专利名称：特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY及其制备方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制药技术，具体涉及一种鸡卵黄免疫球蛋白IgG (IgY)药物的制备与临床治疗耐药性白色念珠菌感染的制剂。
背景技术：
近年来由于大量抗生素、激素、免疫抑制剂的应用，极易使机体内菌群失调或细胞、体液免疫应答抑制，引起白色念珠菌病，此外，烧伤、肿瘤、移植、哺乳婴儿，口腔黏膜病及爱滋病等患者，更由于其免疫功能处于低下状态，极易继发感染白色念珠菌。为此系统性念珠菌感染呈明显上升的趋势，尤以白色念珠菌感染为主，特别是耐药菌感染增多，其感染最常见部位是女性外阴及阴道，严重影响大多数被感染妇女的生殖健康、生活质量和婚姻关系。据报道，在美国所有外阴阴道炎症中，外阴阴道念珠菌病(VVC)发生率最高，约为 39%，主要致病菌是白色念珠菌，占85% 90%以上；另据统计，大约3/4的育龄妇女至少患过一次VVC，其中16%发病一次，再次发病84%，再次发病者中有35%发病6次以上；随着抗真菌药物的大量使用，致病真菌的耐药现象越来越普遍，耐药程度也越来越高，耐药性产生已成为临床念珠菌治疗失败的主要原因。因此，开发特异性抗耐药白色念珠菌IgY在阴道中的免疫预防及抗菌作用的产品，对保障妇女的健康，以及对上述免疫功能低下继发感染患者的免疫预防及治疗，具有现实意义。
发明内容
本发明的目的是针对上面所述缺陷，提供一种能治疗耐药性白色念珠菌感染的特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY。本发明的另一目的是提供一种特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY的制备方法与应用。特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY，其制备过程包括如下步骤。(1)制备高免疫原性耐药性白色念珠菌抗原筛选临床耐药性白色念珠菌，经药敏试验及PCR鉴定，纯培养后调整细胞浓度为(1 5) X106_8CFU/ml，并将其与等浓度白色念珠菌标准株按体积比(0.5 2) 1混合，制备出高免疫原性抗原混悬液。(2)免疫产蛋母鸡，追踪IgY抗体效价选用高产蛋的良种鸡，以氟氏不完全佐剂与步骤(1)所述抗原混悬液按体积比1 1混勻后，于蛋鸡皮下多点接种进行初次免疫， 共1. Oml/只，3周左右，再用步骤(1)所述抗原混悬液于蛋鸡腋静脉加强免疫1次，每次 0. 5ml/只，收集初次免疫1周后的鸡蛋，采用聚乙二醇法跟踪提取IgY，用ELISA法测定卵黄抗体效价，当IgY抗体效价> 1 2000，为有效蛋。(3)采用水稀释法制备特异性抗耐药白色念珠菌IgY 无菌取蛋黄去脂、打碎，加体积倍数为5 9倍蒸馏水稀释，用盐酸和氢氧化钠调pH至5. 2，置4°C静置6h，离心取上清，超滤浓缩，56°C下灭活病毒30min，即为IgY初提物(液态)，或再冷冻干燥得干粉，得到IgY初提物(固态)。优选的，步骤(1)中所述纯培养后调整细胞浓度为3 X 107CFU/ml，并将其与等浓度白色念珠菌标准株按体积比11混合。优选的，所述步骤(2 )选用美国高产蛋的良种莱昂鸡。优选的，步骤(2)所述IgY抗体效价> 1 2560，为有效蛋。优选的，所述步骤(3)中无菌取蛋黄去脂、打碎，加7倍蒸馏水稀释。所述步骤(2)中用抗原混悬液于蛋鸡腋静脉加强免疫1次后，可再隔3周加强免疫1次。本发明所述的特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY可采用于药剂学常规手段制备成剂型如泡腾片、栓剂、阴道海绵、洗液用于临床耐药白色念珠菌感染的治疗，特别适用于复发性白色念珠菌阴道炎的治疗。本发明的有益效果是鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)是一种由新鲜鸡蛋中提取的生物制品，对人体有重要的免疫保护作，以耐药性白色念珠菌为抗原免疫产蛋母鸡，应用水稀释法提取抗白色念珠菌卵黄抗体IgY，使其抗体效价> 1 2560。IgY对热及酸碱(pH3 11) 稳定性好，可抵抗胃酸屏障，并能抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化；对阴道黏膜无刺激， 对人类无致病作用，无急性和慢性毒性作用，无致畸、致癌作用，外用或口服无不良反应。
