白色念珠菌(C.Albicans)中的必需基因及用该基因筛选抗真菌物质的方法

专利名称：白色念珠菌(C.Albicans)中的必需基因及用该基因筛选抗真菌物质的方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选抗真菌物质方法，其中真菌中，特别是白色念珠菌(Candida A1bicans，C.Albicans)中的必需基因，以及其它病原体真菌中的功能相似基因，或者相应的编码蛋白被用作靶。本发明也涉及特定的白色念珠菌基因。
已知真菌感染的范围，从真菌侵蚀皮肤或者指甲到对内脏器官潜在的真菌感染；这种感染和由其造成的疾病被称为真菌病。
抗真菌物质(抑真菌的或者杀真菌的)被用于治疗真菌病。然而，直到现在，已知具有病理效果的这种物质相对很少，例如，两性霉素B(Amphotericin B)，制霉菌素(Nystatin)，匹马霉素(Pimaricin)，灰黄霉素(Griseofulvin)，克霉唑，5-氟-胞嘧啶(5-fluoro-cytosine)和Batraphene。药物治疗真菌感染非常困难，特别是因为宿主细胞和真菌都是真核细胞。因此，基于已知的抗真菌物质来用药，经常造成不希望有的副作用，例如，两性霉素B具有肾毒性的作用。所以，强烈地需求可用于制造药品的病理有效性物质，这样的药品适用于预防治疗免疫抑制状态或者是治疗已存在的真菌感染。另外，这种物质应当表现出特定的作用谱，以选择性的抑制真菌的生长和繁殖而并不影响被治疗的宿主生物。
本发明的目的是为了提供一种鉴别抗真菌物质的方法，尤其是用于鉴别抗念球菌属(Candida)物质的方法。该方法的必要特征是把真菌的必需基因作为筛选的靶。
因此本方法涉及一种筛选抗真菌物质的方法，其中该真菌的必需基因，或者是其它病原体真菌的功能相似基因，或者是相应的编码蛋白被用作靶，该必需基因选自CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325和CaJL039。
根据本发明这一方法的一种实施方案，将以不同水平表达其必需基因或者是功能相似真菌基因的真菌细胞与被测试物质一起保温，并测定该物质的生长抑制效果。
根据另一种实施方案，将该靶基因或者是该靶基因编码的相应蛋白，在体外与被测试物质接触并测定该物质对于靶的效果。
根据另一种实施方案，被筛选物质部分或者完全地抑制该必需基因的功能表达或者其编码蛋白的功能活性。
根据一种实施方案，被筛选物质部分或者完全地抑制二氢蝶酸合酶(dihydropteroate synthase)(DHPS)和/或7，8-二氢-6-羟甲基蝶呤-焦磷酸激酶(HPPK)的活性。
根据另一种实施方案，真菌的种选自担子菌属(Basidiomycetes)，子囊菌属(Ascomycetes)和丝孢菌属(Hyphomycetes)。
根据本发明这一方法的另一种实施方案，该功能相似基因是念珠菌属的种(Candida Spp.)，特别是白色念珠菌的必需基因，或者是曲霉属的种(Aspergillus Spp.)，特别是烟曲霉的必需基因。
根据另一方面，本发明涉及一种多核苷酸，其同系物和其功能片断，该多核苷酸具有SEQ ID No.2，SEQ ID No.4，SEQ ID No.6，SEQID No.7，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11或SEQ ID No.13所示的序列，优选具有SEQ ID No.2，SEQ ID No.4，SEQ ID No.6，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10或SEQ ID No.11所示的序列。
根据另一方面，本发明涉及一种基因或其功能相似基因或其功能片段，该基因是CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或者CaJL039，优选是CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102或者CaIR012。
根据这一实施方案，功能相似基因或者同源的多核苷酸，在核苷酸水平上，分别与CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或者CaJL039，有至少50％优选为至少60％，最优选为至少70％的序列同一性。其功能片断是一种多核苷酸片断，它保留了起始产物(核苷酸或基因)的功能性。一个实例就是CaOR110的剪接变体(它也与原始基因同源，具有大约90％的同一性)。
根据另一种实施方案，功能相似基因，在氨基酸水平上，分别与CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或者CaJL039编码的蛋白质，有至少40％，优选至少50％，更优选至少60％，最优选有至少70％的序列同一性。
就同源性和相似性而言，这些对基因的描述，加以必要的修正后也适用于多核苷酸。
根据另一方面，本发明包括分别由CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或CaJL039基因，或其功能相似基因编码的蛋白质或其功能性的多肽片段。
根据另一方面，本发明提供了一种分别含有CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或CaJL039基因，或其功能相似基因，或其功能片断的质粒。
根据另一方面，本发明提供了一种在1998年8月13日保藏于CNCM(巴斯德研究所，巴黎)的质粒(含有该质粒的细菌)，其编号为I-2065，I-2063和I-2064，分别对应CaNL256，CaBR102和CaIR012基因。
根据另一方面，本发明提供了一种在1999年8月6日保藏于DSMZ(德国微生物和细胞培养物保藏中心)的质粒(含有该质粒的细菌)，其编号为DSM12977，DSM12976，DSM12978和DSM12979，分别对应CaDR325，CaOR110，CaOR110剪接变体和CaMR212。
根据另一方面，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒可用于诊断真菌感染，所述试剂盒中包括选自CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325和CaJL039的基因，其功能相似基因，其功能片断，相应编码蛋白或者其功能性多肽片断。
根据另一方面，本发明提供了一种抗体，该抗体抗分别由CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或者CaJL039基因或其功能相似基因编码的蛋白质，或其多肽片断。
根据另一方面，本发明提供了一种多核苷酸，该多核苷酸可通过包括以下步骤的方法获得(i)从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中选择一种必需基因；(ii)比较该基因的序列与白色念珠菌的基因组序列；(iii)推断寡核苷酸同源区域；(iv)PCR扩增如此获得的寡核苷酸；(v)用步骤(iv)的扩增引物探测感兴趣的完整基因步骤(iv)的扩增引物被用作探针，从白色念珠菌的基因组库或者cDNA文库中探测感兴趣的完整基因；或者通过扩增引物3’-和5’-末端的延伸，例如用一种PCR方法来获得完整的基因。
根据本发明，第一步是鉴定所说的必需基因，由这些基因出发，可以鉴定其它病原体真菌中的必需基因。为了应用的目的，酿酒酵母中的必需基因被首先鉴定，由这些基因出发，得到其它病原体真菌，特别是念珠菌的必需基因。
于是，本发明公开了白色念珠菌中必需基因的鉴定，以及这些基因在一种筛选抗真菌物质，特别是抗念珠菌物质的方法中的用途。
为了鉴定酿酒酵母中的必需基因，通过同源重组消除单个的基因组基因。如果这样消除的DNA区断涉及必需基因，那么这样的缺失对于以单倍体形式存在的酿酒酵母细胞是致命的。
一种方法可以用于产生相应的基因组缺失的酿酒酵母，并且可以确定含有缺失的酿酒酵母细胞，该方法中所研究的酿酒酵母基因被标记基因所取代。
例如，显性选择性标记(例如，卡那霉素抗性基因)或者营养缺陷型标记可用作选择性标记。对于营养缺陷型标记，它可能使用编码氨基酸或者核酸碱基合成的关键酶的基因。例如，下列酿酒酵母的基因可被用作选择性标记编码亮氨酸代谢途径的基因(例如，LEU2-基因)，编码组氨酸代谢途径的基因(例如，HIS3-基因)，或编码色氨酸代谢途径的基因(例如，TRP-1-基因)，或者编码尿嘧啶核酸碱基代谢途径的基因(例如，URA3-基因)。
酿酒酵母的营养缺陷型菌株可以使用。这些营养缺陷型菌株只能在含有相应氨基酸或者核苷酸碱基的营养培养基上生长。例如，所有含有营养缺陷型标记的实验室酿酒酵母菌株都可以使用。当使用双倍体酿酒酵母菌株时，相应的标记基因必须被纯合突变。可以使用菌株CEN.PK2或其同基因的衍生物。
没有合适营养缺陷型标记的菌株也可以使用，例如原养型酿酒酵母菌株。因而可以使用显性选择性标记，例如象是卡那霉素抗性基因这样的抗性基因。loxP-KanMX-loxP盒可方便地用于这一目的。
为了用同源重组替换酿酒酵母基因的整个DNA序列或其部分，使用了DNA片断，其中，标记基因在5’-和3’-末端与所研究的酿酒酵母基因的5’-和3’-末端同源序列侧接。
可以使用不同的方法来制备相应的DNA片断，这些DNA片断适用于缺失任何特定的酿酒酵母基因。一种线性DNA片断被用于转化合适的酿酒酵母菌株。这种片断通过同源重组被整合到酿酒酵母基因组中。这种方法包括1.制备缺失盒的“传统方法”(Rothstein，R.J.(1993)酶学方法，Vol.101，202-211)。
2.使用PCR技术的“传统方法”(“经过修改的传统方法”)。
3.SFH(short flanking homology)-PCR方法(Wach，A.等(1994)酵母101793-1808；Gültner，U.等(1996)核酸研究242519-2524)。
1.在制备酿酒酵母基因组缺失盒的“传统方法”中，待研究基因或者已经存在于合适的载体中，或者被整合到这样的载体中。用这种方法，任何pBR-，pUC-和pBluescript@-衍生物都可用于实例。靶基因的一段重要部分被从载体中缺失，例如使用合适的限制性性酶切位点，但是载体中要保存待研究基因的3’-和5’-末端区域。选出的标记基因被整合到保留的区域之间。
2.在“经过修改的传统方法”中使用了PCR。这种方法可以扩增所研究的酿酒酵母基因编码序列3’-末端和5’-末端区域。这种方法可以选择性地扩增所研究基因的两个末端区域，因此，对每一个所研究基因，必须进行两次PCR反应，一次扩增5’-末端区域，一次扩增3’-末端区域。扩增末端DNA-片断的长度依赖于已存在的限制性酶切位点。被扩增的所研究基因末端的通常长度是50到5000碱基对(bp)，优选长度是500到1000bp。
酿酒酵母的基因组DNA或者野生型基因可被用作PCR反应的模板。构建引物对(有义引物和反义引物各一)，要使它们对应与所研究酿酒酵母基因的3’-末端和5’-末端序列。为了通过合适的限制性酶切位点整合，尤其要选择合适的引物。
pBR-pUC-，pBluescript-衍生物都可用作载体。已经含有编码选择性标记基因的载体是特别合适的。尤其是可以使用含有选择性标记HIS3，LEU2，TRP1或URA3基因的载体。
通过PCR获得的所研究酿酒酵母基因的DNA区段，被整合到载体中选择标记的两侧，于是随后，像在传统方法中那样，选择标记的两端与所研究基因的同源DNA序列末端侧接。
3.酿酒酵母中的同源重组以一种非常有效非常精确的方式进行，实际上，与选择性标记基因侧接的所研究酿酒酵母基因的同源DNA序列的长度，可以比“修改的传统方法”中的短许多。与所研究酿酒酵母基因同源的侧翼末端所需的长度只要大约20-60bp，优选为30-45bp。SFH-PCR方法是非常优越的，因为可以避免使用费力的克隆步骤。
PCR反应在含有要用到的选择性标记基因的DNA模板上进行，构建引物，使有义引物的DNA序列与选择性标记序列的5’-末端同源，引物的5’-末端还要多出最好40个核苷酸，这些多出的核苷酸要与所研究酿酒酵母基因的5’-末端序列相对应。反义引物以类似的方式构建，即反义引物与选择性标记基因序列的3’-末端互补，其中，该引物在其5’-末端还要多出一段最好也是40个核苷酸的区域，这段区域要与所研究基因的3’-末端编码序列的互补链相对应。
含有营养缺陷型标记基因或者选择性标记基因的载体，可以用于通过SFH-PCR方法扩增所研究的酿酒酵母基因。特别是质粒pUG6可用作模板。这种质粒含有一个loxP-KanMX-loxP盒(Gültner，U.等(1996)核酸研究242519-2524)。换句话说就是，卡那霉素抗性基因侧接在loxP序列(loxP-KanMX-loxP盒)的两端。这种盒非常优越，因为卡那霉素抗性基因可以通过将loxP-KanMX-loxP盒整合到所研究酿酒基因中，而最终从酿酒酵母基因组中除去。噬菌体P1的Cre-重组酶可用于这一目的。Cre-重组酶识别loxP序列并且通过同源重组过程诱导位于两段loxP序列之间的DNA的消除。结果，只有一个loxP序列保留下来，并且发生了所谓的标记再生，即酿酒酵母菌株可以用loxP-KanMX-loxP盒进行再次转化。当为了得到致死表型，而至少要缺失两个功能相似基因时，这一点便显得特别有利。
对于PCR方法来说，PCR反应引物在3’-末端优选有20个核苷酸长的序列，这段序列与位于loxP-KanMX-loxP盒左侧或者右侧的序列同源，而在5’-末端优选有40个核苷酸长的序列，这段序列与所研究基因的末端同源。
使用这三种方法，可以得到含有编码选择标记基因的线性缺失盒，该盒两端侧接有所研究基因的源序列。缺失盒被用于转化二倍体酿酒酵母菌株。二倍体酿酒酵母菌株CEN.PK2(Scientific Research&Development Gmbh，Oberursel)可用作这一目的的实例。CEN.PK2菌株用已知方法准备并培养(Gietz，R.D.等(1992)核酸研究81425；Gültner，U.等(1996)核酸研究242519-2524)。
根据已知方法，用合适DNA数量的线性缺失盒转化所用的酿酒酵母菌株的细胞(例如，Sambrook等1989)。之后，用一种新的所谓的选择培养基替换培养细胞的培养基，这种选择培养基不含有相应的氨基酸(例如，组氨酸，亮氨酸或者色氨酸)或者核苷碱基(例如，尿嘧啶)，或者当使用含有卡那霉素抗性基因的缺失盒时，用含有遗传霉素(G418)的培养基(例如，含有的遗传霉素的完全培养基(YEPD))替换培养细胞的培养基。另一种选择是，把转化的细胞接种到用相应培养基制备的琼脂平板上。从而，可以选择出在其中发生了同源重组的转化细胞，因为只有那些细胞可以生长在这种经修饰的条件下。
然而，在大多数情况下，在转化过程中，二倍体酿酒酵母菌株位于一对染色体的基因的两个拷贝中，只有一个被DNA缺失盒取代，从而产生了杂合子二倍体酿酒酵母突变株，其中所研究基因的一个拷贝被选择性标记取代，而基因的另一个拷贝仍保留在基因组中。这就体现了一种优越性，即因为存在必需基因的第二个拷贝，所以当万一缺失了一个必需基因时，酿酒酵母突变体仍可以存活。
缺失盒DNA在预定染色体基因座(所研究基因的基因座)的适当整合，可以通过Southern印迹分析(Southern，E.M.(1975)分子生物学杂志98503-517)或者使用特殊引物的诊断PCR分析(Gültner，U.等(1996)核酸研究242519-2524)来检查。
单个二倍体细胞的遗传分离可以通过四分体分析进行监控。为此，使用如氮贫乏的乙酸钾平板这样的已知方法，诱导二倍体细胞，特别是杂合子突变株，进行减数分裂。(Sherman，F.等(1986)冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Guthrie，C.和Fink，G.R.(1991)酶学方法，Vol 194.Academic Press，San Diego，3-21；Ausubel，F.M.等(1987)分子生物学最新方法John Wiley和Sons，Inc.，Chapter 13)。减数分裂造成只有四个子囊孢子的子囊(经过分离的)，在用酶解酶部分酶解子囊壁后，可以通过显微操作器(例如SINGER)得到单个的子囊孢子(Ausubel等(1987))。当对一杂合子二倍体突变株进行四分体分析时，该二倍体突变株一对染色体上的一个必需基因已经经同源重组被取代，只有两个分离的子囊孢子，即那些携带有必需基因的可以存活。其余两个分离的子囊孢子因为缺少该必需基因而不能存活。
为了检查通过这种方法研究的基因是否真的必需，以及同源重组是否导致一个必需基因的位置发生变化而与所研究基因的基因座相邻，酿酒酵母杂合子二倍体突变株用含有该研究基因的着丝粒质粒进行转化。
对转化体进行四分体分析。当得到四个而不是两个可存活分离子时，包含在着丝粒质粒中的所研究基因，可以弥补那两个不能存活的酿酒酵母单倍体细胞/突变株的缺陷，这就证明了所研究的酿酒酵母基因是必需的。
优选用拷贝数比较少，例如每个细胞有一到两个拷贝的质粒作为着丝粒质粒。例如质粒pRS313，pRS314，pRS315和pRS316(Sijkorski，R.S.和Hieter，P.(1989)遗传学12219-27)或者可用于这一目的的类似质粒。所研究基因优选是连同其3’-末端和5’-末端非编码区一起整合到所说的质粒中。
序列全部或者部分已知的各个酿酒酵母基因可以用上述方法进行研究。完整的酿酒酵母基因组序列于1996年4月24日通过WWW(国际互联网)对公众公开。
WWW上的酿酒酵母基因组DNA序列，可以通过不同的方式访问。
MIPS(慕尼黑蛋白质序列信息中心)地址http//speedy.mips.biochem.mpq.de/mips/yeast/SGD(糖酵母基因组数据库，斯坦福)地址speedy.mips.biochem.mpq.de/mips/yeast /YPD(酵母蛋白质数据库，冷泉港)地址speedy.mips.biochem.mpq.de/mips/yeast/
