一种高效表达抗癌基因的受特定miRNA调控的在胶质瘤细胞中特异增殖的腺病毒及其用途
【专利摘要】本发明提供了一种受miRNA调节的能够在胶质瘤细胞中特异性増殖的重组腺病毒载体。其特征在于：在该病毒的至少一个增殖必需基因的3端非翻译区中插入至少一个miRNA的靶点核苷酸序列；所述的miRNA在胶质瘤细胞中表达缺失或降低而在神经元和胶质细胞中表达正常，从而使得经此改造后的重组腺病毒在缺失或低表达所述miRNA的腺病毒中特异性的増殖，而在正常表达所述miRNA的正常细胞中不增殖，因此不会对其产生细胞毒性。
【专利说明】—种高效表达抗癌基因的受特定miRNA调控的在胶质瘤细胞中特异增殖的腺病毒及其用途
[0001]发明领域:
本发明一般的涉及重组腺病毒载体。跟具体地说说，本发明涉及一种基于HIiRNA的调控可在胶质瘤细胞内特异性增殖的重组腺病毒载体以及其构建方法和用途。
[0002]【背景技术】:
基因治疗是一种新型的治疗手段，可治疗多种疾病，包括癌症、遗传病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病。过去几年里，全世界的基因治疗取得了巨大的进步。截止2008年9月，临床试验总数已达1432项，第一个基因治疗药物-“今又生”已由我国深圳赛百诺公司自主研发，并获准上市(参见 http://www.wiley.c0.uk/genmed/clincal/)。 [0003]腺病毒是目前基因治疗最常见的载体之一，全球近1/4的基因治疗临床试验方案采用腺病毒作为载体。腺病毒相比较于其他载体的优势在于:(1)装载容量大；(2)能够感染的细胞种类广泛，转导率较高，能够有效转导分裂期和非分裂期的细胞；(3)在细胞中以游离状态存在，不整合到靶细胞基因组中，因而不会引起插入突变，无致癌性；(4)滴度高(可达1012vp/mL)，稳定性好，便于储存和运输，易于规模化生产和运输。
[0004]人腺病毒分为A，B，C，D，E，F六个亚属共49个血清型。目前应用于基因治疗的腺病毒载体绝大多数是C亚属的2及5血清型腺病毒。随着病毒学，分子生物学等学科的发展，人们已经完成了多个腺病毒全基因组的测序，并对其基因的结构及其功能进行了较为详细的研究，能有效地对腺病毒基因进行改造。例如，以组织特异性启动子调控E1A、E1B的表达、缺失ElA的长度为24bp的Rb蛋白的结合区、缺失ElB 55kD、19kD基因等。改造后的腺病毒能在目标细胞内进行选择性复制和增殖，而在正常细胞内，増殖能力被大大削弱。
[0005]但是，改造后的腺病毒载体仍存在一定的问题，以肿瘤基因治疗为例，首先，肿瘤产生的机制非常复杂，异质性很强，病人和病人之间，肿瘤与肿瘤之间，同一肿瘤的不同肿瘤细胞之间均存在明显差异。例如，端粒酶虽然已被报道在肿瘤中异常表达，但其表达量变化较大，在某些病人、肿瘤类型或某些肿瘤细胞群体中其表达情况与正常细胞无异，这使得端粒酶启动子调控ElA的重组腺病毒载体在这种情况下不能选择性的在肿瘤细胞中有效增殖，从而影响治疗效果。其次，肿瘤组织中的物理因素如纤维化，混入正常细胞以及坏死区域也可能限制腺病毒扩散。再次，某些肿瘤细胞膜上的科萨奇腺病毒受体表达量低限制了腺病毒的感染效率。第四，病人的免疫反应限制腺病毒的増殖和扩散。目前，美国ONYX药物公司尝试单独应用Elb 55kD蛋白缺失的腺病毒(0NYX-015治疗肿瘤，其临床的有效率仅为 15-20% (Nemunaitis et al.，2000 ；US 5677178 ；US 5801029)
因此，基因治疗领域非常需要可以选择性地在肿瘤细胞中增殖而在正常细胞中不增殖的腺病毒载体系统。从而实现更有效，更特异地在肿瘤细胞中表达外源基因，同时最大限度地避免对正常细胞的细胞毒性。
[0006]微小RNA (microRNA)是生物体内源的小片段RNA，通过与靶基因成熟mRNA的3端非翻译区中的靶点核苷酸序列，抑制靶基因蛋白的翻译。微小RNA具有高度的组织特异性和时序性，在不同类型的细胞中表达水平差异大。近几年的研究表明，微小RNA表达的失调和肿瘤发生相关，多个在正常组织细胞中的表达的微小RNA在肿瘤细胞中表达确实或显著下调。