具体实施例方式下面通过实施例进一步对本发明进行说明，但实施例不限制本发明的权利要求范围。实施例1 特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY制备。( 1)制备高免疫原性耐药性白色念珠菌抗原筛选临床耐药性白色念珠菌，经药敏试验及PCR鉴定，纯培养后调整细胞浓度为1 X 106CFU/ml，并将其与等浓度白色念珠菌标准株按比例0.5 1混合，制备出高免疫原性抗原混悬液。(2)免疫产蛋母鸡，追踪IgY抗体效价选用高产蛋的良种莱昂鸡，以氟氏不完全佐剂与步骤(1)所述抗原混悬液混勻后，于蛋鸡皮下多点接种，共1. Oml/只，3周左右，再用步骤(1)所述抗原混悬液于蛋鸡腋静脉加强免疫1次，每次0. 5ml/只，必要时再隔3周加强免疫1次，收集初免1周后的鸡蛋，采用聚乙二醇法跟踪提取IgY，用ELISA法测定卵黄抗体效价，当IgY抗体效价> 1 2000，为有效蛋。(3)采用水稀释法制备特异性抗耐药白色念珠菌IgY 无菌取蛋黄去脂、打碎，加5 倍蒸馏水稀释，用盐酸和氢氧化钠调PH至5. 2，置4°C静置6h，离心取上清，超滤浓缩，56°C 下灭活病毒30min，即为IgY初提物(液态)，或再冷冻干燥得干粉，得到IgY初提物(固态)。实施例2 特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY制备。(1)制备高免疫原性耐药性白色念珠菌抗原筛选临床耐药性白色念珠菌，经药敏试验及PCR鉴定，纯培养后调整细胞浓度为3X 107CFU/ml，并将其与等浓度白色念珠菌标准株按比例1 1混合，制备出高免疫原性抗原混悬液。(2)免疫产蛋母鸡，追踪IgY抗体效价选用高产蛋的良种莱昂鸡，以氟氏不完全佐剂与步骤(1)所述抗原混悬液混勻后，于蛋鸡皮下多点接种，共1. Oml/只，3周左右，再用步骤(1)所述抗原混悬液于蛋鸡腋静脉加强免疫1次，每次0. 5ml/只，必要时再隔3周加强免疫1次，收集初免1周后的鸡蛋，采用聚乙二醇法跟踪提取IgY，用ELISA法测定卵黄抗体效价，当IgY抗体效价> 1 2560，为有效蛋。(3)采用水稀释法制备特异性抗耐药白色念珠菌IgY 无菌取蛋黄去脂、打碎，加7 倍蒸馏水稀释，用盐酸和氢氧化钠调PH至5. 2，置4°C静置6h，离心取上清，超滤浓缩，56°C 下灭活病毒30min，即为IgY初提物(液态)，或再冷冻干燥得干粉，得到IgY初提物(固态)。实施例3 特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY制备。(1)制备高免疫原性耐药性白色念珠菌抗原筛选临床耐药性白色念珠菌，经药敏试验及PCR鉴定，纯培养后调整细胞浓度为5X 108CFU/ml，并将其与等浓度白色念珠菌标准株按比例2 1混合，制备出高免疫原性抗原混悬液。(2)免疫产蛋母鸡，追踪IgY抗体效价选用高产蛋的良种莱昂鸡，以氟氏不完全佐剂与步骤(1)所述抗原混悬液混勻后，于蛋鸡皮下多点接种，共1. Oml/只，3周左右，再用步骤(1)所述抗原混悬液于蛋鸡腋静脉加强免疫1次，每次0. 5ml/只，必要时再隔3周加强免疫1次，收集初免1周后的鸡蛋，采用聚乙二醇法跟踪提取IgY，用ELISA法测定卵黄抗体效价，当IgY抗体效价> 1 2560，为有效蛋。(3)采用水稀释法制备特异性抗耐药白色念珠菌IgY 无菌取蛋黄去脂、打碎，加9 倍蒸馏水稀释，用盐酸和氢氧化钠调PH至5. 2，置4°C静置6h，离心取上清，超滤浓缩，56°C 下灭活病毒30min，即为IgY初提物(液态)，或再冷冻干燥得干粉，得到IgY初提物(固态)。实施例4。取实施例2制备的特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY (固态)加入药剂学泡腾片常用酸、碱、填充剂、润滑剂，采用干法制粒制备成特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY阴道泡腾片。该制剂用于抗妇女阴道白色念珠菌特别是耐药白色念珠菌感染，剂量 (IgY含量)2 mg/片，每日一次，一次一片，3 7天为一疗程。其中制粒工艺还可以采用酸碱分别制粒的方式进行。实施例5。取实施例2制备的特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY (固态)加入熔融的药剂学常用基质如甘油明胶中，混合均勻，采用倾入涂有润滑剂的栓剂模具模孔中至稍溢出模口为度，冷却，待完全凝固后，用刀切去溢出部分，开启模具，将栓剂推出，包装即得特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY阴道栓。