在欧洲(例如，在地址ftp.mips.embnet.org)，在美国(地址genome-ftp.stanford.edu)，在日本(地址ftp.nig.ac.jp)，完整的酿酒酵母DNA序列也可以通过FTP(file transfer protocol，文件传输协议)访问。
用这种方法已经鉴定了7种酿酒酵母基因组必需基因YDR325w，YJL039c，YOR110w，YNL256w，YBR102c，YIR012W和YMR212c。
然后酿酒酵母的必需基因被用来鉴定其它真菌相应的功能相似基因。
其它真菌中的功能相似基因，是指与所鉴定的酿酒酵母必需基因功能相似或相同的基因。其它真菌中的功能相似基因，可以但不是必须与相应的酿酒酵母必需基因序列同源。其它真菌中的功能相似基因，在核苷酸水平上，可以只表现出与相应的酿酒酵母必需基因中等程度的序列同源性。中等程度的序列同源，在本发明中是指，在核苷酸水平上要有至少50％的序列同一性，更优选有至少60％的序列同一性，最优选有至少70％的序列同一性。
另外，其它真菌中的功能相似基因，可以但不是必须编码与相应的酿酒酵母必需基因编码的蛋白质序列同源的蛋白质。其它真菌中的功能相似蛋白质，可以只表现出与相应的酿酒酵母必需基因编码的蛋白质中等程度的蛋白质序列同源性。
中等程度的蛋白质序列同源性，在本发明中是指，在氨基酸水平上要有至少40％的序列同一性，优选有至少50％的序列同一性，更优选有至少60％的序列同一性，最优选有至少70％的序列同一性。
序列同源基因可以通过已知方法分离，例如通过同源筛选(Sambrook，J.等(1989)分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约)，或者通过使用来自相应真菌基因组文库和/或cDNA文库的特殊引物的PCR技术。
根据一种实施方案，从cDNA文库中分离序列同源基因。为了找出其它真菌中的功能相似基因，根据已知方法从所研究真菌中分离出mRNA(Sambrook，等1989)，根据已知方法合成cDNA(Sambrook，等1989；或cDNA合成试剂盒，如STRATAGENE)。
制备的cDNA被定向整合到合适的表达载体中。
例如，考虑到表达载体的启动子，为了使随后的克隆可以适当的定位，第一条cDNA链的合成可以在具有适当限制性酶切位点的引物存在下进行。任何已知的限制性酶切位点可以用作限制性酶切位点。关于引物，可以使用50个核苷酸长的引物，例如以下引物5′-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTXXXXXXTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′序列(X)6表示适当的限制性酶切位点，例如XhoI的限制性酶切位点。
合成完双链之后，双链cDNA的粘性末端被补平(钝端)，然后cDNA末端用合适的DNA连接序列连接。DNA连接序列应当包含一个限制性酶切位点，该限制性酶切位点应当与在合成第一条cDNA链时使用的引物中的限制性酶切位点不同。DNA连接序列可以包含例如互补的9或13聚体寡核苷酸，其末端代表限制性酶切位点的粘性末端。例如，这样的末端可以是EcoRI-位点5′XXXXXGGCACGAG 3′3′XCCGTGCTC 5′连接序列中的单链X表示限制性酶切位点的粘性末端。
然后，用限制性内切酶酶切具有相应连接序列的cDNA，该限制性内切酶的识别位点被使用在合成第一条cDNA链时使用的引物中，例如XhoI。根据这个实例，如此得到的cDNA具有3’-XhoI和5’-EcoRI突出末端，所以可以被定向整合到经XhoI和EcoRI酶切的表达载体中。
在其它载体中，大肠杆菌/酿酒酵母穿梭载体，即在大肠杆菌和酿酒酵母都可以使用的载体，是合适的表达载体。这种载体可以在例如大肠杆菌中扩增。那些在酿酒酵母中具有高拷贝数的载体和具有低拷贝数的载体都可以用作表达载体。为了这一目的，例如，选自pRS423-pRS426(pRS423，pRS424，pRS425，pRS426)和/或pRS313-pRS316(pRS313，pRS314，pRS315，pRS316)(Sikorki，R.S.和Hieter，P.(1989)遗传学12219-27；Christianson T.W.等(1992)基因110119-122)的载体都是适合的。
表达载体应当含有合适的酿酒酵母启动子和终止子。万一这些载体不含有这些元件，那么相应启动子和终止子的插入应使得随后仍可能掺入所产生的cDNA。酿酒酵母基因MET25，PGK1，TPI1，TDH3，ADHI，URA3的启动子特别合适作启动子。可以使用未修饰形式的野生型基因的启动子，也可以使用经过除去某些激活子序列和/或阻抑蛋白序列方式而修饰过的启动子。例如，酿酒酵母基因MET25，PGK1，TPI1，TDH3，ADHI，URA3的终止子适合于作终止子。
根据另一种实施方案，从基因组文库中分离序列同源基因。可以根据已知方法制备真菌基因组DNA文库(例如象在分子生物学最新方法，John Wiley和Sons，Inc中所描述的)。例如，可以通过已知的裂解酵母细胞和分离基因组DNA的方法制备真菌基因组DNA(例如Bio101，Inc的商品试剂盒)。基因组DNA可以用限制性酶，例如Sau3AI，进行部分酶解，酶解片段用琼脂糖凝胶电泳进行大小选择。例如，5-10kb大小的DNA片段可以用经典方法纯化(例如使用Bio101的Gene Clean试剂盒)，并插入象是YEP24这样的经限制性酶切而具有匹配末端(例如，针对经Sau3AI酶切的基因组DNA的BamHI)的大肠杆菌/酿酒酵母穿梭载体(例如Sanglard D.，Kuchler K.，Ischer F.，Pagani J-L.，Monod M.和Bille J.，抗微生物药剂和化学疗法，(1995)Vol.39 No11，P2378-2386所描述的)。
为了从所研究真菌中发现与酿酒酵母必需基因功能相似的基因，一个酿酒酵母必需基因被置于可调节启动子的控制下，或者作为整合基因(1)或者作为染色体外基因(2)。
1.为了把可调节启动子整合到酿酒酵母基因组中，可以用可调节启动子替换选定的必需基因的天然启动子，例如可以用PCR进行同源重组(Güldener，U.等(1996)。用PCR进行同源重组可以在例如二倍体酿酒酵母菌株CEN.PK2中进行。是否成功地整合到染色体组中，可以通过在单倍体细胞中随后进行的四分体分析进行检测。
使用四分体分析可以得到四个存活的子囊孢子，在其中的两个单倍体分离子中，选定必需基因在天然启动子的控制之下，而在其余两个分离子中，必需基因在可调节启动子的控制之下。
最后提到的单倍体分离子被出现在重组载体中的cDNA或者基因组DNA转化。
2.使用染色体外变体，选定酿酒酵母必需基因首先被插入合适的表达载体中，例如大肠杆菌/酿酒酵母穿梭载体。为此，可以通过PCR，由酿酒酵母基因组DNA的起始密码子ATG开始直到并包括终止密码子来扩增必需基因。用于此目的的引物，可以用以下方式构建，使得它们包含适当限制酶的识别位点，并有利于随后插入后表达载体中可调节启动子的控制之下。
含有在可调节启动子控制之下的酿酒酵母必需基因质粒拷贝的重组表达载体，随后被用于相应突变等位基因的反式互补。相应突变等位基因可从杂合子二倍体突变株中选出，这些杂合子二倍体突变株是通过同源重组而部分或全部缺失以上所列举并描述的真菌必需基因所得到的。
含有选定酿酒酵母必需基因的表达载体，被转化到相应的杂合子二倍体突变株中，该突变株携带有选择标记基因，而不携带选定的酿酒酵母必需基因。转化体通过所用表达载体中的营养缺陷型标记选择分离。经转化的杂合子二倍体突变株随后进行四分体分析。可以得到四个存活的分离子。通过反向追踪突变等位基因和表达载体的相应标记，转化的野生型分离子可以与不含有必需基因基因组拷贝的分离子区分开。不含有选定必需基因基因组拷贝的分离子，被指定为反式互补单倍体突变株。它们随后被合适载体中的其它真菌的cDNA文库或者基因组DNA文库转化。
诱导型启动子或阻抑型启动子可以用作可调节启动子。这些启动子可以由天然和/或人工排列的启动子序列组成。
例如，GAL1基因的启动子和相应的启动子衍生物，比如缺失不同UAS(上游激活序列)元件的启动子(GALS，GALL；Mumberg，J.等(1994)核酸研究225767-5768)，可以用作可调节启动子。糖元异生基因的启动子，例如FBP1，PCK1，ICL1或者它们的部分，比如它们的激活序列(UAS1和/或UAS2)或者阻抑序列(URS，上游阻抑序列)(Niederacher等(1992)，Curr.Genet.22636-670；Proft等(1995)Mol.Gen.Gent.246367-373；Schller等(1992)EMBOJ；11107-114；Guarente等(1984)细胞36503-511)，也可以用作可调节启动子。
以这种方式修饰的酿酒酵母突变株，可以在可调节启动子被激活的生长环境中培养，使得酿酒酵母必需基因得以表达。接着，用含有所研究真菌cDNA或者基因组DNA的典型数量的文库转化酿酒酵母细胞。转化子将表达额外的蛋白质，这些蛋白质的编码序列存在于重组载体中。
本方法希望，为了抑制控制着选定必需基因的可调节启动子，生长条件可以进行修改。特别是，可以通过更换生长培养基来改变生长条件。例如，当使用GAL1启动子或其衍生物时，可以用含葡萄糖的培养基(抑制状态)替换含半乳糖的培养基(诱导状态)。
对于其重组载体中不含有所研究真菌的功能相似基因组DNA或cDNA的酿酒酵母细胞，这种经过修改的条件是致命的。相反的，其重组载体表达所研究真菌的功能相似编码序列的酿酒酵母细胞可以存活，因为在这些细胞中，功能相似基因编码的蛋白质弥补了致命的代谢缺陷。
本方法希望，使用已知的方法(Strathern，J.N.和Higgins，D.R.(1991).Plasmids are recovered from yeast into Escherichiacoli shuttle vectors inGuthrie，C.and Fink，G.R.酶学方法，Volume 194.酵母遗传学和分子生物学指南.Academic Press，SanDiego，319-929)从存活的转化子中分离重组载体(质粒)，使用象是DNA测序(Singer等(1997)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA745463-5467)这样的DNA分析方法来分析cDNA和基因组DNA。
这样，酿酒酵母必需基因就可以用于鉴定其它病原体真菌中的功能相似基因和/或序列同源基因，特别是鉴定人类、动物、植物的病原体真菌中的功能相似必需基因和/或序列同源必需基因。为此，可以使用例如藻状菌纲或者真菌纲的真菌，特别是担子菌(basidiomycetes)亚纲，子囊菌(ascomycetes)亚纲，尤其是mehiascomycetales(酵母)和plectascales(霉菌)和gymnascales(皮肤和毛发真菌)，或者hyphomycetes纲的真菌，特别是conidiosporales亚纲(皮肤真菌)和thallosporales亚纲(芽殖或出芽真菌)，尤其是毛霉菌属(mucor)，根霉属(rhizopus)，球孢子菌属(coccidioides)，副球孢子菌属(paracoccidioides)巴西芽生菌(blastomyces brasiliensis)，内孢霉属(endomyces)(芽生菌属)，曲霉属(aspergillus)，青霉属(penicilium)，毛癣菌属(trichophyton(ctenomyces))，帚霉属(表皮癣菌属)，小孢子菌属(microsporon)，毛孢子菌属(piedraia)，单孢枝霉属(hormodendron)，瓶霉属(phialophora)，孢子丝菌属(sporotrichon)，隐球酵母属(cryptococcus)，念珠菌属(candida)，地霉属(geotrichum)和丝孢酵母属(trichosporon)。
特别感兴趣的是使用以下真菌，念珠菌属的种(Candida Spp.)，特别是白色念珠菌(Candida Albicans)，Candida glabrata，曲霉属的种(Aspergillus Spp.)，特别是烟曲霉(Aspergillusfumigatus)，粗球孢菌(Coccidioides immitis)，新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)，荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)，皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)，Paracoccidioides brasiliens和Sporotrix schenckii。
从根据上述方法鉴定的酿酒酵母基因开始，申请人使用以下方法从白色念珠菌中克隆出了相应必需基因，即CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或者CaJL039。
首先，为了扩增白色念珠菌的相应片段，从酿酒酵母基因序列或者白色念珠菌同源序列中选择寡核苷酸。克隆之后，所得片段(序列长度大约为几百bp)被用作探针筛选白色念珠菌(基因组)DNA文库。筛选可以包括下面几步把克隆涂布到平皿上，用交联有DNA的滤纸覆盖，与滤纸杂交，检测出阳性克隆。对选出的克隆进行测序。
本方法希望，用真菌必需基因鉴定可以部分或者全部抑制这些必需基因的功能表达和/或编码蛋白的功能活性的物质。可以用这种方式鉴定这些物质，这些物质可以抑制真菌生长，并可用作抗真菌剂，例如用于制备药物。
本发明特别包括一种筛选这种抑制物质的方法，其中选自CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或者CaJL039的白色念珠菌必需基因或者其它病原体真菌的功能相似基因，或者相应编码蛋白质被用作靶。
其它病原体真菌的功能相似基因，是指与已鉴定的白色念珠菌必需基因功能相似或一致的基因。其它病原体真菌的功能相似基因，可以但不必与相应的白色念珠菌必需基因序列同源。其它病原体真菌的功能相似基因，在核酸水平上，可以只表现出与相应的白色念珠菌必需基因中等程度的序列同源性。中等程度的序列同源性，在本发明中是指，在核苷酸水平上要有至少50％的序列同一性，优选有至少60％的序列同一性，最优选有至少70％的序列同一性。
另外，其它病原体真菌中的功能相似基因，可以但不是必须编码与白色念珠菌必需基因编码的蛋白质序列同源的蛋白质。其它真菌中的功能相似蛋白质，可以只表现出与白色念珠菌必需基因编码的蛋白质中等程度的蛋白质序列同源性。
中等程度的蛋白质序列同源性，在本发明中是指，在氨基酸水平上要有至少40％的序列同一性，优选有至少50％的序列同一性，更优选有至少60％的序列同一性，最优选有至少70％的序列同一性。
本方法的一个特征是，使用真菌必需基因或者相应的编码蛋白质作为靶来筛选物质。本方法希望，白色念珠菌必需基因，以及其它病原体真菌的功能相似基因和/或序列同源基因，或者相应的编码蛋白质，可以用作靶。
根据本发明筛选方法的一种实施方案，要提供含有用作靶的必需基因的真菌细胞，并将其与被测物质一同保温。用这种方法来测定这种物质对于必需靶基因的生长抑制效果。
使用以不同程度表达必需靶基因的真菌细胞，将这些细胞与被测物质一同保温，测定这种物质的生长抑制效果。
本方法包括，使用两种或两种以上的真菌细胞，或其衍生菌株，衍生菌株的不同在于，它们表达必需靶基因的程度不同。
例如，对于二种、三种、四种、五种、十种或者更多的真菌细胞或者相应的真菌菌株，可以比较分析被测物质在测定浓度下对它们的生长抑制效果。抗真菌物质可以通过这种表达程度系列与细胞毒性物质或者非活性物质区分开。
本方法的一种特殊实施方案，包括使用单倍体真菌细胞/菌株进行筛选，特别是单倍体酿酒酵母细胞/菌株。
本方法希望，选作靶的必需基因要整合到合适的表达载体中。
例如，大肠杆菌/酿酒酵母穿梭载体是一种合适的表达载体。尤其是可以使用在每个细胞中拷贝数不同的载体。所以，可以使用在经转化的酿酒酵母细胞中有高拷贝数的载体，也可以使用低拷贝数的载体。一种实施方案，包括使用允许把靶基因整合到酿酒酵母基因组中去的表达载体。
例如，载体pRS423，pRS424，pRS425，pRS426，pRS313，pRS314，pRS315，pRS316，pRS303，pRS304，pRS305，pRS306(Sijkorski和Hieter，1989；Christianson等1992)适合作为表达载体。
pRS423-pRS426系列载体具有高拷贝数，大约50-100拷贝/细胞。相反的，pRS313-pRS316系列载体具有低拷贝数(1-2拷贝/细胞)。当使用这两个系列的表达载体时，靶基因以染色体外拷贝形式出现。使用pRS303-pRS306系列载体，可以把靶基因整合到基因组中。使用这三种不同类型的表达载体，可以逐步表达所研究的功能相似必需基因。
本方法包括，通过使用例如单细胞中拷贝数不同的表达载体，来比较测定物质对于真菌细胞/菌株的生长抑制效果。
这种细胞可以以不同程度表达必需的靶基因，并且可以对所说的物质发生逐步的反应。
本方法也包括，通过在表达载体上的所选酿酒酵母特殊启动子和终止子之间插入靶基因，可以在不同真菌细胞中得到目的基因不同强度的表达。(可调控的过量表达)以不同强度组成型表达的酿酒酵母启动子是合适的。这种启动子的实例有，酿酒酵母基因MET25，PGK1，TPI1，TDH3，ADHI，URA3，TRP1的天然启动子，以及它们的相应衍生物，例如没有特殊激活序列和/或阻抑序列的启动子衍生物。
可调节启动子也适合用于靶基因的逐渐过量表达。GAL1基因的天然启动子和/或其相应衍生物，例如已经缺失了不同UAS元件的启动子(GALS，GALL；Mumberg等(1994)核酸研究225767-5768)，以及糖元异生基因的启动子，例如启动子FBP1，PCK1，ICL1或其部分，比如它们的激活(UAS1或UAS2)序列或者阻抑(URS)序列，可以用于相应的非激活和/或非阻抑试验启动子(Schüller等(1992)EMBO J；11107-114；)Guarente等(1984)细胞36503-511；Niederacher等(1992)Curr.Genet.22363-370；Proft等(1995)Mol.Gen.Gent.246367-373；)。