[0007]因而可借助微小RNA的调控机制及其在肿瘤组织与正常组织的表达差异，利用在肿瘤细胞中表达确实或降低而在正常细胞中表达正常的微小RNA调控腺病毒的増殖必需基因的表达不受影响，能大量増殖与复制，达到治疗目的。
[0008]
【发明内容】
_9] 发明目的
为了使得腺病毒载体选择性地在胶质瘤细胞中增殖而在正常神经和胶质细胞中不增殖，同时最大限度地避免对正常细胞的细胞毒性，我们构建由胶质瘤细胞低表达的微小RNA靶位点调控其增殖的腺病毒载体。
_0] 技术解决方案
本发明提供了一种重组腺病毒载体，其特征在于:在该腺病毒载体的至少一个増殖必需基因的3端非翻译区中插入至少一个微小RNA靶位点:所述微小RNA在肿瘤细胞中表达缺失或降低而在正常细胞中表达正常。
[0011]在一个实施方案中，所述微小RNA可以选自miR-7，miR-16, miR-19a, miR-20a,miR-26b, miR-124, miR-128, miR-129, miR-137, miR-139, miR-140, miR-146b,miR-181b, miR-184, miR-205, miR-218, miR-219_5p，miR-328 和 miR-451 中的至少一种。所述微小RNA优选选自miR-`124，miR-128, miR-146b和miR-218中的至少一种。
[0012]在一个实验方案中，所述微小RNA靶位点序列由一个或数个相同的微小RNA靶位点序列以串联重复的方式构成。
[0013]在一个实施方案中，所述微小RNA靶位点序列由一个或数个不同的微小RNA靶位点以串联重复的方式构成。
[0014]在一个实施方案中，所述的腺病毒増殖必需基因是腺病毒早期表达基因(E1A，ElB, E2，E4)或晚期表达基因。
[0015]在一个实施方案中，所述的腺病毒増殖必需基因可以同时受肿瘤特异激活顺势元件的调控，或被缺失或突变。
[0016]在一个实施方案中，所述的重组腺病毒的基因组中可操作的连接有外源基因，所述外源基因选自抑癌基因，有抑制血管生成作用的基因，前药转化酶基因，促进细胞凋亡基因，促进细胞自噬基因，抗体基因和疫苗基因中的至少一种。
[0017]在一个实施方案中，本发明还涉及重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于:在所述腺病毒载体的至少一个増殖必需基因的3端非翻译区中至少插入一个微小RNA靶位点核苷酸序列，所述微小RNA在肿瘤细胞中表达缺失或降低而在正常细胞中表达正常。
[0018]在一个实施方案中，本发明还涉及重组腺病毒载体的用途:其用于使重组腺病毒选择的在相应微小RNA表达确实或降低的肿瘤细胞中増殖，而在正常表达该微小RNA的正常细胞中不增殖。
[0019]在一个实施方案中，本发明还涉及重组腺病毒载体的用途:其用于使重组腺病毒基因组中科操作的连接的外源基因选择性的在缺乏或降低相应微小RNA表达的肿瘤细胞中表达，而在正常表达该微小RNA的正常细胞内不表达。本发明还涉及所述虫子腺病毒载体用于抑制肿瘤细胞的生长的用途。
[0020]技术效果
与现有的基因治疗方法相比，本发明有如下有益效果:
本发明在至少一个腺病毒増殖必需基因的3端非翻译区中至少插入一个在胶质瘤细胞中表达确实或降低而正常细胞表达正常的微小RNA靶位点核苷酸序列，成功实现了腺病毒在缺失或降低该微小RNA的肿瘤细胞内特异性复制和増殖，使外源基因随腺病毒复制而大量表达，达到治疗效果。而在正常表达该微小RNA的细胞，腺病毒的増殖必需基因不能合成，腺病毒不能増殖与复制，减少对正常细胞的损害。本发明还可联合肿瘤细胞特异激活的顺式作用元件(如肿瘤特异性启动子)控制腺病毒相同或其他增殖必需基因，进一步提高基因治疗的靶向性与安全性。
[0021]
【专利附图】