该制剂用于抗妇女阴道白色念珠菌特别是耐药白色念珠菌感染，剂量(IgY含量)2 ;3mg/个，每日一次，一次一个，3 7天为一疗程。实施例6。取实施例2制备的特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY (液态)，以医用乳胶或医用聚氨酯为材料制成的阴道海绵载体上吸附，以剂量调整吸附量，包装即得特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY阴道海绵。该制剂用于抗妇女阴道白色念珠菌特别是耐药白色念珠菌感染，剂量(IgY含量)2 ;3mg/只，每日一次，一次一只，3 7天为一疗程。实施例7。取实施例1 3制备的特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY (液态)，以药用纯化水稀释，加入稳定剂，加入药用香精及色素调整感官，最后以药用纯化水稀释至IgY浓度为lmg/ml，制成特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY洗液。该制剂用于抗妇女阴道白色念珠菌特别是耐药白色念珠菌感染，直接取适量清洗患处，每次3分钟，3 7天为一疗程。实施例8。取实施例1 3制备的特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY，测定其体外活性和稳定性。(1)特异性抗耐药白色念珠菌IgY体外免疫活性测定采用ELISA法测定IgY抗体效价。(2)特异性抗耐药白色念珠菌IgY体内免疫活性测定选用BALb/c小鼠，造成其免疫功能低下模型后，先用特异性抗耐药白色念珠菌IgY，再用白色念珠菌阴道功击感染， 并观察阴道特异性抗耐药白色念珠菌IgY的保护作用。(3) IgY稳定性研究。a.室温和冷冻保存稳定性试验将IgY溶液(加0. 2%叠氮钠》5°C水浴保存和(或) IgY干粉室温保存，分别存放6、5、4、3、2、1个月；IgY干粉冷冻保存1年以上，测定其抗体活性(间接ELISA法，下同)。b.热稳定试验将IgY分别置25、37、45、56、60、70、80、95°C水浴中，分别加热5、 10、15min后，测其抗体活性。c.酸碱稳定性试验将IgY置pH值为3 11，37后中和，测定其抗体活性。d.胰蛋白酶消化试验在IgY溶液中加入胰酶溶液(即E/D=l/20)，37°C，l^i后， 测定其抗体活性。以上测试结果表明特异性抗耐药白色念珠菌IgY抗体效价> 1 2560 ；对热及酸碱(PH3 11)稳定性好，可抵抗胃酸屏障；能抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化；对 BALb/c小鼠阴道感染白色念珠菌保护率在90%以上。实施例9。按实施例4制备特异性抗耐药白色念珠菌IgY及其制剂进行临床前主要实验，包括药效学试验、毒理学实验、质检实验、稳定性实验、致畸实验及90余例临床白色念珠菌阴道炎患者(知情同意)试用，结果表明本发明安全可靠(动物最大耐受量为人体临床用量的 1000倍以上)，临床效果优于同类产品(咪康唑栓剂、克霉唑栓剂、制霉菌素栓剂、达克宁栓剂)，特别适用于复发性(耐药)白色念珠菌阴道炎患者。
权利要求
1.特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体igY，其特征在于采用包括如下步骤的制备方法制得(1)制备高免疫原性耐药性白色念珠菌抗原筛选临床耐药性白色念珠菌，经药敏试验及PCR鉴定，纯培养后调整细胞浓度为(1 5) X106_8CFU/ml，并将其与等浓度白色念珠菌标准株按体积比(0.5 2) 1混合，制备出高免疫原性抗原混悬液；(2)免疫产蛋母鸡，追踪IgY抗体效价选用高产蛋的良种鸡，以氟氏不完全佐剂与步骤(1)所述抗原混悬液按体积比1 1混勻后，于蛋鸡皮下多点接种进行初次免疫， 共1. Oml/只，3周左右，再用步骤(1)所述抗原混悬液于蛋鸡腋静脉加强免疫1次，每次 0. 5ml/只，收集初次免疫1周后的鸡蛋，采用聚乙二醇法跟踪提取IgY，用ELISA法测定卵黄抗体效价，当IgY抗体效价> 1 2000，为有效蛋；(3)采用水稀释法制备特异性抗耐药白色念珠菌IgY无菌取蛋黄去脂、打碎，加体积倍数为5 9倍蒸馏水稀释，用盐酸和氢氧化钠调pH至5. 2，置4°C静置6h，离心取上清，超滤浓缩，56°C下灭活病毒30min，即为液态IgY初提物，或再冷冻干燥得干粉，得到固态IgY 初提物。
