一种白念珠菌CaFUN30基因的用途及缺失CaFUN30基因的白念珠菌减毒株的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种白念珠菌CaFUN30基因的用途及缺失CaFUN30基因的白念珠菌减毒株。本发明提供一种白念珠菌CaFUN30基因的用途，用于制备白念珠菌减毒株，或者用于制备或筛选白念珠菌治疗药物。本发明成功构建了一种白念珠菌CaFUN30减毒株，并进一步提供了所述CaFUN30减毒株的构建方法，在本发明的减毒株中CaFUN30基因不表达，白念珠菌减毒株相对于野生型白念珠菌，其白-灰形态转换的效率大幅降低，从而降低了白念珠菌的毒性。
【专利说明】—种白念珠菌CaFUN30基因的用途及缺失CaFUN30基因的白念珠菌减毒株
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种白念珠菌CaFUN30基因的用途及缺失CaFUN30基因的白念珠菌减毒株。
【背景技术】
[0002]白念珠菌(Candida albicans)是一种临床上分离到的一种机会性人体致病真菌，特别在免疫下调的病人中，如器官移植病人，艾滋病毒感染者等，可以引起广泛的浅部和深部系统感染，感染部位包括口腔，女性阴道等，引起鹅口疮，阴道炎等，也可以侵入表皮和内皮细胞进入血液而到达内脏器官，如肾脏，脑部等，导致败血症，严重可以导致死亡(Odds, F.C.1994.J.Am.Acad, Dermatol.31: S2-S5.)。白念珠菌在不同的生长条件下，有不同的生长形态，包括菌体(yeast form),假菌丝(pseudohyphae),菌丝(hyphae)以及白菌(white cell),灰菌(opaque cell)。这种形态转化能力直接影响白念珠菌的致病能力(Odds, F.C.1985.Crit Rev Microb1l.12:45-93;Brown, A.J.P.et al.1999.Trends Microb1l.7:334-338.)。白菌和灰菌在不同的感染系统中致病性是不同的，白圃在系统感染中的致病性较强，而灰圃在表皮感染中致病性较强。首例临床的白念样本是从感染白念珠菌的骨髓移植病人的血液中分离到的W0-1菌株(Slutsky, et al.1985.Science.230:666-669;Slutsky, et al.1987.J Bacter1l.169，189-197.)。白念珠菌的白菌和灰菌形态是可以相互转换的，但是在实验室常规培养条件下，白念珠菌的白-灰形态之间的转换效率很低，只有大约10_4~10_5，(Rikkerink.et al.1988.JBacter1l.170，895-899)。许多培养条件可以影响白念珠菌的形态转换，包括UV，CO2, PH,温度，GlcNAc 等(Huang, et al.2009.Curr B1l.19:330-334;Huang, et al.2010.PLoSPathog.6:e1000806.Xie J.et al.2013.PLoS B1l.11 (3): e1001525.)。比如 22°C _24°C的低温能够促进白菌向灰菌转换，低温有助于维持灰菌细胞的状态，而当温度达到30°C时，细胞将几乎100%保持在白菌细胞状态。另外CO2以及GIcNAc单独作用和协同作用均能明显促进白-灰形态转换的效率。但是这些环境因素发挥功能均不能绕过Worl蛋白。
[0003]Worl是白念珠菌白-灰形态转换的关键的调控因子(Huang, et al.2006.Proc Natl Acad Sci USA.103:12813-12818.Zordan RE.2006.Proc Natl Acad SciUSA.103:12807-12812.)。Worl只在灰菌细胞中能够检测到3.9kb和2.5kb两个转录本。异位过表达Worl能够使细胞锁定在灰菌状态，敲除Worl则细胞呈现白菌状态。MTLa I/α 2复合体在Worl的启动子区域具有结合位点，因此能够抑制Worl蛋白的表达，但是当在MTLa和MTLa菌株中，即MTL a I/a 2复合体的抑制作用被解除之后，Worl蛋白的表达水平达到一定的阈值，就会结合到自身的启动子区域，从而激活并维持自身的表达，使细胞向灰菌状态转换。同时Worl也能结合到其它灰菌特异性基因以及灰菌抑制基因的启动子区域来调控白念珠菌的白-灰形态转换。例如WORl可以结合到W0R2和CZFl的启动子区域，诱导两者的表达，W0R2又能够反馈促进WORl的表达，这双重机制能够保证WORl的高表达水平。另外CZFl又可以通过抑制EFGl的表达转录间接的激活WORl的表达，从而建立一个循环调控网络，来维持细胞的状态(Zordan RE.2007.PLoS B1l.5:e256.)。但是Worl的调控网络里还有那些蛋白参与，研究的并不是很深入，调控的机制也不是很清楚。
