一种研究苦参碱抑制白色念珠菌粘附黏膜上皮细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，更具体地讲，涉及一种研究苦参碱抑制白色念珠菌粘附的方法。
【背景技术】
[0002]已有文献报道苦参碱对白色念珠菌生物膜具有体外抑制作用，采用白色念珠菌标准菌株ATCC76615为研究对象，经不同浓度苦参碱预处理后以及不同浓度苦参碱干预下，在体外和刮取脱落的人口腔黏膜上皮细胞相互作用，固定后经革兰氏染色，显微镜下计算粘附细胞数。
[0003]现有技术的研究方法未能从分子生物学角度分析苦参碱对白色念珠菌粘附能力的抑制作用，缺乏苦参碱对白色念珠菌粘附相关基因的研究。并且，现有技术刮取的是人口腔黏膜脱落上皮细胞，而不是具有生命力的人口腔黏膜上皮细胞。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种研究苦参碱抑制白色念珠菌粘附黏膜上皮细胞的方法。
[0005]本发明的第二个目的在于提供一种白色念珠菌/ 口腔黏膜上皮细胞共培养模型的建立方法。
[0006]本发明的第三个目的在于提供一种白色念珠菌/ 口腔黏膜上皮细胞共培养模型。
[0007]为实现以上第一个目的，本发明公开以下技术方案:一种研究苦参碱抑制白色念珠菌粘附黏膜上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤:
(1)建立白色念珠菌/口腔黏膜上皮细胞共培养模型；
(2)苦参碱药物干预；
(3)显微镜下观察苦参碱对白色念珠菌粘附口腔黏膜上皮细胞的抑制作用；
(4)通过RT-PCR技术研究苦参碱对白色念珠菌粘附相关基因ALS1/ALS4表达的影响。
[0008]作为一个优选方案，步骤(I)包括在永生化口腔黏膜上皮细胞中分别加入IXlO5/HiL白色念珠菌菌悬液进行共培养，所述菌悬液与永生化口腔黏膜上皮细胞培养液的体积比为 1:100。
[0009]为实现以上第二个目的，本发明公开以下技术方案:一种白色念珠菌/ 口腔黏膜上皮细胞共培养模型的建立方法，包括以下步骤:在永生化口腔黏膜上皮细胞中分别加入I X 1VmL白色念珠菌菌悬液进行共培养，所述菌悬液与永生化口腔黏膜上皮细胞培养液的体积比为1:100。
[0010]本发明的优点在于:(1)白色念珠菌/ 口腔黏膜上皮细胞共培养模型的建立，模拟口腔白色念珠菌感染模式。(2)通过RT-PCR技术研究苦参碱对白色念珠菌粘附相关基因ALS1/ALS4表达的影响。
【附图说明】
[0011]图1为永生化口腔黏膜上皮细胞培养3天倒置显微镜下观察(X100)。
[0012]图2为白色念珠菌ATCC76615培养48h倒置显微镜下观察(X 400)。
[0013]图3为白色念珠菌粘附人口腔黏膜上皮细胞，从左至右依次为:对照组；3.0 mg/ml苦参碱预作用组；3.0 mg/ml粘附过程中苦参碱干预组。
[0014]图4为苦参碱对白色念珠菌粘附人口腔黏膜上皮细胞数量的影响。
[0015]图5为l-8mg/mL苦参碱对ALS1/ALS4相对表达的影响。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
[0017]1、永生化口腔黏膜上皮细胞(H1EC)的复苏、传代培养:冻存细胞复苏，加入无血清K-SFM培养基制成细胞悬液，调整细胞密度为5X 105/mL接种入75 cm2培养瓶中置于5%的CO2培养箱内，每隔2-4天换液I次，传代培养，显微镜和透射电镜下进行细胞形态生长情况观察；当原代培养细胞达到接近融合状态时，加入0.25%胰蛋白酶液消化至细胞形态开始变圆时，加入无血清培养液终止消化，弯头吸管轻柔吹打使贴壁生长的细胞落入培养基中，制成细胞悬液，按1:3传代，37°C、5% CO2培养箱中，次日更换培养基，以后视细胞生长情况，每2-4天更换一次培养基。图1为永生化口腔黏膜上皮细胞培养3天倒置显微镜下观察(X100)。
[0018]白色念珠菌:冻存细胞复苏，接种于沙保氏琼脂培养皿上，37°C孵育2-3日，划线培养纯化，2-4天传代培养。细胞生长进入对数增殖期时，用RPM1-1640液体培养基制成细胞悬液，调整细胞浓度。图2为白色念珠菌ATCC76615培养48h倒置显微镜下观察(X 400)。