例如酿酒酵母基因MET25，PGK1，TPI1，TDH3，ADHI，URA3的终止子序列，可以用作表达载体的终止子。
本方法包括，通过灵巧地使用所选类型的表达载体和/或制备合适的表达载体，并最终使用不同强度或者受不同调控的启动子，可以构建一系列表达载体，这些表达载体都含有相同的靶基因，但是它们表达靶基因的程度不同。
本方法包括，在酿酒酵母单倍体野生型细胞中表达载体的转化。这样得到的酿酒酵母细胞/菌株，在含有不同浓度被测物质的液体培养基中进行培养，比较分析这种物质对于以不同程度表达靶基因的细胞/菌株的生长行为的效果。本方法也包括，将经各种不含有靶基因的表达载体转化的酿酒酵母单倍体细胞/菌株，用作对照。
本方法包括，使用可调节启动子，特别是GAL1启动子及其衍生物(GALS和GALL)在不同的培养基中进行所说物质的筛选，因为各种培养基的选择在很大程度上影响表达的程度。因此，GAL1启动子的表达程度以下述方式减少2％半乳糖＞1％半乳糖＋1％葡萄糖＞2％甘油＞2％葡萄糖。
该物质抑制酿酒酵母野生型细胞生长的作用，可以通过其它真菌的功能相似基因的过量表达得以部分或者全部的弥补。
根据一种实施方案，筛选抗真菌物质的方法在体外进行，将必需基因或者功能相似基因，或者相应编码蛋白质，与被测试物质接触，并且测定该物质对靶的效果。可以使用任何用于确定两个分子相互作用的体外试验，例如杂交试验或者功能试验(例如，Bergmeyer H.U.，酶分析法，VCH Publishers中所述的酶促试验)。如果使用编码蛋白质作为靶进行筛选，相应必需基因通过本领域已知的任何合适的技术，例如使用一套含有合适限制性酶切位点的引物的PCR扩增，(最新分子生物学方法，John Wiley和Sons，Inc)，被插入到表达系统中，例如大肠杆菌，杆状病毒或者酵母，然后用本领域已知的方法完全或部分地纯化表达蛋白质。任何合适的纯化表达蛋白质的纯化方法都可以使用，例如亲和层析。如果靶蛋白功能已知，那么可以进行功能试验测定抗真菌物质对蛋白质功能的效果。如果靶蛋白功能未知，可以测定与靶蛋白相互作用的物质，例如结合到编码蛋白质上的物质。在这种情况下，可以进行诸如保护蛋白质不被合适的酶酶解这样的试验。
根据一种具体的实施方案，筛选抗真菌物质的方法相当于一种酶促分析，其中要测定二氢蝶酸合酶(DHPS)和/或7，8-二氢-6-羟甲基蝶呤-焦磷酸激酶(HPPK)的活性；酶促分析可以象在“BergmeyerH.U.，酶分析法，VCH Publishers”中公开的那样。
二氢蝶酸合酶(DHPS)催化6-羟甲基-7，8-二氢蝶呤焦磷酸与对-氨基苯甲酸缩合，形成7，8-二氢蝶酸，这与从6-羟甲基-7，8-二氢蝶呤产生7，8-二氢叶酸的三步途径的第二步一致。7，8-二氢-6-羟甲基蝶呤-焦磷酸激酶(HPPK)催化焦磷酸结合到6-羟甲基-7，8-二氢蝶呤上，形成6-羟甲基-7，8-二氢蝶呤焦磷酸，这与产生7，8-二氢叶酸的三步途径的第一步一致。所有的生物体都需要还原叶酸辅因子，以合成各种代谢物。大多数微生物必须从头合成叶酸，因为它们缺少高等脊椎动物细胞的活性转运系统，这种活性转运系统使得这些高等生物可以使用食物中的叶酸。所以，与叶酸生物合成相关的酶也就成为各种抗微生物药剂的靶。因此，这种酶活性对于微生物是必需的，而人体中并不存在。
本方法也包括鉴定与来自人类、动物或者植物的白色念珠菌的必需基因功能相似和/或序列同源的基因。在本方法中，相应的人类、动物或者植物的基因，可以选择性地用作靶基因，以检测抗真菌物质对于这些靶基因是否有作用。
本方法的一个特殊优点是，以这种方式，可以鉴定出有效抑制真菌生长的物质，也可以确定这些物质对来自人类、动物或者植物的白色念珠菌必需基因相应的功能相似基因和/或序列同源基因的影响。
本方法也包括，例如通过检验已确定的真菌必需基因或其部分与数据库中提供的人类、动物或者植物基因序列的同源性。来检验人类、动物或者植物中与相应真菌必需基因功能相似的基因和/或序列同源基因存在的可能性，用这种方法，根据目的，可以在早期就从已鉴定真菌必需基因中筛选出特定基因，例如与人类基因没有功能相似和/或序列同源的基因。
因此，本方法提供了多种选择性鉴定具有抗真菌效果而对人体无害的物质的可能性。
例如，可能鉴定出一些物质，这些物质可以用于制备治疗真菌病药剂或者制备在免疫抑制状态下进行预防的药剂。
例如，这些物质可以用于生产用于治疗真菌感染的药剂，真菌感染常在诸如艾滋病或者糖尿病等疾病发生期间发生。也可以鉴定可用于生产杀真菌剂的物质，特别是对人类和动物无害的杀真菌剂。
另外，本方法提供了鉴定抗真菌物质的可能性，这些抗真菌物质可以选择性地只抑制特殊真菌的生长。
本筛选方法具有特殊的优点，因为通过这种方法可以充分识别基因是否是必需的，而不需要与必需基因功能有关或者与其编码蛋白的功能有关的多余信息。另外，其它真菌的许多这种基因的DNA序列尚未获得，其中的与酿酒酵母必需基因功能相似基因的鉴定便具有特殊的优越性。
根据另一方面，本发明提供了一种抗体，该抗体抗分别由CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或者CaJL039基因或其功能相似基因编码的蛋白质，或其多肽片断。术语“抗体”包括单克隆抗体和多克隆抗体。所说的抗体可以通过本领域已知的方法制备，例如公开在“抗体，实验室手册”，Ed.Harbow和David Lane.冷泉实验室，1988中的那些方法。
根据另一方面，本发明提供了一种诊断真菌感染的试剂盒，该试剂盒包括一种基因，该基因选自CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325和CaJL039，其功能相似基因，其功能片段，包括相应的编码蛋白质，其功能多肽片段或者包括抗体或，该抗体抗由CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325或者CaJL039，或其功能相似基因编码的蛋白质或其多肽片段。这种试剂盒可以用任何本领域已知的合适方法制备。
实施例实施例1CaNL256Stanford国际互联网站点(http//candida.stanford.edu)提供了白色念珠菌基因组的初级序列。其中一个序列与酿酒酵母基因YNL256同源。为了扩增白色念珠菌相应片段，从这个序列中选出了两个寡核苷酸(5’-ATTCATCCCATCAGTGCAGAAAG-3’和5’-ATTGACCAATAGCTCTAATTAATG-3’)。克隆之后，我们得到了一段与预期序列(SEQ ID NO1)相近的399bp的序列。推导出的蛋白质与YNL256的蛋白质进行比较，证明有53％的相似性，43％的同一性(

图1)。白色念珠菌的这段399bp的序列，被用作探针筛选白色念珠菌基因组文库.白色念珠菌基因组文库是通过用Sau3AI部分酶解白色念珠菌基因组DNA，然后在BamHI位点克隆到YEP24载体中得到的。然后，文库的克隆以每平皿2000个克隆的浓度进行涂布。每个平皿用硝酸纤维素滤膜覆盖，然后进行以下连续处理NaOH，0.5M，5分钟；Tris，1M，pH7.7，5分钟；Tris，0.5M，pH7.7，NaCl，1.25M，5分钟。滤膜干燥之后，在80℃放置2小时。预杂交和杂交在以下缓冲液中进行40％甲酰胺，5xSSC，20mM Tris pH7.7 1xDenhardt 0.1％SDS。探针使用Amersham UK的RediPrim试剂盒和dCTP进行32P标记。杂交在42℃进行17个小时以上。然后，用1xSSC，0.1％SDS在室温清洗滤膜三次，每次5分钟，接着在60℃清洗滤膜二次，每次30分钟，放射自显影过夜。所得斑点对应的菌落，用低密度重新涂布的方法再分离，然后再次杂交。这样得到了三个克隆(从40,000个克隆中得到)，这三个克隆用ABI377仪器进行测序。序列用ABI软件编辑，接着用GCG软件包分析。结果这三个克隆中的一个，含有与所用探针相对应的全部编码序列；这个基因称作CaNL256，其序列描述在SEQ IDNO2中。CaNL256与酿酒酵母基因YNL256有52％的核苷酸一致。编码区在N末端更短。事实上，当翻译成氨基酸时，白色念珠菌中的CTG密码子翻译为丝氨酸(CaNL256中有3个CTG密码子)。推导出的蛋白质与酿酒酵母YNL256有40％的氨基酸同一性，与Pneomocystis courinii的FAS(叶酸合酶)有41％的氨基酸同一性。用Blast软件查询数据库，表明CaNL256蛋白质的两个部分分别与下列蛋白质有同源性细菌流感嗜血杆菌，出血性葡萄球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，肺炎链球菌，枯草芽孢杆菌，丙酮丁醇梭状芽孢杆菌，大肠杆菌，麻疯分枝杆菌的二氢蝶酸合酶(EC 2.5.1.15)(DHPS)(P值小于e-28)，以及枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，流感嗜血杆菌，肺炎链球菌的7，8-二氢-6-羟甲基蝶呤-焦磷酸激酶(EC 2.7.6.3)(HPPK)(P值小于e-20)。DHPS与HPPK的单位特征也可以在CaNL256中发现。
实例2CaBR102Stanford国际互联网站点(http//candida.stanford.edu)提供了白色念珠菌基因组的初级序列。其中一个序列与酿酒酵母基因YBR102同源。为了扩增白色念珠菌相应片段，从这个序列中选出了两个寡核苷酸(5’-AGTATTCAATTGGGTATTCC-3’和5’-CCGGCATCATCAGTAACTCC-3’)。克隆之后，我们得到了一段647bp的序列(SEQ ID NO3)。推导出的蛋白质与YNL102的蛋白质进行比较，证明有35％相似，26％一致(图2)。这一片段用Pfu聚合酶(Stratagene)扩增。PCR产物经纯化(High Pure PCR ProductPurification Kit，Boehringer Mannheim)后，用作筛选白色念珠菌基因组DNA文库的探针。白色念珠菌基因组DNA文库是通过用SauIIIA部分酶解白色念珠菌基因组DNA，然后在BamHI位点克隆到YEP-24TRP1载体中得到的。然后，文库的40,000个克隆以每平皿2000个克隆的浓度进行涂布。每个平皿用硝酸纤维素滤膜(MembraneHybond N+，Amersham)覆盖，然后进行以下连续处理1.5M NaCl/0.5M NaOH，5分钟；1.5M NaCl/0.5M Tris-HCl pH7.2/1mM EDTA，3分钟，2次；DNA交联到滤膜上(Amersham Life Science，ultraviolet crosslinker)。探针(100ng)使用RediPrim试剂盒和dCrP(Amersham Life Science)进行32P标记。杂交在以下缓冲液中42℃进行16个小时30％甲酰胺，5xSSC，5％Denhart’s溶液，1％SDS，100μg/ml鲑精浓度为DNA，浓度为106cpm/ml的探针。用2xSSC/0.1％SDS在室温清洗滤膜三次，每次5分钟，接着用1xSSC/0.1％SDS在60℃清洗滤膜三次，每次20分钟。然后把滤膜暴露在X射线胶片下过夜。阳性克隆所对应的菌落，用相同的方法进行第二次筛选分离。最终得到了两个阳性克隆，这两个克隆用ABI 377仪器进行测序。序列用ABI软件编辑，接着用GCG软件包分析。这两个克隆的核苷酸序列是一致的，含有与所用探针相对应的全部编码序列，这个基因称作Ca BR102，其序列描述在SEQ ID NO4中。考虑到在白色念珠菌中，CTG密码子被翻译为丝氨酸(CaNL256中有3个CTG密码子)这一事实，这一核苷酸序列的翻译经过了检验。推导出的蛋白质与酿酒酵母基因YBR102有24％的同一性。
实例3CaIR012使用BI0101的Yeast Cell Lysis prep Kit和Genome DNA Kit，分离了白色念珠菌菌株Caf2-1的染色体DNA。使用寡核苷酸引物CaYIR012-5’(5’-GACGTCGTAGACGATACTCAAGAAG-3’)和CaYIR012-3’(5’-CTGCAGTAAACCCTCCAGATATAACAG-3’)，PowerScript DNA聚合酶(PAN System GmbH)，通过热启动(hot start)技术扩增出了一段343bp的白色念珠菌基因组DNA片段(SEQ ID NO5)。根据制造商说明，用琼脂糖凝胶纯化PCR产物，并用荧光素(Gene imagerandom prime labeling module，Amersham Life Science)进行标记。使用制造商推荐的Qiagen柱，从大肠杆菌中分离出质粒DNA。根据制造商说明(Stratagene Ltd.)，进行白色念珠菌λZAPII cDNA文库筛选。从15000pfu/平板的LB平板(150mm)上拿起尼龙滤膜(Schleicher&Schuell)，在1.5M NaCl，0.5M NaOH中变性5分钟，在1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl pH8.0中中和3分钟，在0.2MTris-HCl pH7.5，2xSSC中清洗3分钟，DNA交联到滤膜上(Stratagene UV crosslinker)。滤膜在60℃预杂交4小时，用荧光素标记的DNA探针在60℃杂交过夜。用抗-荧光素AP缀合物(FluorImager的信号放大组件，Amersham LIFE SCIENCE)进行检测，20小时后用Fluorimager分析(Storm 860，MolecularDynamics)。挑选出阳性噬斑，并培养在0.5ml SM缓冲液(100mM NaCl，8mM MgSO4，50mM Tris-HCl pH7.5，0，01％明胶)中。挑选的克隆被稀释，用宿主细胞XLl-Blue滴定，并用相同的方法进行第二次筛选纯化。最终，根据Stratagene方案，用ExAssist Helper Phage系统挑选含有感兴趣DNA插入的pBluescript SK(-)噬粒。从总共75000个筛选噬斑中，鉴定出3个阳性克隆。分离出pBluescript SK(-)噬粒DNA，用T3和T7引物进行测序，用常规合成的寡核苷酸引物扩增序列。用Gene Data软件包(Gene Data AG，BaselSwitzerland)分析核苷酸序列。用Blast程序(Gish，Warren和David J.States(1993).通过数据库相似性检索鉴定蛋白质编码区。Nat.Genet.3266-72.)对Swissprot数据库进行相似性检索。结果这三个克隆中的一个，含有与所用探针相对应的全部编码序列；这个基因称作CaIR1012，其序列描述在SEQ ID NO6中。
实例4CaJL039CaJL039序列描述在SEQ ID NO7中。
基于公开的Stanford白色念珠菌序列数据库发布的基因片段数据，克隆出CaJL039基因。
(a)鉴定一段表现出与酿酒酵母基因YJL039c有同源性的片段，其序列在SEQ ID NO 8中给出。
通过使用在实施例3中公布的方法，用寡核苷酸引物对(Ca039sTAG CTC AAC CTA CCA CCA ATC/Ca039rATC ACA AGA CTGTCA ATG TAA AT)，扩增了一段短的PCR片段，用于筛选白色念珠菌cDNAλZAP II文库(Alistair Brown，Aberdeen惠赠)。
得到了三个阳性克隆的3’编码区域(#21t7，11t3，21t3)。
(b)使用引物步行法3’-和5’-延伸内部片段使用Yep24载体作构架的Sanglard白色念珠菌基因组DNA文库进一步扩增3’-和5’-编码序列。通过使用下列载体特异性的寡核苷酸引物和CaJL039片段特异的寡核苷酸引物，进行扩增cggaattcctatcgactacgcgatcatggYEp24for(载体特异)gcgaattccgatataggcgccagcaacYEp24ba(载体特异)caattgctttgactcgggtgttattaagtCa039-51(CaJL0395′钓取)tcttggcacaacttgataagaatctgtCa039-52(`)taggtgtacgcgaaagccaagtagaacCa039-53(`)ttgttaatcgtacacctaaggtgttgacCa039-31(CaJL0393`钓取)ttgcagattgatgctagcaatgtatttgCa039-32(`)使用引物步行技术，可以扩增全部5’-序列(克隆14b-1-1和克隆17b-3-4)。
缺失的3’-序列可从GTC PathoGenome Release 5.0，重叠群#2830中获得。
已经鉴定了一种相互作用的蛋白质(C82，酵母RNA聚合酶III的组分)。
实例5CaOR1105.1.CaOR110CaOR110序列描述在SEQ ID NO9中。
基于公开的Stanford白色念珠菌序列数据库发布的基因片段数据，克隆出CaOR110。
(a)Sc0R110同源的一个小片段被用于杂交试验，来鉴定白色念珠菌cDNAλZAP II文库(来自Alistair Brown)中的CaOR110克隆。白色念珠菌CaOR110序列与所用杂交片段的序列对比在图3中给出。同源片段序列在SEQ ID NO.17中给出。
(b)内部片段的3’-和5’-延伸使用Yep24载体作构架的Sanglard白色念珠菌基因组DNA文库(来自RMV)扩增3’-和5’-编码和非编码序列。通过使用下列载体特异性的寡核苷酸(直接针对插入物)和CaOR110片段特异性的寡核苷酸(直接针对载体侧翼序列)进行扩增cggaattcctatcgactacgcgatcatggYEP24forgcgaattccgatataggcgccagcaacYEP24bacgggatccggtaaccaattggatctataaccgtg110-ba-150gcggatcctggtgcccttggtggtgaatgCaYOR110AgcggatccctcacaatatgacgattgaaactCaYOR110BggcgtcgactcaggcgccagttttacgtacttcaaattcatcCaYOR110CtgtgaattcttgacacagggtgaCaYOR110DcaaaccttcagcacaactccaCaYOR110E通过测序检验了最终装配的序列，其中也包括3’-和5’-非编码序列的序列。编码区域被亚克隆到p414RSGALL载体中。