【发明内容】
[0004]白念珠菌(Candida albicans)是一种人类常见的机会型致病真菌,能进行多种形态转变，包括酵母-菌丝转变和白-灰形态转变，这些形态变化的频率会在一定程度上影响白念珠菌的致病性。而Worl (White-Opaque Regulatorl)蛋白是白-灰形态转换的关键调控因子。通过酵母双杂交文库的筛选，本发明发明人发现了一种新的基因，该基因能够参与Worl蛋白对白-灰形态转换的调控网络。由于通过基因组序列分析发现该基因编码的蛋白序列与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)FUN30具有很高的序列同源性以及结构相似性，故命名为CaFUN30。
[0005]本发明的目的在于通过白念珠菌白-灰形态转换的调控因子CaFun30在白-灰形态转换效率和毒性表现中的功能作用的研究，公开CaFUN30基因在白念珠菌菌丝生长调控以及致病机理研究领域的用途，并构建获得一种白念珠菌减毒菌株。
[0006]本发明第一方面公开一种白念珠菌CaFUN30基因的用途,用于制备白念珠菌减毒株，或者用于制备或筛选白念珠菌治疗药物。
[0007]优选的，所述白念珠菌减毒株为CaFUN30基因不表达的白念珠菌cafun30/cafun30缺失株。
[0008]优选的，所述CaFUN30基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]优选的，所述CaFUN30基因含有如SEQ ID NO:1所示的基因序列。
[0010]更优选的，本发明所述cafun30/cafun30缺失株为白念珠菌的减毒株。在所述白念珠菌cafun30/cafun30缺失株中CaFUN30基因不表达。
[0011]本发明所述白念珠菌治疗药物为以CaFUN30基因为治疗靶基因，使CaFUN30基因不表达的药物、或者以CaFUN30基因表达的蛋白为拮抗对象的药物；或者以CaFUN30基因和其他基因共同作为靶基因加以沉默的药物。以CaFUN30基因为靶点，筛选或制备使该基因不表达的药物，用于降低白念珠菌白-灰形态转换率，从而使白念珠菌毒性减弱，以治疗白念珠菌感染。例如，该白念珠菌治疗药物可以通过RNA干扰或者基因重组的方法使CaFUN30基因不表达；或者通过制备CaFUN30蛋白拮抗剂，使CaFUN30基因表达的蛋白不发挥作用。
[0012]本发明第二方面提供一种白念珠菌减毒株，为白念珠菌cafun30/cafun30缺失株，所述减毒株中CaFUN30基因不表达。
[0013]优选的，所述白念珠菌cafun30/cafun30缺失株中，CaFUN30基因通过同源重组的方法敲除。
[0014]优选的，所述白念珠菌cafun30/cafun30缺失株与野生型白念珠菌相比，降低了白-灰形态转换的效率，从而降低了白念珠菌的毒性。
[0015]本发明第三方面提供所述的白念珠菌减毒株的构建方法，包括如下步骤:
[0016]I)单拷贝缺失株的构建:使用URA-BLAST敲除法，体外构建敲除质粒，所述敲除质粒中含有与CaFUN30开放阅读框同源的重组片段，并且该重组片段中含有HisG-URA3_HisG筛选片段；利用线性化的敲除质粒通过同源重组的方法敲除白念珠菌染色体上的一个CaFUN30拷贝，获得单拷贝缺失菌株；经鉴定正确的单拷贝缺失菌株通过URA3环出，筛选得到Ura-菌株；
[0017]2)双拷贝缺失株的构建:使用URA-BLAST敲除法，再次将线性化的敲除质粒转化AUra-菌株中，进行第二拷贝的敲除，得到fun30/fun30的双拷贝缺失菌株。
[0018]优选的，所述敲除质粒的构建方法具体包括如下步骤:利用PCR方法扩增出上下游基因序列300bp-700bp片段作为同源重组臂，将同源重组臂构建到载体上，再将hisG-URA3-hisG片段连接到载体上。