【附图说明】
[0022]附图1
含有5型腺病毒ElA序列的质粒pXCl，其中标注了内切酶雄a /的位置。
[0023]附图2
受miR-124，miR-128，miR-146b和miR-218调控5型腺病毒0A_4MREs在胶质瘤细胞和正常细胞中复制情况的比较。横坐标表示各种胶质瘤细胞系以及正常细胞系。纵坐标表示腺病毒0A-4MREs和Ad-WT感染细胞48小时后的病毒产量(pfu/mL)。
[0024]附图3` 受miR-124，miR-128, miR-146b和miR-218调控5型腺病毒0A_4MREs对胶质瘤细胞和正常细胞体外杀伤效果的比较。横坐标表示加入的腺病毒0A-4MRES和Ad-WT的MOI值。纵坐标表示实验孔(施加病毒)与对照孔(未施加病毒)光吸收的比值。
[0025]附图4
受miR-124，miR-128，miR-146b和miR-218调控5型腺病毒0A_4MREs对胶质瘤细胞和正常细胞体内杀伤效果的比较。横坐标表示肿瘤体积测量的时间(天)。纵坐标表示肿瘤的体积(mm3)。
【具体实施方式】
[0026]实施例1
受miR-124，miR-128, miR-146b和miR-218调控的含5型腺病毒ElA的载体构建由加拿大Microbix Biosystem公司购得含有5型腺病毒22_5790bp序列的pXCl质粒(含完整的5型腺病毒ElA区域，见附图1)，使用限制性内切酶雄a /进行酶切得到线性化pXCl载体。于上海生工公司合成引物I和引物2，该两个引物互为模板进行PCR反应，获得含有ElA的1116-1185bp序列以及单酶切位点汾I, Age /和/的双链DNA片段。使用连接酶将该双链DNA片段与线性化pXCl载体连接，得到重组质粒pXCl-BAS。pXCl-BAS中被引入了位于终止密码子TAA后的单酶切位点BstB I, Age I和Sal I。
[0027]弓丨物I (5，-3，):AACCGCCTTTGTTTGCTGAATGAGTTGATGTAAGTTTAATAAAGGGTGAGATAATGTTT
引物 2 (5’ -3’ ):
GTCGACGCAACCGGTACGTTCGAATTAAACATTATCTCACCCTTTATTAAACTTACAT于上海生工公司合成引物3-6。其中引物3和4含有各两个拷贝的miR-124和miR-128的靶位点(下划线部分)，引物5和6含有各两个拷贝的miR-146b和miR-218的靶位点(下划线部分)。引物3和4退火后与妨I /Age /双酶切处理的pXCl-BAC载体连接，得到含有miR-124和miR-128的靶位点的过渡载体pXCl_124_128。弓丨物5和6退火后与命e I /Sal /双酶切处理的pXCl-124-128载体连接，得到含有miR-124，miR-128, miR_146b和miR-218的靶位点的载体pXCl-4MREs。该载体含有受上述4种微小RNA调控的5型腺病毒ElA序列以及同于腺病毒重组的病毒基因组左臂。
[0028]引物3 (5，-3’): CGAAACAAACACCGTGCCTTAAACAAACACCGTGCCTTAAACAAACACCCACTGTGAACAAACACCCACTGTGAAA
引物 4 (5，-3，): CCGGTTTCACAGTGGGTGTTTGTTCACAGTGGGTGTTTGTTTAAGGCACGGTGTTTGTTTAAGGCACGGTGTTTGTTT
引物 5 (5’-3，): CCGGTACAAACACCGAGAACTACAAACACCGAGAACTACAAACACCTGTGCTTACAAACACCTGTGCTTG
引物 6 (5，-3，): TCGACAAGCACAGGTGTTTGTAAGCACAGGTGTTTGTAGTTCTCGGTGTTTGTAGTTCTCGGTGTTTGTA实施例2