2.根据权利要求1所述的一种特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY，其特征在于 步骤(1)中所述纯培养后调整细胞浓度为3X107CFU/ml，并将其与等浓度白色念珠菌标准株按体积比1 1混合；所述步骤(3)中无菌取蛋黄去脂、打碎，加7倍蒸馏水稀释。
3.根据权利要求1所述的一种特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY，其特征在于 步骤(2)所述IgY抗体效价> 1 2560，为有效蛋。
4.根据权利要求1所述的一种特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY，其特征在于 所述步骤(2)中用抗原混悬液于蛋鸡腋静脉加强免疫1次后，再隔3周再加强免疫1次。
5.根据权利要求1所述的一种特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY，其特征在于 可制成包括泡腾片、栓剂、阴道海绵或洗液中的任一剂型。
6.权利要求1所述的一种特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)制备高免疫原性耐药性白色念珠菌抗原筛选临床耐药性白色念珠菌，经药敏试验及PCR鉴定，纯培养后调整细胞浓度为(1-5) X 106_8CFU/ml，并将其与等浓度白色念珠菌标准株按体积比(0.5 2) 1混合，制备出高免疫原性抗原混悬液；(2)免疫产蛋母鸡，追踪IgY抗体效价选用高产蛋的良种鸡，以氟氏不完全佐剂与步骤(1)所述抗原混悬液按体积比1 1混勻后，于蛋鸡皮下多点接种，共1.0ml/只，3周左右，再用步骤(1)所述抗原混悬液于蛋鸡腋静脉加强免疫1次，每次0. 5ml/只，收集初免1 周后的鸡蛋，采用聚乙二醇法跟踪提取IgY，用ELISA法测定卵黄抗体效价，当IgY抗体效价 > 1 2000，为有效蛋；(3)采用水稀释法制备特异性抗耐药白色念珠菌IgY无菌取蛋黄去脂、打碎，加体积倍数为5 9倍蒸馏水稀释，用盐酸和氢氧化钠调pH至5. 2，置4°C静置他，离心取上清，超滤浓缩，56°C下灭活病毒30min，即为液态IgY初提物，或再冷冻干燥得干粉，得到固态IgY 初提物。
7.根据权利要求6所述的一种特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY的制备方法， 其特征在于步骤(1)中所述纯培养后调整细胞浓度为3X107CFU/ml，交将其与等浓度白色念珠菌标准株按体积比1 1混合；所述步骤(3)中无菌取蛋黄去脂、打碎，加7倍蒸馏水稀释。
8.根据权利要求6所述的一种特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY的制备方法， 其特征在于步骤(2)所述IgY抗体效价> 1 2560，为有效蛋。
9.根据权利要求6所述的一种特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY的制备方法， 其特征在于所述步骤(2)中用抗原混悬液于蛋鸡腋静脉加强免疫1次后，再隔3周再加强免疫1次。
10.权利要求1所述的一种特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY，其特征在于用于临床耐药白色念珠菌感染的治疗或用于复发性白色念珠菌阴道炎的治疗。
全文摘要
特异性抗耐药白色念珠菌鸡卵黄抗体IgY及其制备方法与用途，涉及一种生物制药技术。本发明制备高免疫原性耐药性白色念珠菌抗原，免疫产蛋母鸡，采用水稀释法提取IgY；该方法制备的IgY抗体效价＞1∶2560。IgY对热及酸碱(pH3～11)稳定性好，可抵抗胃酸屏障，并能抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化；对阴道黏膜无刺激，对人类无致病作用，无急性和慢性毒性作用，无致畸、致癌作用，外用或口服无不良反应。用于临床耐药白色念珠菌感染，特别适用于复发性白色念珠菌阴道炎。
文档编号C07K16/14GK102329392SQ20111028483
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月23日 优先权日2011年9月23日
发明者傅颖媛 申请人:傅颖媛