[0019]更优选的，所述同源重组臂，上游基因序列
[0020]引物FUN30UF:5，ccc AAGCTTGTCTTTTATGGAACTTCC3’ (SEQ ID NO:3)
[0021]引物FUN30UR:5，ccgGGATCCTTGAATGAAAATAAGTAATACCAGC3’ (SEQ ID NO:4)
[0022]从基因组上扩增出上游同源臂533bp，
[0023]下游基因序列
[0024]引物FUN30DF:5，cccGGTACCACAAAATAAGAAATGTACACATTTGAAGCTG3’ (SEQ ID NO:5)
[0025]引物F UN30DR:5，ccgGAATTCAATACTGTCAATCCACCACCACC3，(SEQ ID NO:6)
[0026]从基因组上扩增出下游同源臂366bp。
[0027]更优选的，所述载体为PMD18-T载体。
[0028]更优选的，所述hisG-URA3_hisG片段利用Bgl I1-BamH I从PCUB6载体上酶切回收，再连接到BamH I单酶切的构建好的载体上。
[0029]优选的，所述步骤I中，通过PCR以及Southern的方法鉴定单拷贝缺失菌株的阳性转化子。
[0030]优选的，所述步骤2中，通过Southern方法进行鉴定,得到fun30/fun30的双拷贝缺失菌株(此敲除株将CaFUN30基因的ORF全长(3294bp)用hisG-URA3_hisG序列替换，这样基因就被全部敲除了)。
[0031]本发明第四方面提供所述白念珠菌减毒株在研究白念珠菌发育及毒性功能中的应用，或者在制备或筛选白念珠菌治疗药物中的应用。
[0032]本发明的白念珠菌减毒株相对于野生型白念珠菌，其白-灰形态转换的效率大幅降低，从而降低了白念珠菌的毒性。
[0033]本发明成功构建了一种白念珠菌CaFUN30减毒株，并进一步提供了所述CaFUN30减毒株的构建方法，在本发明的减毒株中CaFUN30基因不表达。本发明发明人发现白念珠菌CaFun30蛋白与Worl蛋白在白念珠菌体内具有相互作用，这表明这个蛋白可能参与到Worl对白-灰形态调控的网络之中，其毒性相关基因CaFUN30和白念珠菌减毒株均可用于制备或筛选白念珠菌治疗药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1A显示了 CaFUN30基因敲除菌株的Southern blot鉴定策略。
[0035]图1B显示了第一条染色体上的CaFUN30基因敲除的鉴定图。JYCl (JYCl，MTLa/a野生型)为背景的敲除菌株中Fun30/fun301#及其环出URA3后的菌株均为正确敲除菌株，Fun30/fun304#整合出现问题，条带大小错误；CAI4(MTLa/a野生型)为背景的敲除菌株中Fun30/fun302#和3#及其环出URA3后的菌株均为正确整合菌株。
[0036]图1C显示了 CaFUN30第二拷贝基因敲除的Southern鉴定图。fun30/fun302#为JYCl背景下的正确敲除菌株。
[0037]图2显示了 CaFUN30对于白念珠菌白灰形态转换的功能研究。过表达CaFUN30促进了白菌形成灰菌的转换能力，而野生型JYCl、FUN30/fun30和fun30/fun30均没有明显的白灰形态转换的变化。
[0038]图3显示了 fun30/fun30敲除菌株的毒性研究。与SC5314(MTLa/ α野生型菌株)和JYCl (MTLa/a野生型菌株)这两种野生型相比，fun30/fun30敲除菌株对小鼠的毒性明显减弱了，表明CaFun30是一个影响白念珠菌毒性的因子。
[0039]图4显示了 CaFun30是核定位的蛋白。
【具体实施方式】
[0040]以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的【具体实施方式】加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0041]请参阅图1-4。需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。