受miR-124，miR-128, miR-146b和miR-218调控5型腺病毒的重组和包装用于腺病毒重组包装的细胞系人胚肾成纤维细胞HEK-293购自加拿大MicrobixBiosystem公司。该细胞系稳定表达5型腺病毒的ElA蛋白，并且易于转染。将含有腺病毒基因组左臂和右臂的质粒同时导入该细胞中，可以发生同源重组进而生产具有感染活性的腺病毒。将含腺病毒基因组左臂的pXCl-4MREs与含病毒基因组右臂的质粒pBHG同时转染HEK293细胞，通过同源重组获得具有感染力的腺病毒0A-4MRES。该重组腺病毒ElA的表达受到微小RNA miR-124, miR-128, miR-146b和miR-218的调控，在不表达或低表达上述微小RNA的胶质瘤细胞中ElA能够表达，从而促使腺病毒高效増殖；在正常表达上述微小RNA的正常神经细胞和胶质细胞中ElA表达受到抑制，因而阻止了腺病毒的复制，从而使得重组腺病毒0A-4MRES具备了肿瘤靶向性。
[0029]实施例3
受miR-124，miR-128，miR-146b和miR-218调控5型腺病毒0A_4MREs在胶质瘤细胞和正常细胞中复制情况的比较
将10M0I的重组腺病毒0A-4MREs和野生型腺病毒(Ad_WT，ElA表达不受miR-124，miR-128，miR-146b 和 miR-218 的调控)感染胶质瘤细胞系 U-87 MG, U-251 MG, U-373 MG和M059J，从胶质瘤病人的肿瘤组织中培养的原代细胞GT-1和GT-2以及正常细胞胶质细胞NES，正常神经细胞HCN-2，正常内皮细胞HUV-EC-C，正常肝脏细胞L-02和正常成纤维细胞MRC-5。2小时后，吸净培养基，并用PBS洗3次，再添加新鲜培液。2天后反复冻溶细胞3次后吸取上清，在HEK293细胞中使用TCID5tl法测定病毒滴度。结果见附图2。0A_4MREs在正常细胞NES，HCN-2, HUV-EC-C, L-02和MRC-5中都几乎检测不到増殖，而在胶质瘤细胞 U-87 MG, U-251 MG, U-373 MG, M059J, GT-1 和 GT-2 中，0A-4MRE 的増殖能力仅受到微弱的影响(与野生型腺病毒Ad-WT的差异无统计学意义)，仍然保持在较高水平，表现出肿瘤特异性的増殖方式。相比之下，未经改造的野生型腺病毒Ad-WT在所有细胞中均表现出很强的増殖能力，不具备肿瘤特异性。
[0030]实施例4
受miR-124，miR-128，miR-146b和miR-218调控5型腺病毒0A_4MREs对胶质瘤细胞和正常细胞体外杀伤效果的比较
将IXlO4的上述正常细胞或肿瘤细胞铺于96孔板，每孔加入0.01，0.02, 0.05,
0.1, 0.2, 0.5, I, 2，5，10, 20, 50 和 100M0I 的 0A_4MREs 和 Ad_WT，病毒感染细胞后 7天，每孔加入MTT溶液(5mg/mL) 20uL, 4小时后，加入100 μ L DMSO0用酶标仪检测595nm下每孔的吸收值。以加入病毒MOI值为横轴，实验孔与对照孔光吸收的比值为纵轴绘制细胞生长曲线，结果见附图3。0A-4MREs对正常细胞NES, HCN-2, HUV-EC-C, L-02和MRC-5几乎没有杀伤作用，而对胶质瘤细胞U-87 MG, U-251 MG, U-373 MG, M059J, GT-1和GT-2，0A-4MRE显示出很强的杀伤能力，与野生型腺病毒Ad-WT相当。因此0A-4MRE的杀伤能力表现出很强的肿瘤特异性。相比之下，未经改造的野生型腺病毒Ad-WT在所有细胞中均表现出很强的杀伤作用，不具备肿瘤特异性，对正常细胞的毒副作用较强。
[0031]实施例5
受miR-124，miR-128，miR-146b和miR-218调控5型腺病毒0A_4MREs对胶质瘤细胞和正常细胞体内杀伤效果的比 较