图谱在图4中描述。
酵母同源的ORF(YOR110w)，被描述为在TFIIIC聚合酶复合物中与TFC1相互作用的转录因子亚单位TFC7(Manaud等，1998，分子细胞生物学18；3191-3200)。
5.2.CaOR110剪接变体鉴定了CaOR110另外的剪接变体。从白色念珠菌cDNA文库中获得该CaOR110剪接变体的克隆。
序列描述在SEQ ID NO.10中。
该剪接变体在CaOR110原始序列的第907位处使用“gtacgt”供体位点。受体位点在第1047位。图谱公布在图5中。
原始CaOR110与剪接变体的序列对比在图6中给出。
实例6CaMR212CaMR212序列描述在SEQ ID NO.11中。
(a)基于公开的Stanford白色念珠菌序列数据库发布的基因片段数据，克隆出CaMR212基因。
表现出与酿酒酵母基因YMR212c有同源性(Blast检索)的片段，其序列在SEQ ID 12中给出。
基于这些数据，设计以下寡核苷酸用于从白色念珠菌基因组DNA中扩增该片段(490 bp的片段)。
寡核苷酸CaYMR212for5′-cacctgtgaacaacccaccatc-3′CaYMR212back5′-gaatatcctttttaactcaagag-3′(b)3’-和5’-延伸该CaMR212内部片段为此，使用了来自Dominique Sanglard的白色念珠菌基因组DNA文库(来自RMV)。该文库Yep24构架被用于PCR扩增3’-和5’-编码和非编码序列。通过使用以下对CaMR212的490bp片段具有特异性的寡核苷酸(直接针对载体侧翼序列)和对载体具有特异性的寡核苷酸(直接针对插入物)，进行扩增。
寡核苷酸YEP24for(载体特异)5′-cggaattcctatcgactacgcgatcatggYEP24ba(载体特异)5′-gcgaattccgatataggcgccagcaac引物Yep24for和CaMR212for给出了一段编码CaMR212的5’-UTR和5’编码区的500bp的片段。
使用Yep24 for和CaMR212back扩增出一段1400bp的CaMR212片段。利用这段1400bp片段序列，设计了以下对这一片段具有特异性的新引物寡核苷酸
Ca212-15′-gctttcccagcaggataacattgCa212-25′-tgagttataatgcagctgttggCa212-35′-catctcgtgtgaacatgattgg引物Yep24for和Ca212-3给出了一段编码3’-编码区和3’-UTS区的1600bp的片段。
用这三个PCR片段装配出了2900bp的序列(包括3’-和5’-编码区序列和非编码区序列)。通过使用以下新引物，从基因组DNA中扩增出编码序列，并将其克隆到p413GALL载体中。
扩增编码区的寡核苷酸Ca212for 5′-agtttcttcaacttccagatccaagCa212back5′-gtatatttgcaactgtctctctctc酵母同系物YMR212c在细胞壁功能中起作用，因为它的敲除可以在1M山梨糖醇中得到挽救。另外，GAL启动子调节下的YMR212c，表现出对刚果红(Congo Red)和Calcofluor White增强的敏感性。YMR212c是一种膜内在蛋白质，位于质膜上(经YMR212-GFP融合蛋白质的显微分析和生化分析证明)。
实例7CaDR325CaDR325序列描述在SEQ ID 13中。
基于公开的Stanford白色念珠菌序列数据库发布的基因片段数据，克隆出CaDR325基因。
(a)表现出与酿酒酵母基因YDR325有同源性的三个片段得到了鉴定，其序列公开在SEQ ID 14，15，16中。
基于这些数据，设计以下寡核苷酸，用于确认数据库序列，并从基因组DNA中扩增一段大约2200bp的CaDR325内部片段。
cgagcatctacttgttcaaccachybCaYDR325ba Oligogaatctctggctcgctc 325-juls Oligogaccgagatacacgagaat325-julr OligoggttaaatgatcgtgatgaatCa325r OligocaacctcactgacaaatacttCa325s Oligo最后亚克隆的2200bp的内部片段，通过联合使用hybCaYDR325ba+325-julr寡核苷酸进行扩增。
(c)3’-和5’-延伸该CaMR212内部片段使用Yep24载体作构架的Sanglard白色念珠菌基因组DNA文库(来自RMV)，扩增3’-和5’-编码和非编码序列。通过使用下列载体特异性的寡核苷酸(直接针对插入物)和CaDR325 2200bp片段特异性的寡核苷酸(直接针对载体侧翼序列)，进行扩增cggaattcctatcgactacgcgatcatggYEP24for(载体特异)gcgaattccgatataggcgccagcaac YEP24ba(载体特异)acgcttccaatgtattattctcgOligo 1-10-A backggatgccaatttccctga Oligo 1-10-B forcatccagaagatataacggct Oligo 1-10-C fortgcataatctactcagcgaca Oligo 1-l0-D backgtggttgaacaagtagatgctcgOllgo 1-l0-E forgcgcttgaaaccactagtgaattg Ca325Klon_2_Focaattcactagtggtttcaagcgc Ca325Klon_3_Ba通过测序检验了最终装配的4700bp的序列，其中也包括3’-和5’-非编码序列的序列。编码区被亚克隆到p413RSGALL载体中。
图谱在图7中描述。
在序列表的130区，确定了序列数目。
序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用该基因筛选抗真菌物质的方法<130>SEQID01<140><141><160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>399<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述探针<400>1attcatccca tcagtgcaga aagtttgcat agccatttac aacaattaat aaatgataaa 60cctcaagaga cagtacaaga atcgtctgat ttattacaat ttatcccagt ctctagatta 120cctgtcaaag ataatatttt gaaatttgat caaattaatc ataaatctcc tactttgatt 180atgggtatat tgaatatgac tcctgattca tttagtgatg gtgggaaaca ttttggaaaa 240gaactagata atattgtgaa gcaggcagag aaattagtca gtgagggtgc tacgattatt 300gacattggag gagtttccac acgaccagga agtgttgaac ccactgagga agaagaattg 360gaacgtgtga ttccattaat tagagctatt cgtcaatca399序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用该基因筛选抗真菌物质的方法<130>SEQID02<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2367<212>DNA<213>白色念珠菌<220><221>CDS<222>(1)..(2364)<220><221>基因<222>(1)..(2364)<223>基因CaNL256<400>1atg ttg aaa aac gat acc gtt ttc act aaa gat att tct tgt acg gcg 48Met Leu Lys Asn Asp Thr Val Phe Thr Lys Asp Ile Ser Cys Thr Ala1 5 10 15ata act ggt aaa gat gcc tgg aat cgg cca aca cca caa cca atc act 96Ile Thr Gly Lys Asp Ala Trp Asn Arg Pro Thr Pro Gln Pro Ile Thr20 25 30ata tca tta tct ttc aat act gat ttc cat aag gca tcg gaa ttg gat 144Ile Ser Leu Ser Phe Asn Thr Asp Phe His Lys Ala Ser Glu Leu Asp35 40 45aat ttg aaa tac tca att aat tat gct gtt att acc aga aat gta act 192Asn Leu Lys Tyr Ser Ile Asn Tyr Ala Val Ile Thr Arg Asn Val Thr50 55 60gaa ttt atg aaa tca aat gag cat tta aat ttc aag tca tta gga aat 240Glu Phe Met Lys Ser Asn Glu His Leu Asn Phe Lys Ser Leu Gly Asn65 70 75 80att gct caa gca att agt gat att gga tta gat caa tct aga ggt ggt 288Ile Ala Gln Ala Ile Ser Asp Ile Gly Leu Asp Gln Ser Arg Gly Gly85 90 95gga tct att gtg gat gtg acg ata aaa agt ttg aaa tca gaa ata aga 336Gly Ser Ile Val Asp Val Thr Ile Lys Ser Leu Lys Ser Glu Ile Arg100 105110gct gaa agt gtc gaa tat aaa att aat aga aac act ttg ggt caa ccc 384Ala Glu Ser Val Glu Tyr Lys Ile Asn Arg Asn Thr Leu Gly Gln Pro115120 125gtt cca tta gat att ttc caa gtt aat aaa ttg aga tta ttg acg att 432Val Pro Leu Asp Ile Phe Gln Val Asn Lys Leu Arg Leu Leu Thr Ile130 135 140att gga gtt ttc aca ttt gaa aga tta caa aaa caa ata gtt gat gtt 480Ile Gly Val Phe Thr Phe Glu Arg Leu Gln Lys Gln Ile Val Asp Val145 150 155 160gat ttg caa ttt aaa att gaa cct aat tcc aat tta tat ttc cat caa 528Asp Leu Gln Phe Lys Ile Glu Pro Asn Ser Asn Leu Tyr Phe His Gln165 170 175ata att gct gat att gtt tca tac gtg gaa tca tct aat ttc aaa act 576Ile Ile Ala Asp Ile Val Ser Tyr Val Glu Ser Ser Asn Phe Lys Thr180 185 190gta gaa gca ttg gtg tct aag att ggt caa ttg aca ttt cag aaa tat 624Va1 Glu Ala Leu Val Ser Lys Ile Gly Gln Leu Thr Phe Gln Lys Tyr195 200 205gac gga gta gct gaa gtt gtt gct act gtc act aaa ccg aat gca ttt 672Asp Gly Val Ala Glu Val Val Ala Thr Val Thr Lys Pro Asn Ala Phe210 215 220agt cat gtt gaa ggt gtt gga gta tca tct acc atg gtc aaa gac aat 720Ser His Val Glu Gly Val Gly Val Ser Ser Thr Met Val Lys Asp Asn225 230 235 240ttc aaa gat atg gaa cca gtt aaa ttt gaa aac aca att gct caa act 768Phe Lys Asp Met Glu Pro Val Lys Phe Glu Asn Thr Ile Ala Gln Thr245 250 255aat aga gca ttc aat tta cct gtt gaa aat gag aaa act gag gat tat 816Asn Arg Ala Phe Asn Leu Pro Val Glu Asn Glu Lys Thr Glu Asp Tyr260 265 270acc ggg tac cac act gca ttt att gcc ttt gga tcc aat act gga aat 864Thr Gly Tyr His Thr Ala Phe Ile Ala Phe Gly Ser Asn Thr Gly Asn275280 285caa gta gaa aat att acc aat tca ttc gaa ttg ttg caa aaa tat gga 912Gln Val Glu Asn Ile Thr Asn Ser Phe Glu Leu Leu Gln Lys Tyr Gly290 295 300atc acc ata gaa gca act tca tca ttg tac att tct aaa cca atg tat 960Ile Thr Ile Glu Ala Thr Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Lys Pro Met Tyr305 310 315 320tac ttg gat caa cca gat ttt ttc aat gga gta att aaa gtg aat ttc 1008Tyr Leu Asp Gln Pro Asp Phe Phe Asn Gly Val Ile Lys Val Asn Phe325 330 335caa aac att tca cct ttc cag ttg ttg aaa att cta aaa gat att gaa 1056Gln Asn Ile Ser Pro Phe Gln Leu Leu Lys Ile Leu Lys Asp Ile Glu340 345 350tat aaa cat tta gaa agg aaa aaa gac ttt gat aat ggg ccc aga tca 1104Tyr Lys His Leu Glu Arg Lys Lys Asp Phe Asp Asn Gly Pro Arg Ser355 360 365ata gat ttg gat att ata cta tat gac gat tta caa tta aat acc gag 1152Ile Asp Leu Asp Ile Ile Leu Tyr Asp Asp Leu Gln Leu Asn Thr Glu370 375 380aat cta att att cca cat aaa tca atg tta gaa aga aca ttt gta tta 1200Asn Leu Ile Ile Pro His Lys ser Met Leu Glu Arg Thr Phe Val Leu385 390395 400caa cca tta tgt gaa gta ttg ccc cct gat tat att cat ccc atc agt 1248Gln Pro Leu Cys Glu Val Leu Pro Pro Asp Tyr Ile His Pro Ile Ser405 410 415gca gaa agt ttg cat agc cat tta caa caa tta ata aat gat aaa cct 1296Ala Glu Ser Leu His Ser His Leu Gln Gln Leu Ile Asn Asp Lys Pro420 425 430caa gag aca gta caa gaa tcg tct gat tta tta caa ttt arc cca gtc 1344Gln Glu Thr Val Gln Glu Ser Ser Asp Leu Leu Gln Phe Ile Pro Val435 440 445tct aga ttg cct gtc aaa gat aat att ttg aaa ttt gat caa att aat 1392Ser Arg Leu Pro Val Lys Asp Asn Ile Leu Lys Phe Asp Gln Ile Asn450 455 460cat aaa tct cct act ttg att atg ggt ata ttg aat atg act cct gat 1440His Lys Ser Pro Thr Leu Ile Met Gly Ile Leu Asn Met Thr Pro Asp465 470 475 480tca ttt agt gat ggt ggg aaa cat ttt gga