[0042]本发明中的名字表述说明:白念珠菌FUN30基因用CaFUN30表示，在不会与酿酒酵母FUN30基因混淆的情况下也用FUN30表示，白念珠菌Fun30蛋白用CaFun30表示，在不会与酿酒酵母Fun30蛋白混淆的情况下也用Fun30表示，白念珠菌FUN30基因缺失株用cafun30/cafun30表示，在不会与酿酒酵母FUN30基因缺失株混淆的情况下也用fun30/fun30表不。
[0043]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆:实验室指南(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0044]基本实验方法:
[0045]1.白念珠菌基因组DNA抽提:
[0046]白念珠菌培养过夜用Iml ddH20洗I次，悬浮在500 μ I溶液A中(IM山梨醇，10mMEDTA ρΗ8.0)，加入2μ 120mg/ml的Zymolase，37。C放置I小时后，高速离心去上清，细胞用 500 μ I of TE buffer (20mM Tris.HCl pH7.5，ImM EDTA)洗一次，彻底重悬细胞沉淀，悬浮在 350 μ I of TE buffer 中，并加入 90 μ I of 溶液 B (250mM EDTA pH8.0, 400mMTris.HCl pH8.0，2%SDS)，65° C 放置 30min，加入 80 μ I of5M KAc，混匀，冰上放置 I 小时，高速离心5分钟，吸取上清并加入1ml的无水乙醇和50ul3M NaAc, -20° C放置20分钟使基因组DNA彻底沉淀，高速离心5分钟，沉淀用75%乙醇洗一次，离心后烘干。加入适量的水溶解DNA。
[0047]2.白念珠菌的转化:
[0048]首先是白念珠菌感受态细胞的制备，将过夜培养至饱和状态的菌进行转接到50ml新鲜的Yro培养基中，30°C继续培养5小时。收集细胞，用Iml的TE buffer洗细胞沉淀一次，离心弃上清，然后加入IXTE buffer和0.1M LiAc buffer重悬菌体，并静置5分钟，离心弃上清，此时就是白念珠菌的感受态细胞。准备PEG/LiAc溶液(pH7.5) 1ml ;在1.5ml Eppendof管中依次加入质粒(线形化质粒大约5 μ g), 10 μ 110mg/ml鱼精DNA,混匀；加入 0.1ml 感受态细胞和 0.6mlPEG/LiAc，Vortex 混匀；30°C 200rpm 培养 30min ;42°C热击22min ;冰浴~5min:6000rpm离心lmin,吸掉上清,用0.2mIddH2O重悬细胞；涂布于适当的营养缺陷的筛选SD平板上。
[0049]实施例1白念珠菌CaFUN30基因的异位过表达菌株的构建
[0050]由于在白念珠菌中FUN30基因为一个功能未知的新基因，并且我们是利用酵母双杂交文库筛选得到的能够与Worl相互作用的蛋白，所以为了检测CaFUN30是否也在白念珠菌的白-灰形态转换过程中发挥功能，我们首先构建了过表达FUN30的质粒。过表达CaFUN30质粒构建在BAl载体上，位于ADHl启动子下游，两端具有Ade2的同源重组臂(同源臂就包含在BAl载体中)(BAl载体构建方法见Ca0.et al., 2006.Mol B1lCelll7:295-307.)。利用 CGD 网站(http://www.candidagenome.0rg/)搜索得到白念珠菌中FUN30的基因全长序列(SEQ ID NO:1)，然后设计引物
[0051]FUN30F:5’ccgAGATCTATGAGTTGGTTTAGAAGAAATAAACCAACG3’ (SEQ ID NO:7)
[0052]FUN30R:5’cccGGTACCTCAACTATAAACTATTGACTCTAATGTTGAAATC3’ (SEQ ID NO:8)
[0053]从野生型菌株SC5314基因组中扩增FUN30的全长片段3294bp。利用Bgl I1-KpnI酶切后将FUN30全长连入BAl载体，将质粒用Asc I酶切成线性化，转入白念珠菌JYCl (MTLa/a型菌株)中进行同源重组，使得目的片段异位整合到Ade2区域进行表达。利用PCR的方法进行鉴定得到阳性转化子，PCR的具体方法为:利用PCR的方法将引物
[0054]Fun30F-1:5’GTGTCGGTATCAATTTAGTAGC3’ (SEQ ID NO:9)
