201410423201
【公开日】2014年11月26日 申请日期:2014年8月26日 优先权日:2014年8月26日
【发明者】李志红, 王一椒 申请人:中国农业大学