aaa gaa cta gat aat act 1488Ser Phe Ser Asp Gly Gly Lys His Phe Gly Lys Glu Leu Asp Asn Thr485 490 495gtg aag cag gca gag aaa tta gtc agt gag ggt gct acg att att gac 1536Val Lys Gln Ala Glu Lys Leu Val Ser Glu Gly Ala Thr Ile Ile Asp500 505 510att gga gga gtt tcc aca cgc cca gga agt gtt gaa ccc act gag gaa 1584Ile Gly Gly Val Ser Thr Arg Pro Gly Ser Val Glu Pro Thr Glu Glu515 520 525gaa gaa ttg gaa cgt gtg att cca tta att aaa gct att cgt caa tca 1632Glu Glu Leu Glu Arg Val Ile Pro Leu Ile Lys Ala Ile Arg Gln Ser530 535 540ctg aac cct gat tta ctg aag gtg ttg att tcg gtt gat act tat cgt 1680Leu Asn Pro Asp Leu Leu Lys Val Leu Ile Ser Val Asp Thr Tyr Arg545 550 555 560agg aac gtt gct gaa caa agt tta ctt gtg ggt gct gac ata atc aac 1728Arg Asn Val Ala Glu Gln Ser Leu Leu Val Gly Ala Asp Ile Ile Asn565 570 575gat atc tca atg ggc aaa tat gat gaa aaa ata ttt gat gtg gtt gct 1776Asp Ile Ser Met Gly Lys Tyr Asp Glu Lys Ile Phe Asp Val Val Ala580 585 590aaa tac gga tgt cct tat atc atg aat cat act cga gga tca cct aaa 1824Lys Tyr Gly Cys Pro Tyr Ile Met Asn His Thr Arg Gly Ser Pro Lys595 600 605acc atg tct aaa ttg acc aat tat gaa tca aat aca aat gat gat att 1872Thr Met Ser Lys Leu Thr Asn Tyr Glu Ser Asn Thr Asn Asp Asp Ile610 615 620atc gaa tat ata att gat cct aaa tta gga cat caa gaa ttg gat ttg 1920Ile Glu Tyr Ile Ile Asp Pro Lys Leu Gly His Gln Glu Leu Asp Leu625 630 635 640tca cct gaa atc aag aat tta ctc aat gga atc agt cgt gaa ttg agt 1968Ser Pro Glu Ile Lys Asn Leu Leu Asn Gly Ile Ser Arg Glu Leu Ser645 650 655tta caa atg ttt aaa gcc atg gct aaa gga gtg aaa aaa tgg caa att 2016Leu Gln Met Phe Lys Ala Met Ala Lys Gly Val Lys Lys Trp Gln Ile660 665 670att ttg gat cct ggt att gga ttt gct aaa aat ttg aat caa aat tta 2064Ile Leu Asp Pro Gly Ile Gly Phe Ala Lys Asn Leu Asn Gln Asn Leu675 680 685gca gtt att cgt aat gcc tcg ttt ttt aaa aaa tat tct att caa 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Pro Ile Thr20 25 30Ile Ser Leu Ser Phe Asn Thr Asp Phe His Lys Ala Ser Glu Leu Asp35 40 45Asn Leu Lys Tyr Ser Ile Asn Tyr Ala Val Ile Thr Arg Asn Val Thr50 55 60Glu Phe Met Lys Ser Asn Glu His Leu Asn Phe Lys Ser Leu Gly Asn65 70 75 80Ile Ala Gln Ala Ile Ser Asp Ile Gly Leu Asp Gln Ser Arg Gly Gly85 90 95Gly Ser Ile Val Asp Val Thr Ile Lys Ser Leu Lys Ser Glu Ile Arg100 105 110Ala Glu Ser Val Glu Tyr Lys Ile Asn Arg Asn Thr Leu Gly Gln Pro115 120 125Val Pro Leu Asp Ile Phe Gln Val Asn Lys Leu Arg Leu Leu Thr Ile130 135 140Ile Gly Val Phe Thr Phe Glu Arg Leu Gln Lys Gln Ile Val Asp Val145 150 155 160Asp Leu Gln Phe Lys Ile Glu Pro Asn Ser Asn Leu Tyr Phe His Gln165 170 175Ile Ile Ala Asp Ile Val Ser Tyr Val Glu Ser Ser Asn Phe Lys Thr180 185 190Val Glu Ala Leu Val Ser Lys Ile Gly Gln Leu Thr Phe Gln Lys Tyr195 200 205Asp Gly Val Ala Glu Val Val Ala Thr Val Thr Lys Pro Asn Ala Phe210 215 220Ser His Val Glu Gly Val Gly Val Ser Ser Thr Met Val Lys Asp Asn225 230 235 240Phe Lys Asp Met Glu Pro Val Lys Phe Glu Asn Thr Ile Ala Gln Thr245 250 255Asn Arg Ala Phe Asn Leu Pro Val Glu Asn glu Lys Thr Glu Asp Tyr260 265 270Thr Gly Tyr His Thr Ala Phe Ile Ala Phe Gly Ser Asn Thr Gly Asn275 280 285Gln Val Glu Asn Ile Thr Asn Ser Phe Glu Leu Leu Gln Lys Tyr Gly290 295 300Ile Thr Ile Glu Ala Thr Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Lys Pro Met Tyr305 310 315 320Tyr Leu Asp Gln Pro Asp Phe Phe Asn Gly Val Ile Lys Val Asn Phe325 330 335Gln Asn Ile Ser Pro Phe Gln Leu Leu Lys Ile Leu Lys Asp Ile Glu340 345 350Tyr Lys His Leu Glu Arg Lys Lys Asp Phe Asp Asn Gly Pro Arg Ser355 360 365Ile Asp Leu Asp Ile Ile Leu Tyr Asp Asp Leu Gln Leu Asn Thr Glu370 375 380Asn Leu Ile Ile Pro His Lys Ser Met Leu Glu Arg Thr Phe Val Leu385 390 395 400Gln Pro Leu Cys Glu Val Leu Pro Pro Asp Tyr Ile His Pro Ile Ser405 410 415Ala Glu Ser Leu His Ser His Leu Gln Gln Leu Ile Asn Asp Lys Pro420 425 430Gln Glu Thr Val Gln Glu Ser Ser Asp Leu Leu Gln Phe Ile Pro Val435 440 445Ser Arg Leu Pro Val Lys Asp Asn Ile Leu Lys Phe Asp Gln Ile Asn450 455 460His Lys Ser Pro Thr Leu Ile Met Gly Ile Leu Asn Met Thr Pro Asp465 470 475 480Ser Phe Ser Asp Gly Gly Lys His Phe Gly Lys Glu Leu Asp Asn Thr485 490 495Val Lys Gln Ala Glu Lys Leu Val Ser Glu Gly Ala Thr Ile Ile Asp500 505 510Ile Gly Gly Val Ser Thr Arg Pro Gly Ser Val Glu Pro Thr Glu Glu515 520 525Glu Glu Leu Glu Arg Val Ile Pro Leu Ile Lys Ala Ile Arg Gln Ser530 535 540Leu Asn Pro Asp Leu Leu Lys Val Leu Ile Ser Val Asp Thr Tyr Arg545 550 555 560Arg Asn Val Ala Glu Gln Ser Leu Leu Val Gly Ala Asp Ile Ile Asn565 570 575Asp Ile Ser Met Gly Lys Tyr Asp Glu Lys Ile Phe Asp Val Val Ala580 585 590Lys Tyr Gly Cys Pro Tyr Ile Met Asn His Thr Arg Gly Ser Pro Lys595 600 605Thr Met Ser Lys Leu Thr Asn Tyr Glu Ser Asn Thr Asn Asp Asp Ile610 615 620Ile Glu Tyr Ile Ile Asp Pro Lys Leu Gly His Gln Glu Leu Asp Leu625 630 635 640Ser Pro Glu Ile Lys Asn Leu Leu Asn Gly Ile Ser Arg Glu Leu Ser645 650 655Leu Gln Met Phe Lys Ala Met Ala Lys Gly Val Lys Lys Trp Gln Ile660 665 670Ile Leu Asp Pro Gly Ile Gly Phe Ala Lys Asn Leu Asn Gln Asn Leu675 680 685Ala Val Ile Arg Asn Ala Ser Phe Phe Lys Lys Tyr Ser Ile Gln Ile690 695 700Asn Glu Arg Val Asp Asp Val Thr Ile Lys His Lys Tyr Leu Ser Phe705 710 715 720Asn Gly Ala Cys Val Leu Val Gly Thr Ser Arg Lys Lys Phe Leu Gly725 730 735Thr Leu Thr Gly Asn Glu Val Pro Leu Asp Arg Val Phe Gly Thr Gly740 745 750Ala Thr Val Ser Ala Cys Ile Glu Gln Asn Thr Asp Ile Val Arg Val755 760 765His Asp Val Lys Glu Met Lys Asp Val Val Cys Ile Ser Asp Ala Ile770 775 780Tyr Lys Asn Val785序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用该基因筛选抗真菌物质的方法<130>SEQID03<140><141><160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>647<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述探针<400>1agtattcaat tgggtattcc cagtaataaa aagaaagatc gatcatcaat tatggtgctt 60aaaaaaatgt gggattctca attacaatca ttatttaaac atgttgacgg tgcatcaaaa 120tttgtgcaac cattacccaa tagacacatt gtcgcggaaa gtggacgatg gtttgaagtt 180aatgtgggga attggaaacc aagttatcca actcatttat ttatatttaa tgatttaatt 240ttaattgccg ttaaaaaatc atcatctagt agtcaggaac ctactacagg gggaagtaat 300ggtggttcaa aatcgagatt acaagcggtt caatgttggc ccttaactca agtatcatta 360caacaaatca aatcaccgaa aaaagatgac gataagatgt attttatcaa tcttaaatcc 420aaatctttaa gttatgtata cctgacggat cgttatgatc attttgtgaa agttacggaa 480gcatttaata aaggtagaaa tgaaatgatt caaagtgaaa gattattaga ttcaagactt 540tcatctcctt caaataataa tggagattct aaagaagaga aacgacaatt acgggaatca 600ttaagaaact caggcaatta taaagaagga gttactgatg atgccgg 647序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用该基因筛选抗真菌物质的方法<130>SEQID04<140><141><160>2<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2373<212>DNA<213>白色念珠菌<220><221>CDS<222>(1)..(2373)<220><221>基因<222>(1)..(2373)<223>基因CaBR102<400>1atg gat aat ctt gat ccc aat tct agt tta caa gta gag aaa tta cga 48Met Asp Asn Leu Asp Pro Asn Ser Ser Leu Gln Val Glu Lys Leu Arg15 10 15aac agg aaa agc agg gct gta tgg cag aat aac aac act tct act cat 96Asn Arg Lys Ser Arg Ala Val Trp Gln Asn Asn Asn Thr Ser Thr His20 25 30aat aat cct tat gct aat tta agc act ggt gaa aaa 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Gly Asp Val Met Thr Arg Thr Gly Gly Leu Thr Ile Glu Gln145 150 155 160aaa ata ttc aaa gaa tta agt caa gga tca gca gct gaa gtt gat gat528Lys Ile Phe Lys Glu Leu Ser Gln Gly Ser Ala Ala Glu Val Asp Asp165 170 175tat tac aag aca tta ttg aaa cag aaa aat tta atc act cgt gac att576Tyr Tyr Lys Thr Leu Leu Lys Gln Lys Asn Leu Ile Thr Arg Asp Ile180 185 190aag gat aat att aat cag aat caa aaa aat att tta caa tta aca aaa624Lys Asp Asn Ile Asn Gln Asn Gln Lys Asn Ile Leu Gln Leu Thr Lys195 200 205gac ttg aaa gag acc caa gaa gaa ttg att gaa ttg aga gga acc act672Asp Leu Lys Glu Thr Gln Glu Glu Leu Ile Glu Leu Arg Gly Thr Thr210 215 220aaa gaa tta tat gaa gtt tta ggt tat ttc aaa gaa tca gct caa cgt720Lys Glu Leu Tyr Glu Val Leu Gly Tyr Phe Lys Glu Ser Ala Gln Arg225 230 235 240aga tta gaa ttg gaa ttt gaa cca gaa aca caa aaa gaa ctt cat ctg768Arg Leu Glu Leu Glu Phe Glu Pro Glu Thr Gln Lys Glu Leu His Leu245 250 255cct caa aaa agt aat caa ttg ggt att cct agt aat aaa aag aaa gat816Pro Gln Lys Ser Asn 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Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用该基因筛选抗真菌物质的方法<130>SEQID06<140><141><160>2<170>patentIn Ver.2.1<210>1<211>1248<212>DNA<213>白色念珠菌<220><221>CDS<222>(1)..