[0055]Ade2F:5’CAACACCAATAATTGATGAAACTG3’(SEQ ID NO:10)
[0056]利用Tag酶扩增出1200bp大小的条带，即为阳性转化子。
[0057]实施例2白念珠菌CaFUN30基因的敲除菌株的构建
[0058]为了更全面的研究CaFUN30在白灰形态转换中的调控功能，我们在白念珠菌中对CaFUN30基因进行了敲除菌株的构建。利用5-F0A将hisG-URA3_hisG片段中URA3环出的方法进行基因的敲除，从而进行筛选得到互补营养缺陷的阳性克隆。首先在CGD上查找到FUN30的上下游基因序列，设计引物利用PCR方法扩增:
[0059]引物Fun30UF:5，ccc AAGCTTGTCTTTTATGGAACTTCC3’ (SEQ ID NO:3)
[0060]引物Fun30UR:5，ccgGGATCCTTGAATGAAAATAAGTAATACCAGC3’ (SEQ ID NO:4)
[0061]扩增出上游同源臂533bp。
[0062]引物FUN30DF:5，cccGGTACCACMMTMGMATGTACACATTTGMGCTG3’ (SEQ ID NO:5)
[0063]引物FUN30DR:5，ccgGAATTCAATACTGTCAATCCACCACCACC3，(SEQ ID NO:6)
[0064]扩增出下游同源臂366bp。
[0065]然后逐步把上游同源臂用Hind II1-BamH I酶切，下游同源臂用Kpn 1-EcoR I酶切,依次构建到PMD18-T载体上。利用Bgl I1-BamH I将hisG-URA3_hisG从PCUB6载体上酶切回收，连接到BamH I单酶切的构建好的载体上，然后进行鉴定，测序，得到正确构建的克隆。最后利用Hind III酶切质粒成线性化，转入白念珠菌JYCl (a/a型菌株)中进行同源重组，使得目的片段异位整合到FUN30基因区域。通过PCR
[0066]Fun30UF-1:5’GCATTGTCTCAAATAATCAAAACG3，(SEQ ID NO:11)
[0067]CaURA3NR:5’GTTTATACCATCCAAATCAATTCC3’(SEQ ID NO:12)
[0068]扩增出2kb大小的条带即为阳性转化子，然后再通过Southern的方法鉴定阳性转化子。经鉴定正确的第一拷贝敲除的菌株在含5-F0A和尿苷的SD平板上培养让hisG-URA3-hisG 片段中的 URA3 环出(Boeke et al.1984.Mol Gen Genet.197:345 - 346),筛选得到Ura-菌株。再次将线性化的敲除质粒转化入此Ura-菌株中，进行第二拷贝的敲除。最后利用Southern方法进行鉴定,得到fun30/fun30的敲除菌株。图1A显示了 CaFUN30基因敲除菌株的Southern blot鉴定策略，图1B显示为FUN30/fun30 Southern杂交分析鉴定的图谱和图1C显示为fun30/fun30 Southern杂交分析鉴定的图谱。
[0069]Southern分析方法:基因组DNA用Pvu II完全酶切，电泳完成后的琼脂糖胶分别用变性液和中和液浸泡45min，尼龙膜用双蒸水或5XSSC浸透，搭好转膜平台，胶与膜间用Parafilm封闭，加一个500g砝码。以5XSSC为转膜液转移过夜，第二天漂洗晾干紫外交联(C3程序即150MJ/cm2)。交联后的膜装入杂交管，加入5ml预杂交液(6XSSC，5Xdenhardt’ s Reagent,0.5% SDS, 100 μ g/ml 鱼精 DNA)于 65°C预杂交 lh，探针在 100°C变性 5min，加入 150μ I (约 I / 3 所标记的探针)65°C杂交 10_16h。0.1 X SSC, 0.1%SDS洗两到三次，每次30min,取出膜，晾干,磷屏显影5h。探针标记用Thermo Scientific的North2South B1tin Random Prime Labeling Kit 试剂盒(货号 17075),并按照其说明操作。将含25ng DNA的溶液于100° C加热变性5_10min，置于冰浴中。在管中加入1ulheptanucleotide mix和变性的DNA模板,沸水浴5min。迅速将变性的DNA溶液置于干冰/乙醇混合物上，冷却5min,再依次加入以下成分来准备样品溶液:10ul of5XdNTP mix,5ul of 10 X React1n Buffer, Iul Klenow fragment (Final Volume=50ul),轻轻振荡混匀样品，简单离心将液体收集到管底。将混好后的EP管置于37°C60min;探针于100° C变性5min冰上冷却后加入杂交体系中进行杂交。