[0019]2、建立白色念珠菌/ 口腔黏膜上皮细胞共培养模型:在状态良好的H1EC中分别加入IX 105/mL白色念珠菌菌悬液(菌悬液与H1EC培养液的体积比为1:100)进行共培养，观察细胞形态、生长情况。
[0020]3、苦参碱药物干预:白色念珠菌/ 口腔黏膜上皮细胞共培养24h，加入不同浓度苦参碱溶液干预。
[0021]4、苦参碱干预下白色念珠菌粘附口腔黏膜上皮细胞数量的变化:镜下随机计数50个口腔黏膜上皮细胞的白色念珠菌黏附数。图3为白色念珠菌粘附人口腔黏膜上皮细胞，从左至右依次为:对照组；3.0 mg/ml苦参碱预作用组；3.0 mg/ml粘附过程中苦参碱干预组。图4为苦参碱对白色念珠菌粘附人口腔黏膜上皮细胞数量的影响。
[0022]5、苦参碱对白色念珠菌粘附相关基因影响的评价:RNase free条件下，使用Trizol试剂一步法提取苦参碱干预下白色念珠菌样本总RNA，纯化total RNA, RNA纯度检测，逆转录cDNA，针对ALS1/ALS4设计引物，FQ-PCR反应，cDNA的聚合酶链式扩增反应(PCR)产物电泳。应用数码成像系统对PCR电泳凝胶摄照。RT-PCR数据采用仪器自带软件分析。图5为l-8mg/mL苦参碱对ALS1/ALS4相对表达的影响。
[0023]本发明中白色念珠菌/ 口腔黏膜上皮细胞共培养模型的建立，模拟口腔白色念珠菌感染模式。通过RT-PCR技术研究苦参碱对白色念珠菌粘附相关基因ALS1/ALS4表达的影响。白色念珠菌具有很强的粘附和侵袭能力，白色念珠菌的粘附特性是其致病力的重要原因，也是其致病机制的重要组成部分。因此对粘附基因的研究不仅有助于更好地解读白色念珠菌的致病机制，而且也为研制新的抗真菌药物和真菌疫苗提供了理论依据。
[0024]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种研究苦参碱抑制白色念珠菌粘附黏膜上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)建立白色念珠菌/口腔黏膜上皮细胞共培养模型； (2)苦参碱药物干预； (3)显微镜下观察苦参碱对白色念珠菌粘附口腔黏膜上皮细胞的抑制作用； (4)通过RT-PCR技术研究苦参碱对白色念珠菌粘附相关基因ALS1/ALS4表达的影响。
2.根据权利要求1所述的一种研究苦参碱抑制白色念珠菌粘附黏膜上皮细胞的方法，其特征在于，步骤(I)包括在永生化口腔黏膜上皮细胞中分别加入I X 105/mL白色念珠菌菌悬液进行共培养，所述菌悬液与永生化口腔黏膜上皮细胞培养液的体积比为1:100。
3.一种白色念珠菌/ 口腔黏膜上皮细胞共培养模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤:在永生化口腔黏膜上皮细胞中分别加入IX 105/mL白色念珠菌菌悬液进行共培养，所述菌悬液与永生化口腔黏膜上皮细胞培养液的体积比为1:100。
4.利用权利要求3所述方法获得的白色念珠菌/口腔黏膜上皮细胞共培养模型。
【专利摘要】本发明公开一种研究苦参碱抑制白色念珠菌粘附黏膜上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）建立白色念珠菌/口腔黏膜上皮细胞共培养模型；（2）苦参碱药物干预；（3）显微镜下观察苦参碱对白色念珠菌粘附口腔黏膜上皮细胞的抑制作用；（4）通过RT-PCR技术研究苦参碱对白色念珠菌粘附相关基因ALS1/ALS4表达的影响。本发明的优点在于：（1）白色念珠菌/口腔黏膜上皮细胞共培养模型的建立，模拟口腔白色念珠菌感染模式。（2）通过RT-PCR技术研究苦参碱对白色念珠菌粘附相关基因ALS1/ALS4表达的影响。
【IPC分类】C12N1-20, C12N5-071, C12R1-725, C12Q1-68
【公开号】CN104862378
【申请号】CN201410062699
【发明人】吴岚
【申请人】上海交通大学医学院附属第九人民医院
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2014年2月25日