(1245)<220><222>基因<222>(1)..(1245)<223>基因CaIR012<400>1atg tca cac caa caa gaa gac gtc gta gac gat act caa gaa gaa tat 48Met Ser His Gln Gln Glu Asp Val Val Asp Asp Thr Gln Glu Glu Tyr1 5 10 15atc aat gtt aat gaa gtg gct gag gaa gtt gca gat gat gat caa gcg 96Ile Asn Val Asn Glu Val Ala Glu Glu Val Ala Asp Asp Asp Gln Ala20 25 30cca ccc gat gaa gaa gat gag gag atg gaa tta gat gat gag cat gag 144Pro Pro Asp Glu Glu Asp Glu Glu Met Glu Leu Asp Asp Glu His Glu35 40 45act tta gaa att gac atg tcc aac aat tca tgg act tat ttt gat aaa 192Thr Leu Glu Ile Asp Met Ser Asn Asn Ser Trp Thr Tyr Phe Asp Lys50 55 60cat acc gat agt ata ttt act att ttt tca cat cct aaa ttg cca atg 240His Thr Asp Ser Ile Phe Thr Ile Phe Ser His Pro Lys Leu Pro Met65 70 75 80gta ttg act ggg ggt ggt gac aac acg gca tac tta tgg acc aca cac 288Val Leu Thr Gly Gly Gly Asp Asn Thr Ala Tyr 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Ver.2.1<210>1<211>5544<212>DNA<213>白色念珠菌<220><221>CDS<222>(1)..(5541)<220><221>基因<222>(1)..(5541)<223>基因CaJLO39<400>1atg agt ggc ata ttt aat tgg tcg ctg gat gtg ttt gcc gat att tat 48Met Ser Gly Ile Phe Asn Trp Ser Leu Asp Val Phe Ala Asp Ile Tyr1 5 10 15aac acc ctc aag ttt gag tcc aat ata gat ttg gat aca atc gac ttc 96Asn Thr Leu Lys Phe Glu Ser Asn Ile Asp Leu Asp Thr Ile Asp Phe20 25 30acc agc atc aag aat gat ctt gca aat gtt ttg att aca cca gtc cct 144Thr Ser Ile Lys Asn Asp Leu Ala Asn Val Leu Ile Thr Pro Val Pro35 40 45ctg gat caa tca cgt agc aaa ctt gga gac gca tca aaa cca gtg gcg 192Leu Asp Gln Ser Arg Ser Lys Leu Gly Asp Ala Ser Lys Pro Val Ala50 55 60ttg ccc agt gga gat gag gtg aaa ttg aat caa gca tca att gaa att 240Leu Pro Ser Gly Asp Glu Val Lys Leu Asn Gln Ala Ser Ile Glu Ile65 70 75 80act gga gtt tta tca aat gaa ttg gat tta gat gaa cta aat aca gca 288Thr Gly Val Leu Ser Asn Glu Leu Asp Leu Asp Glu Leu Asn Thr Ala85 90 95gag ttg tta tat aac gca agt gac ttg agc tac aag aag 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Ile345135013551360Leu Asn Tyr Ser Phe Lys Asn Phe Glu Val Gln Lys Tyr Glu Trp Leu136513701375Asp Gln Lys Phe Asn Val Ser Leu Leu Leu Ala Glu Val Asn Ala Gln138013851390Lys Asn Gly Thr Leu Asp Phe Ser Val Leu Thr Lys Val Phe Arg Leu139514001405Leu Cys Gln Thr Ser Asn Leu Ile Thr Pro Glu Ser Lys Gln Leu Phe141014151420Ala Glu Glu Ile Met Val Glu Gly Ser Lys Ile Ser Asp Phe Val Thr425143014351440Lys Tyr Leu Val Ser Thr Asp Leu Lys Asp Val Gln Leu Lys Cys Leu144514501455His Ser Trp Cys Gln Leu Ile Glu Ile Leu Val Thr Asp Ser Gly Ile146014651470Asn Ser Leu Asn Phe Ile Leu Glu Val Leu Gln Val Ile Ile Pro Lys147514801485Ile Asn Asp Tyr Phe Asp Val Asp Ile Leu Phe Ser Glu Glu Met Val149014951500Ser Leu Cys Val Leu Leu Phe Asp Leu Tyr Asp Gln Leu Thr Leu Ala505151015151520Asp Arg Lys Gly Glu Asp Phe Ala Leu Gly Ile Glu Arg Leu Ile Pro152515301535Leu Phe Gln Thr Cys Ile Ala Gly Ile Leu Asn Ser Asn Ser Thr Pro154015451550Ser Leu Arg Ser Asp Leu Tyr Val Val Gly Asn Lys Phe Leu Leu 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accccaacac 420aacacccaac ccnaaaacac ccaacacctc catcttgtcc cgcttttctc tcacattttt 480tctctactac tatcacacaa tctataaaac atacaccccc tcaacccctc ctccccaaca 540aacctacctc cctcaactcc tatttcctcc cttcc575序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用该基因筛选抗真菌物质的方法<130>SEQID09<140><141><160>2<170>patentIn Ver.2.1<210>1<211>921<212>DNA<213>白色念珠菌<220><221>CDS<222>(1)..(918)<220><221>基因<222>(1)..(918)<223>基因CaOR110<400>1atg acg att gaa act att tat atc gca aga cac ggt tat aga tcc aat 48Met Thr Ile Glu Thr Ile Tyr Ile Ala Arg His Gly Tyr Arg Ser Asn1 5 10 15tgg tta cca cca cca cac cca cca aat cct act ggt att gac agt gac 96Trp Leu Pro Pro Pro His Pro Pro Asn Pro Thr Gly Ile Asp Ser Asp20 25 30ccg gct tta gca cca cat ggt gtt gaa caa gcc caa cag tta gct gcc 144Pro Ala Leu Ala Pro His Gly Val Glu Gln Ala Gln Gln Leu Ala Ala35 40 45tat ctt aca tca ttacct aca cat gaa aag cct gaa ttt att att gct192Tyr Leu Thr Ser Leu Pro Thr His Glu Lys Pro Glu Phe Ile Ile Ala50 55 60tca cct ttt tat cgt tgt ata gaa acg tcg aga ccc att gcc gaa atg 240Ser Pro Phe Tyr Arg Cys Ile Glu Thr Ser Arg Pro Ile Ala Glu Met65 70 75 80ttg gac ttg aag att gct tta gaa aga gga gtt ggt gaa tgg ttt cgt288Leu Asp Leu Lys Ile Ala Leu Glu Arg Gly Val Gly Glu Trp Phe Arg85 90 95aaa aat aga gat acc aaa cca gtt ccc ggt gat tac aca caa ttg aga336Lys Asn Arg Asp Thr Lys Pro Val Pro Gly Asp Tyr Thr Gln Leu Arg100 105 110aca ttt ttc gat aaa tta ttg atc gat gaa gat act tgg cca aga gat384Thr Phe Phe Asp Lys Leu Leu Ile Asp Glu Asp Thr Trp Pro Arg Asp115 120 125aac tta aat gtt ata cct aat att gaa gga gaa gat tat gat gaa atc432Asn Leu Asn Val Ile Pro Asn Ile Glu Gly Glu Asp Tyr Asp Glu Ile130 135 140tac gat cgt gcc aaa ttg ttt tgg aaa aag ttt att cct gaa ttt gaa480Tyr Asp Arg Ala Lys Leu Phe Trp Lys Lys Phe Ile Pro Glu Phe Glu145 150 155 160aag aaa ttc ccc gaa att aaa aat gtg ttg ata gtt aca cat gca gca528Lys Lys Phe Pro Glu Ile Lys Asn Val Leu Ile Val Thr His Ala Ala165 170 175acg aaa att gct tta gga tca gct tta tta cag tta aaa tca 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Ile130 135 140tac gat cgt gcc aaa ttg ttt tgg aaa aag ttt att cct gaa ttt gaa 480Tyr Asp Arg Ala Lys Leu Phe Trp Lys Lys Phe Ile Pro Glu Phe Glu145 150 155 160aag aaa ttc ccc gaa att aaa aat gtg ttg ara gtt aca cat gca gca 528Lys Lys Phe Pro Glu Ile Lys Asn Val Leu Ile Val Thr His Ala Ala165 170 175acg aaa att gct tta gga tca gct tta tta cag tta aaa tca gtt act 576Thr Lys Ile Ala Leu Gly Ser Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Val Thr180 185 190gat gtt ata gat gat aat caa act gtg tta cgt gct ggt gca tgt tca 624Asp Val Ile Asp Asp Asn Gln Thr Val Leu Arg Ala Gly Ala Cys Ser195 200 205tta tcc aaa ttt gtt aga gat ggc gaa gat aaa acc aat cat act att 672Leu Ser Lys Phe Val Arg Asp Gly Glu Asp Lys Thr Asn His Thr Ile210 215 220caa tgg aaa att gtc atg aat ggt aat tgt gaa ttc ttg aca cag ggt 720Gln Trp Lys Ile Val Met Asn Gly Asn Cys Glu Phe Leu Thr Gln Gly225 230 235 240gaa gaa atg aac tgg gat ttc cgt cgt ggt gtt gaa gcc ggg tca gct 768Glu Glu Met Asn Trp Asp Phe Arg Arg Gly Val Glu Ala Gly Ser Ala245 250 255gaa gat ata gcg caa aga aag gca gca gca gaa gca gaa gca aaa gca 816Glu Asp Ile Ala Gln Arg Lys Ala Ala Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala
260 265 270ttg aag aaa aat gaa caa acc aaa tcc gat ggt ccc atc act gaa tct864Leu Lys Lys Asn Glu Gln Thr Lys Ser Asp Gly Pro Ile Thr Glu Ser275 280 285gcc act ggg gca gaa ata gat ggg aat gaa gat gaa ttt gaa aca ttt912Ala Thr Gly Ala Glu Ile Asp Gly Asn Glu Asp Glu Phe Glu Thr Phe290 295 300tat gta acc atc gat ata cct tca att tcg aat aaa atc gac aat gaa960Tyr Val Thr Ile Asp Ile Pro Ser Ile Ser Asn Lys Ile Asp Asn Glu305 310 315 320gaa gaa cca cca tca agg aca ggt caa gct cca aaa ttc aaa aac aat1008Glu Glu Pro Pro Ser Arg Thr Gly Gln Ala Pro Lys Phe Lys Asn Asn325 330 335att atc aag cct tca gca caa ctc caa ttt act gat tta aaa gaa gat1056Ile Ile Lys Pro Ser Ala Gln Leu Gln Phe Thr Asp Leu Lys Glu Asp340 345 350cat cca tta gta aaa ata tcg aac aat act ata tct gct caa ggc tcg1104His Pro Leu Val Lys Ile Ser Asn Asn Thr Ile Ser Ala Gln Gly Ser355 360 365tcg tcg tcg tcg tta tca gcg tcg aaa aat gga ttt aat agt cat act1152Ser Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Lys Asn Gly Phe Asn Ser His Thr370 375 380cac aat tca gga gtc att gat cca tca gca ctt ata gat ggg aaa att1200His Asn Ser Gly Val Ile Asp Pro Ser Ala Leu Ile Asp Gly Lys Ile385 390 395 400tat cag act gat tgg aat caa tta caa ggt act gaa cta ata ttt gat1248Tyr Gln Thr Asp Trp Asn Gln Leu Gln Gly Thr Glu Leu Ile Phe Asp405 410 415gaa aat ggt caa ttt ata ggc aag gtt aag gaa cat ttg act tgc aat1296Glu Asn Gly Gln Phe Ile Gly Lys Val Lys Glu His Leu Thr Cys Asn420 425 430aat aac aca aaa ttc aca tta aaa aag gca gaa gaa gta gaa caa ctt1344Asn Asn Thr Lys Phe Thr Leu Lya Lys Ala Glu Glu Val Glu Gln Leu435 440 445cgt tca gca gat gat tct atc atg gat ata gat caa gac tca caa gga1392Arg Ser Ala Asp Asp Ser Ile Met Asp Ile Asp Gln Asp Ser Gln Gly