[0070]实施例3CaFUN30基因的过表达和缺失对白念珠菌形态转换的影响
[0071]利用同源重组的方法对白念珠菌的CaFUN30基因进行敲除，通过PCR方法以及Southern方法鉴定得到了 fun30/fun30的正确敲除菌株(图1B，1C)。这也说明了 FUN30基因的敲除不会导致白念珠菌死亡。
[0072]为了证明FUN30基因在白灰形态转换方面的作用，我们进行了一系列的形态转换实验以及统计数据。将多种基因型的菌株从库中划到新鲜的YPD平板上，放于22°C条件下培养两天，然后挑取大约一个Colony大小的菌稀释于Iml ddH20,测0D_的值(0D_=0.1时，细胞的浓度是3 X106cell/ml )。然后进行100倍的浓度梯度稀释，取100-200ul细胞悬液(细胞总数在200-300个之间)涂于SD6.8+PhloxineB平板上，分别置于22°C空气条件下、230C +5%C02条件下进行培养5-7天，然后进行形态的数据统计和拍照。
[0073]与野生型菌株(WT+V)相比，过表达FUN30基因的菌株(WT+FUN30)在22°C空气条件，23°C，5%C02条件下均能明显的促进白菌向灰菌转换的效率。这表明Fun30对白念珠菌的白-灰形态转换具有调控作用。而fun30/fun30敲除菌株以及FUN30/fun30单拷贝敲除菌株与野生型菌株相比，在多种培养条件下，对白念珠菌的白-灰转换效率有一定程度的降低(图2和表1 )。通过DIC进行形态观察，从细胞的形态上也可以看出过表达FUN30能够促进白灰形态转换，这表明Fun30是一个白灰形态转换的正调控因子。
[0074]表1显示了统计意义上的CaFUN30对白念珠菌白灰形态转换的功能
[0075]
【权利要求】
1.一种白念珠菌CaFUN30基因的用途，用于制备白念珠菌减毒株，或者用于制备或筛选白念珠菌治疗药物。
2.权利要求1所述的白念珠菌CaFUN30基因的用途，其特征在于，所述CaFUN30基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。
3.如权利要求2所述的白念珠菌CaFUN30基因的用途，其特征在于，所述CaFUN30基因含有如SEQ ID NO:1所示的基因序列。
4.一种白念珠菌减毒株,为白念珠菌cafun30/cafun30缺失株,所述减毒株中CaFUN30基因不表达。
5.如权利要求4所述的白念珠菌减毒株，其特征在于，所述白念珠菌Cafun30/Cafun30缺失株中，CaFUN30基因通过同源重组的方法敲除。
6.如权利要求4所述的白念珠菌减毒株，其特征在于，所述白念珠菌Cafun30/Cafun30缺失株与野生型白念珠菌相比，降低了白-灰形态转换的效率。
7.如权利要求4-6任一权利要求所述的白念珠菌减毒株的构建方法，包括如下步骤: O单拷贝缺失株的构建:使用URA-BLAST敲除法，体外构建敲除质粒，所述敲除质粒中含有与CaFUN30开放阅读框同源的重组片段，并且该重组片段中含有HisG-URA3_HisG筛选片段；利用线性化的敲除质粒通过同源重组的方法敲除白念珠菌染色体上的一个CaFUN30拷贝，获得单 拷贝缺失菌株；经鉴定正确的单拷贝缺失菌株通过URA3环出，筛选得到Ura-菌株； 2)双拷贝缺失株的构建:使用URA-BLAST敲除法，再次将线性化的敲除质粒转化入Ura-菌株中，进行第二拷贝的敲除，得到fun30/fun30的双拷贝缺失菌株。
8.权利要求4-6任一权利要求所述白念珠菌减毒株在研究白念珠菌发育及毒性功能中的应用，或者在制备或筛选白念珠菌治疗药物中的应用。
【文档编号】C12R1/725GK104178429SQ201310192584
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月22日 优先权日:2013年5月22日
【发明者】陈江野, 高宁, 聂鑫怡, 王华峰, 鄢明辉 申请人:中国科学院上海生命科学研究院