将U87-MG胶质瘤细胞注射至3-4周龄的雄性BalB/c小鼠(购自上海生命科学院实验动物中心)皮下(2X IO6/只)，待肿瘤生长至150 mm3左右时，将其随机分成3组(n=6)，向瘤内注射PBS或5 X IO8 pfu的0A-4MRES和野生型腺病毒Ad-WT。随后每隔7天观察肿瘤生长情况并用游标卡尺测量肿瘤大小。肿瘤体积计算公式(mm3) =长X宽X宽/2，结果见附图
4。0A-4MRES对胶质瘤细胞U-87 MG显示出很强的杀伤能力，与野生型腺病毒Ad-WT相当。
[0032]
本发明中的实施例仅用于示例性的说明本发明的具体实施方案，其不限制本申请的保护范围，任何本领域技术人员可以根据现有技术进行的等价改良都包括在本申请的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种重组腺病毒载体，其特征在于:该病毒载体的至少一个增殖必需基因的3端非翻译区中插入至少一个微小RNA靶点的核苷酸序列，所述的微小RNA在胶质瘤细胞中表达缺失或降低而在神经元和胶质细胞中表达正常。
2.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述微小RNA可以选自miR-124, miR-128, miR_146b and miR-218 中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述微小RNA靶点序列由一个或多个相同的微小RNA靶点序列以连续串联方式构成。
4.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述微小RNA靶点序列由一个或多个不同的微小RNA靶点序列以连续串联或间隔串联的方式构成。
5.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述腺病毒增殖必需基因选自腺病毒早期表达基因:E1A，ElB, E2和E4中的至少一个。
6.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述腺病毒增殖必需基因选自腺病毒晚期表达基因。
7.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述重组腺病毒的基因组中还可操作的连接有外源基因，所述外源基因选自抑癌基因，有抑制血管生成作用的基因，前药转化酶基因，促进细胞凋亡基因，促进细胞自噬基因，抗体基因和疫苗基因中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于所述重组腺病毒的基因组中还可操作的连接有选自缺氧反应元件、细胞S期特异性启动子、甲胎蛋白增强子及启动子、癌胚抗原增强子及启动子、酪氨酸酶增强子及启动子、尿激酶纤维蛋白激活剂增强子及启动子、ErbB2增强子及启动子、ErbB3增强子及启动子、ErbB4增强子及启动子、DF3乳腺癌相关抗原增强子、前列腺素特异性抗原增强子及启动子、腺血管舒缓素增强子及启动子、EB病毒中的Orip、EB病毒Orip中的FR增强子和EB病毒BamH I C-启动子中的至少一种顺式作用元件，所述顺式作用元件调控所述重组腺病毒的增殖必需基因的转录。
9.根据权利要求1所述重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于在所述腺病毒至少一个增殖必需基因的3端非翻译区中插入至少一个微小RNA的靶点核苷酸序列，所述微小RNA在胶质瘤细胞中表达缺失或降低而在神经元和胶质细胞中表达正常。
10.根据权利要求1-8中任一项所述重组腺病毒载体的用途，其特征在于所述重组腺病毒用于选择性的在缺失或低表达相应微小RNA的胶质瘤细胞中増殖，而在正常表达该微小RNA的神经元和胶质细胞内不增殖。
【文档编号】A61P35/00GK103667347SQ201210329533
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月8日 优先权日:2012年9月8日
【发明者】刘佳, 马蕾娜, 郭国财 申请人:刘佳