450 455 460caa caa cca gct aga agt cag ttc tta aaa aga gca att gtg gct gct 1440Gln Gln Pro Ala Arg Ser Gln Phe Leu Lys Arg Ala Ile Val Ala Ala465 470 475 480aga gcc aaa ggt aa1454Arg Ala Lys Gly<210>2<211>484<212>PRT<213>人工序列<223>人工序列描述前切变体<400>2Met Thr Ile Glu Thr Ile Tyr Ile Ala Arg His Gly Tyr Arg Ser Asn1 5 10 15Trp Leu Pro Pro Pro His Pro Pro Asn Pro Thr Gly Ile Asp Ser Asp20 25 30Pro Ala Leu Ala Pro His Gly Val Glu Gln Ala Gln Gln Leu Ala Ala35 40 45Tyr Leu Thr Ser Leu Pro Thr His Glu Lys Pro Glu Phe Ile Ile Ala50 55 60Ser Pro Phe Tyr Arg Cys Ile Glu Thr Ser Arg Pro Ile Ala Glu Met65 70 75 80Leu Asp Leu Lys Ile Ala Leu Glu Arg Gly Val Gly Glu Trp Phe Arg85 90 95Lys Asn Arg Asp Thr Lys Pro Val Pro Gly Asp Tyr Thr Gln Leu Arg100 105 110Thr Phe Phe Asp Lys Leu Leu Ile Asp Glu Asp Thr Trp Pro Arg Asp115 120 125Asn Leu Asn Val Ile Pro Asn Ile Glu Gly Glu Asp Tyr Asp Glu Ile130 135 140Tyr Asp Arg Ala Lys Leu Phe Trp Lys Lys Phe Ile Pro Glu Phe Glu145 150 155 160Lys Lys Phe Pro Glu Ile Lys Asn Val Leu Ile Val Thr His Ala Ala
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170 175tat aat gca gct gtt ggt aaa aag ttt att gct ttg tcg att cct gtt576Tyr Asn Ala Ala Val Gly Lys Lys Phe Ile Ala Leu Ser Ile Pro Val180 185 190tta ctt cag ttt att att gca aac aac cca caa agc agc ata ttg caa624Leu Leu Gln Phe Ile Ile Ala Asn Asn Pro Gln Ser Ser Ile Leu Gln195 200 205aga ttg aaa tcg aat ctc cac gtt gaa gat gat ggg aag agg ttg tca672Arg Leu Lys Ser Asn Leu His Val Glu Asp Asp Gly Lys Arg Leu Ser210 215 220cgt gct cat ctg caa aaa tcc cat agc aaa att gcc caa caa att gat720Arg Ala His Leu Gln Lys Ser His Ser Lys Ile Ala Gln Gln Ile Asp225 230 235 240gat gat ttc acc aat gat tct tta acc ttg aca gat atc act gaa aag768Asp Asp Phe Thr Asn Asp Ser Leu Thr Leu Thr Asp Ile Thr Glu Lys245 250 255gca ttt tcg tcg atg aaa tct ttt ttc aat acc aat gct gcc agt caa 816Ala Phe Ser Ser Met Lys Ser Phe Phe Asn Thr Asn Als Ala Ser Gln260 265 270atc tct gaa gtg aca aga gct gtt gtc caa cac sat att ctc sat gga 864Ile Ser Glu Val Thr Arg Ala Val Val Gln His Asn Ile Leu Asn Gly275 280 285acc gat 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cct cat ggt aat ggg ttt gct act att tta 2592Phe Gln Glu Arg Gly Leu Pro His Gly Asn Gly Phe Ala Thr Ile Leu850 855 860cga act gtc gat agt gtt aac agt act aat gat ggg tta att tat act 2640Arg Thr Val Asp Ser Val Asn Ser Thr Asn Asp Gly Leu Ile Tyr Thr865 870 875 880tat gat agt aaa tat ttg cag tca cca aga gta agt gat ttg aaa gat 2688Tyr Asp Ser Lys Tyr Leu Gln Ser Pro Arg Val Ser Asp Leu Lys Asp885 890 895gcc atg tca aca cat agg ggt ata agg tta tct aaa cca aat ttt ggt 2736Ala Met Ser Thr His Arg Gly Ile Arg Leu Ser Lys Pro Asn Phe Gly900 905 910ggt gcc aat gga act gct aat atg acg gat tct gct tct aca tcc aat 2784Gly Ala Asn Gly Thr Ala Asn Met Thr Asp Ser Ala Ser Thr Ser Asn915 920 925gga tct gtg ttg aat aaa aat atg caa act aca gat gtt gat tca att 2832Gly Ser Val Leu Asn Lys Asn Met Gln Thr Thr Asp Val Asp Ser Ile930 935 940tta agt ggt ctt gaa agt gaa gac gaa gct gcg ttt gtt gtt taa 2877Leu Ser Gly Leu Glu Ser Glu Asp Glu Ala Ala Phe Val Val945 950 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820 825 830Gly Asp Ile Thr Met Ile His Ser Glu Ile Leu Gln Tyr Ser Gln His835 840 845Phe Gln Glu Arg Gly Leu Pro His Gly Asn Gly Phe Ala Thr Ile Leu850 855 860Arg Thr Val Asp Ser Val Asn Ser Thr Asn Asp Gly Leu Ile Tyr Thr865 870 875 880Tyr Asp Ser Lys Tyr Leu Gln Ser Pro Arg Val Ser Asp Leu Lys Asp885 890 895Ala Met Ser Thr His Arg Gly Ile Arg Leu Ser Lys Pro Asn Phe Gly900 905 910Gly Ala Asn Gly Thr Ala Asn Met Thr Asp Ser Ala Ser Thr Ser Asn915 920 925Gly Ser Val Leu Asn Lys Asn Met Gln Thr Thr Asp Val Asp Ser Ile930 935 940Leu Ser Gly Leu Glu Ser Glu Asp Glu Ala Ala Phe Val Val945 950 955序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用该基因筛选抗真菌物质的方法<130>SEQIDl2<140><141><160>1<170>patentIn Ver.2.1<210>1<211>594<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述Sc YMR212c的同源片段<400>1atcacctgtg aacaacccac catccaagtt ttcacacaaa acaccaaatg ttttgacaac 60atttttacac aaggcaagat ccttagtgtt ggcaatcagt tgcaagatat agcacacttg 120aaaggcaaaa acattcaagt tttcactaca ttttttgatt aattcctgaa taatggctaa 180tgtgacttgt aaattaccag tacggtttct accaacatca tgatgagttt tatctttcaa 240aaaattaatc accttttcta atttgactct acgagtggat gcatagtata ataaataact 300taactcggac gagttgggtt ttttgtccac tgctttccca gcaggataac attgtaatat 360taacttttga tgtttatgtt gaaacaaatt cattcttgga tctggaagtt gaagaaacta 420ttgaatcaaa acaggattta attaaccaat agaaaagaag taactcttga gttaaaaagg 480atattcttga tgaaaaaaag gagaaaaaag gggaaagaag actctgaaaa tgaattaaag 540aaacaagaaa aaagtgatca aatgattgaa taaatgaaag taggtaaaaa atga 594序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用该基因筛选抗真菌物质的方法<130>SEQID13<140>
<141>
<160>2<170>patentIn Ver.2.1<210>1<211>3771<212>DNA<213>白色念珠菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(3771)<220>
<221>基因<222>(1)..(3771)<223>基因CaDR325<400>1atg gat ata cca cca aaa cca act ctt aag gca att aag aaa ttt aga 48Met Asp Ile Pro Pro Lys Pro Thr Leu Lys Ala Ile Lys Lys Phe Arg1 5 10 15act ttg gat gaa ata aaa tat gcc atg aaa cat gtt ttc caa gat gct 96Thr Leu Asp Glu Ile Lys Tyr Ala Met Lys His Val Phe Gln Asp Ala20 25 30caa tta ggt tta gca gga cat aga aaa tta gtg gta att ttg aaa aat 144Gln Leu Gly Leu Ala Gly His Arg Lys Leu Val Val Ile Leu Lys Asn35 40 45gta ttt aaa aaa gcc att gaa tta aat caa att aat ttc ttt gcc atg 192Val Phe Lys Lys Ala Ile Glu Leu Asn Gln Ile Asn Phe Phe Ala Met50 55 60tgt ttt act aaa ttg tta tct aaa gta tta cct ttg aaa aga gga gtt 240Cys Phe Thr Lys Leu Leu Ser Lys Val Leu Pro Leu Lys Arg Gly Val65 70 75 80ttg gca ggt gat aga ata gtc aaa ttt tgt tat ctg ttt gtt aat ggt288Leu Ala Gly Asp Arg Ile Val Lys Phe Cys Tyr Leu Phe Val Asn Gly85 90 95ctt gta aaa gat gcc aat gaa gaa aaa cgt tcc aaa gaa gaa gaa aaa336Leu Val Lys Asp Ala Asn Glu Glu Lys Arg Ser Lys Glu Glu Glu 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220gaa ttt agt att gaa ggt gat act gga gaa ttt gag gat gaa tta ata720Glu Phe Ser Ile Glu Gly Asp Thr Gly Glu Phe Glu Asp Glu Leu Ile225 230 235 240tca agt aac caa att cag aat aaa ttg ata aat tcc att caa aat gat768Ser Ser Asn Gln Ile Gln Asn Lys Leu Ile Asn Ser Ile Gln Asn Asp245 250 255gat agt cca gaa gtc aga cgt gca gca tta atg aat ttg gtt aaa aca816Asp Ser Pro Glu Val Arg Arg Ala Ala Leu Met Asn Leu Val Lys Thr260 265 270caa gat aca ata ccg att tta ctt gaa cga gcc aga gat tcc aat tct864Gln Asp Thr Ile Pro Ile Leu Leu Glu Arg Ala Arg Asp Ser Asn Ser275 280 285att aat aga aga ttg gtt tat tct aaa ata gct cgt gaa tta ata act912Ile Asn Arg Arg Leu Val Tyr Ser Lys Ile Ala Arg Glu Leu Ile Thr290 295 300gat ttg gat gat ctt gaa ttt gaa gat agg gaa ttt tta tta aaa tgg960Asp Leu Asp Asp Leu Glu Phe Glu Asp Arg Glu Phe Leu Leu Lys Trp305 310 315 320ggg tta aat gat cgt gat gaa act gtt aaa gca gcc gcc act aaa atg1008Gly Leu Asn Asp Arg Asp Glu Thr Val Lys Ala Ala Ala Thr Lys Met325 330 335ctt acc att tat tgg tat caa tct gtc aat gaa gat tta tta gaa tta1056Leu Thr Ile Tyr Trp Tyr Gln Ser Val Asn Glu Asp Leu Leu Glu Leu340 345 350att gat caa tta aat gtc aag agt gct ata gct gaa cag gcc ata tta1104Ile Asp Gln Leu Asn Val Lys Ser Ala Ile Ala Glu Gln Ala Ile Leu355 360 365gca ttt ttt aaa aat aaa cca gaa gtt ctt gaa act att aaa att gat1152Ala Phe Phe Lys Asn Lys Pro Glu Val Leu Glu Thr Ile Lys Ile Asp370 375 380gaa tca tat tgg aaa aat cta act aca gaa aag gca ttc ttg atg agg1200Glu Ser Tyr Trp Lys Asn Leu Thr Thr Glu Lys Ala Phe Leu Met Arg385 390 395 400acg ttt tat caa tat tgt aat gag aat caa tta cat gct tta atg gat1248Thr Phe Tyr Gln Tyr Cys Asn Glu Asn Gln Leu His Ala Leu Met Asp405 410 415gcc aat ttc cct gaa tta ctt gat ttg tca ata aca tta gaa aag tat1296Ala Asn Phe Pro Glu Leu Leu Asp Leu Ser Ile Thr Leu Glu Lys Tyr420 425 430ttg tca gtg agg ttg aaa act ata aat gaa aat gaa aat tta gtt aag1344Leu Ser Val Arg Leu Lys Tht Ile Asn Glu Asn Glu Asn Leu Val Lys435 440 445aca tgg gaa act tat aat gcc aag att gac gaa tta gat gat caa ata1392Thr Trp Glu Thr Tyr Asn Ala Lys Ile Asp Glu Leu Asp Asp Gln Ile450 455 460ttt agt ctt gaa aac cag att tcc aga ata aat act gat gcc gat aat 1440Phe Ser Leu Glu Asn Gln Ile Ser Arg Ile Asn Thr Asp Ala Asp Asn465 470 475 480ttc cgt aaa agt tta tct aac att gaa gaa gat att att gaa atc aat 1488Phe Arg Lys Ser Leu Ser Asn Ile Glu Glu Asp Ile Ile Glu Ile Asn485 490 495att gct aag gat ttg ttc aaa aag aga att aaa caa ttg aaa aac aac 1536Ile Ala Lys Asp Leu Phe Lys Lys Arg Ile Lys Gln Leu Lys Asn Asn500 505 510agt ggg aat cta gaa gat ttg att act gaa gaa aat caa gag att gct 1584Ser Gly Asn Leu Glu Asp Leu Ile Thr Glu Glu Asn Gln Glu Ile Ala515 520 525gat caa atc aag gat ttc ctg atg gaa gat ttg caa caa caa ttg gaa 1632Asp Gln Ile Lys Asp Phe Leu Met Glu Asp Leu Gln Gln Gln Leu Glu530 535 540gat atc aat aaa aat ctt gat gaa att gaa cat cat cca gaa gat ata 1680Asp Ile Asn Lys Asn Leu Asp Glu Ile Glu His His Pro Glu Asp Ile545 550 555 560acg gct aaa tta 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Ser His Leu Trp Gln Cys Val Tyr Leu1010 1015 1020Leu Gln Val Val Glu Gln Val Asp Ala Arg Asn Val Lys Arg Cys Ile025103010351040Ile Asn Asn Leu Asn Lys Phe His Ile Thr Glu Glu Leu Glu Ser Asn104510501055Gln Leu Gln Ala Leu Ile Lys Ala Leu Asp Ala Thr Val Glu Leu Phe106010651070Thr Asn Asn Glu Asp Asn Pro Asn Phe Ile Leu Asp Lys Pro Thr Lys107510801085Lys Asn Phe Asp Thr Phe Ile Glu Ser Ile Lys Asn Lys Leu Glu Ile109010951100Ala Gln Lys Arg Glu Glu Asn Glu Leu Ile Lys Ser Gly Thr Asn Ser105111011151120Ile Leu His Glu Leu Asp Asp Leu Asp Ile Gly Thr Gly Glu Ser Ser112511301135Gln Ile Ser Ile Lys Ser Glu Thr Lys Arg Arg Asp Leu Asp Arg Ser114011451150Leu Gln Val Ser Lys Thr Thr Ser Pro Glu Thr Ser Glu Asn Glu Asp115511601165Glu Glu Asp Asp Asn Glu Glu Glu Glu Gln Glu Lys Lys Lys Ser Phe117011751180Thr Asp Gly Lys Asn Lys Leu Glu Leu Lys Ala Asp Lys Pro Ile Thr185119011951200Phe Lys Ala Glu Asp Lys Arg Glu Gly Ser Val Glu Thr Asp His Gly12 12101215Gln Glu Gln Val Leu Val Glu Ser Lys Lys Val 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tattaataga 600aga 603序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用该基因筛选抗真菌物质的方法<130>SEQID15<140><141><160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>581<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述Sc YDR325的同源片段<400>1ggggttaaat gatcgtgatg aatctgttaa agcagccgcc tttaaaatgc taaccattta 60ttggtatcaa tctgtcaatg aagatttatt agaattaatt gatcaattaa atgtcagaag 120tgctatagct gaacaggcca tattagcatt ttttaaaaat aaaccagaag ttcttgcaac 180tattaaaatt gatgaatcat attggaaaaa tctaactaca gaaaaggcat tcttgatgag 240gacgttttat caatattgta atgagaatca attacatgct ttaatggatg ccaatttccc 300tgaattactt gatttgtcaa taacattaga aaagtatttg tcagtgaggt tgaaaacaat 360aaatgaaaat gaaaatttaa ttaagacatg ggaaacttat aatgccaaga ttgacgaatt 420agatgatcaa atatttagtc ttgaaaacca gatttccaga ataaatactg atgccgataa 480tttccgtaaa agtttatcta acattgaaga agatattatt gaaatcaata ttgctaagga 540tttgttcaaa aagagaatta aacaattgaa aaactgagca c 581序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用该基因筛选抗真菌物质的方法<130>SEQID16<140><141><160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>662<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述Sc YDR325的同源片段<400>1tggtgactca attcatttga tgcaccaaaa ttacaatgca ttgtcgctga gtagattatg 60caaattgttt ttagccgata ttttgtacaa gactgacaaa cggatttatt tggaaatgct 120attcaaggtg gtggtggtgg tgatgatcca actaccacca atgacgatga aactgaagaa 180gaaacagatc gagagcatga aaagcattta tttgaagcga ttgtacttat ttatttcaac 240cccaacacca aatcaaatca agaattacaa caaattttgt cattttgtat tccagtttat 300gccttttctc atataaatca tcaaatcaat ttagctgcag ttagtggtga tgttatttat 360cgacttttca ctgaaacaga aacagaatta tcaccaagtg ttataatccc tcaattaata 420tcatggtgtg atcctcgaaa tttagttaaa ttatcgaatg aggaaataaa tcaagcaaca 480tcacatttat ggcaatgtgt ttatttatta caagtggttg aacaagtaga tgctcgtaat 540gttaaaagat gcatcattaa caatttgaat aaatttcata taacggaaga attagaatca 600aatcaattac aagctttaat taaagctctt gatgctacag ttgaattatt tactaataat 660ga662序列表<110>Hoechst Marion Roussel<120>白色念珠菌中的必需基因及用该基因筛选抗真菌物质的方法<130>SEQID17<140><141><160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>231<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述Sc YOR110的同源片段<400>1atatgtgttg atagttacac atgcagcaac gaaaattgct ttaggatcag ctttattaca 60gttaaaatca gttactgatg ttatagatga taatcaaact gtgttacgtg ctggtgcatg 120ttcattatcc aaatttgtta gagatggcga agataaaacc aatcatacta ttcaatggaa 180aattgtcatg aatggtaatt gtgaattctt gacacagggt gaagaaatga a 23权利要求
1.具有在SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.6，SEQ IDNO.7，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10，SEQ ID NO.11或者SEQ ID NO.13所示序列的多核苷酸，其同系物及其功能片段。
2.如权利要求1所述的只有SEQ ID NO2.，SEQ ID NO.4，SEQ IDNO.6，SEQ ID NO.9，SEQ ID NO.10或者SEQ ID NO.11所述序列的多核苷酸，其同系物及其功能片段。
3.如权利要求1所述的多核苷酸，它是基因CaNL256，其同系物及其功能片段。
4.如权利要求1所述的多核苷酸，它是基因CaBR102，其同系物及其功能片段。
5.如权利要求1所述的多核苷酸，它是基因CaIR012，其同系物及其功能片段。
6.如权利要求1所述的多核苷酸，它是基因CaMR212，其同系物及其功能片段。
7.如权利要求1所述的多核苷酸，它是基因CaDR325，其同系物及其功能片段。
8.如权利要求1所述的多核苷酸，它是基因CaOR110，其同系物及其功能片段。
9.如权利要求1所述的多核苷酸，它是基因CaJL039，其同系物及其功能片段。
10.如权利要求3到9中任一权利要求所述的基因，其中的功能相似基因，在核苷酸水平上，有至少50％的序列同一性，优选有至少60％的序列同一性，最优选有至少70％的序列同一性。
11.如权利要求3到9中任一权利要求所述的基因，其中，功能相似基因，在氨基酸水平上，与编码蛋白质要有至少40％的序列同一性，优选有至少50％的序列同一性，更优选有至少60％的序列同一性，最优选有至少70％的序列同一性。
12.如权利要求1到11中任一权利要求所述的多核苷酸编码的蛋白质，其功能性多肽片段。
13.含有如权利要求3到9中任一权利要求所述的基因的质粒。
14.保藏在CNCM中编号为I-2065的质粒。
15.保藏在CNCM中编号为I-2063的质粒。
16.保藏在DSMZ中编号为DSM12977的质粒。
17.保藏在DSMZ中编号为DSM12976的质粒。
18.保藏在DSMZ中编号为DSM12978的质粒。
19.保藏在DSMZ中编号为DSM12979的质粒。
20.可用包括以下步骤的方法得到的多核苷酸，其同系物及其功能片段(i)从酿酒酵母中挑选一个必需基因；(ii)比较该基因序列与白色念珠菌基因组序列；(iii)推断同源寡核苷酸区域；(iv)PCR扩增这样得到的寡核苷酸；(v)使用步骤(iv)的扩增引物检测感兴趣的完整基因。
21.如权利要求20所述的多核苷酸，其中步骤(v)包括使用步骤(iv)的扩增引物作为探针，从白色念珠菌基因组文库中检测感兴趣的完整基因的步骤。
22.如权利要求20所述的多核苷酸，其中步骤(v)包括使用步骤(iv)的扩增引物作为探针，从白色念珠菌cDNA文库中检测感兴趣的完整基因的步骤。
23.如权利要求20所述的多核苷酸，其中步骤(v)包括使用PCR方法延伸扩增引物的3’和5’端的步骤。
24.一种抗如权利要求12所述的蛋白质或其功能多肽片段的抗体。
25.一种筛选抗真菌物质的方法，其中真菌中的一种必需基因或者其它真菌中的功能相似基因或者相应的编码蛋白质，被用作靶，其中的必需基因如权利要求3到9中任一权利要求所述。
26.如权利要求25所述的方法，其中将以不同水平表达必需基因或者功能类似真菌基因的真菌细胞，与被测试物质一起保温，并且测定该物质的生长抑制效果。
27.如权利要求25所述的方法，其中将所说的靶基因或者相应靶所编码的蛋白质，与被测试物质在体外接触，并且测定该物质对于靶的作用。
28.如权利要求25到27中任一权利要求所述的方法，其中被筛选物质部分或全部抑制必需基因的功能表达，或者部分或全部抑制所编码蛋白质的功能活性。
29.如权利要求25到28中任一权利要求所述的方法，其中被筛选物质部分或全部抑制二氢蝶酸合酶(DHPS)和/或7，8-二氢-6-羟甲基蝶呤-焦磷酸激酶(HPPK)的活性。
30.如权利要求25到29中任一权利要求所述的方法，其中真菌选自担子菌属(Basidiomycetes)，子囊菌属(Ascomycetes)和丝孢菌属(Hyphomycetes)。
31.如权利要求25到30中任一权利要求所述的方法，其中所说的功能相似基因是念珠菌属的种(Candida Spp.)或者曲霉属的种(Aspergillus Spp.)的必需基因。
32.如权利要求31所述的方法，其中所说的功能相似基因是白色念珠菌(candida albicans)或者烟曲霉(Aspergillusfumigatus)的必需基因。
33.如权利要求25到32中任一权利要求所述的方法，其中的功能相似基因与相应必需基因，在核苷酸水平上，有至少50％的序列同一性，优选有至少60％的序列同一性，最优选有至少70％的序列同一性。
34.如权利要求25到33中任一权利要求所述的方法，其中的功能相似基因编码的蛋白质与相应必需基因编码的蛋白质，在氨基酸水平上，要有至少40％的序列同一性，优选有至少50％的序列同一性，更优选有至少60％的序列同一性，最优选有至少70％的序列同一性。
35.一种诊断真菌感染的试剂盒，其中包括选自CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325和CaJL039，其功能相似基因，其功能片段的基因，相应编码蛋白质或其功能多肽片段，或者一种抗体，该抗体抗选自CaOR110，CaMR212，CaNL256，CaBR102，CaIR012，CaDR325和CaJL039或其功能相似基因编码的蛋白质或其多肽片段。
全文摘要
本发明涉及白色念珠菌(C.A1bicans)中的必需基因及用该基因在筛选抗真菌物质的应用。
文档编号C07K14/37GK1331753SQ99813209
公开日2002年1月16日 申请日期1999年9月13日 优先权日1998年9月11日
发明者J·－L·拉兰尼, C·罗彻尔, N·查尔瓦茨斯, T·莱乌, D·马格里, A·尼特舍, J·雷恩哈德－鲁普 申请人:艾文蒂斯药品公司