降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽的制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；且降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽C端酰胺化。其中将msCT第8位的缬氨酸变为甘氨酸、第16位的亮氨酸用丙氨酸置换、再删除22位的酪氨酸，msCT的生物活性由4500IU/mg提高到8600IU/mg。本发明进一步公开了融合多肽在治疗骨质疏松、心肌缺血造成的心肌梗塞药物方面的应用药物方面的应用。本发明降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽C端酰胺化可提高降钙素的活性约30倍，生物学活性为100～200IU/mg。
【专利说明】降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽的制备与应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物化学【技术领域】，涉及一种融合多肽。更具体地说是一种降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素的融合多肽及其制备方法与应用。
【背景技术】
[0002]降钙素(calcitonin，CT)可直接抑制破骨细胞(osteoclasts，0C)增殖，阻止骨溶解，促进骨形成，并能迅速减轻因骨质疏松而引起的腰锥病疼痛或发病，是治疗骨质疏松症的首选药物之一。 它还可以有效调节骨钙与血钙之间的平衡，并有镇痛作用；对治疗高血钙症、变形性骨炎、甲状腺机能亢进以及各种原因引起的骨骼疼痛(如类风湿、肿瘤)等有非常明显的效果，在骨痛病的治疗中，降钙素的镇痛效果可达吗啡的30~50倍。由于降钙素能抑制胃酸分泌，它可用于治疗急性胃溃疡；由于降钙素能抑制胰腺激素分泌及抑制酶的释放，它可用于治疗急性胰腺炎；降钙素对甲状旁腺机能亢进也有治疗作用。降钙素在慢性多关节炎及心血管疾病的治疗方面也有一定的潜力。
[0003]鲑鱼降钙素(salmon calcitonin, sCT)是天然降钙素中活性最高的一种，其活性约是人降钙素的40倍，与人降钙素具有同源性。细胞实验证明鲑鱼降钙素作用在人降钙素受体上，所产生的第二信使cAMP的量远远大于人降钙素，因此其使用量占临床用降钙素的近 50%。
[0004]降钙素基因相关妝(calcitonin gene-related peptide, CGRP)是调节心血管活动的重要神经递质之一，是迄今所知的人体最强的舒血管物质。降钙素基因相关肽扩冠状动脉作用比硝酸甘油、硝普钠强240倍，它是由辣椒素敏感的感觉神经末梢释放的一种生物活性多肽，广泛分布于神经及心血管系统。在心血管系统中，降钙素基因相关肽生物活性具有多样性，如强大的舒血管作用、抑制平滑肌细胞增殖和内皮细胞凋亡，也能促进细胞分化增殖，参与血管新生。CGRP的舒张冠状血管的作用远强于P物质(substance P，SP)、心钠素和去甲肾上腺素(norepinephrine,NE);比乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)、5_轻色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)等强10000倍左右，比异丙肾上腺素强10~100倍。CGRP血管舒张反应呈现不同程度的剂效一依赖性，即适当加大CGRP的注入剂量时反应增强，浓度低则效应缓慢，但持续时间长。Shen 等(Shen YT, Pittman TJ, Buie PS.[J].PharmacolExp Ther, 2001, 298 (3):551-558.)认为尽管外源性的a-CGRP可以引起不同部位血管床的舒张，但在正常状态下的内源性a-CGRP对血管调节并不起重要作用。经反复实验验证降钙素基因相关肽能够抑制血管平滑肌细胞增殖、保护内皮细胞和抑制血管新生，防治高血压，防止充血性心力衰竭，防治心绞痛，防治心肌梗死和治疗休克。而且具有在脊髓水平调制痛觉的功能，可调节破骨细胞骨吸收和促进成骨细胞分裂。目前市场上只有降钙素产品，而降钙素基因相关肽只停留在实验室研究阶段。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是为了得到一种既含有降钙素又含有降钙素基因相关肽的产品，而提供了一种降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽。本发明公开了如下的技术内容:降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因表达的多肽，其特征在于降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；AlaCysAspThrAlaThrCysValThrHiSArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheValProThrAsnValGlySerLysAlaPheGlyThrCysSerAsnLeuSerThrCysGlyLeuGlyLysLeuSerGlnGluAlaHisLysLeuGlnThrProArgThrAsnThrGlySerGlyThrPro ;且降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽C端酰胺化。
[0006]本发明所述的降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽，其中将msCT第8位的缬氨酸变为甘氨酸、第16位的亮氨酸用丙氨酸置换、再删除22位的酪氨酸，msCT的生物活性由 4500IU/mg 提高到 8600IU/mg。
[0007]本发明所述的降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽，其中融合多肽生物学活性为4500IU/mg，C端非酰胺化的降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽生物学活性为100 ~200IU/mg。
本发明进一步公开了一种药物组合物，主要含有降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽及一种或多种药用辅料。所述的组合物为固体制剂或液体制剂。所述的其中固体制剂为胶囊、软胶囊、片剂、含片、颗粒剂或滴丸；液体制剂为口服液或注射液。
[0008]本发明所用到的辅料指的是药学上可接受的载体、赋形剂及其它添加剂形成的化合物，可采用乳糖或淀粉做载体，明胶，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等是合适的结合剂或成颗剂。作为崩解剂可选用淀粉或微晶纤维素，常以滑石粉，胶体硅胶，硬脂酸甘油酯，硬脂酸钙或镁等作为合适的抗粘合剂和润滑剂。例如，可通过压制湿颗粒来制备片剂。活性成分与载体以及选择性的与一份崩解添加剂组成混合物，该混合物与粘合剂的含水溶液，醇性或含水醇性溶液在合适的设备中进行颗粒化，干燥颗粒随后加入其它的崩解剂，润滑剂和抗粘剂将此混合物压片。
[0009]本发明进一步公开了降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽在制备治疗骨质疏松药物方面的应用。
[0010]本发明同时也公开了降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽在制备治疗心肌缺血造成的心肌梗塞药物方面的应用。
[0011]经实验验证本发明降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽保留了降钙素基因相关肽和鲑鱼降钙素各自的酶活性；而且偶联反应产生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的速度是同时加入两种单一(降钙素基因相关肽和鲑鱼降钙素)多肽的反应体系反应速度的两倍以上，同 时过渡态时间(transienttime)大大缩短,缩短至原过渡态时间的1/4左右。
[0012]本发明为了提高msCT生物活性依据msCT生物活性对构象依存性的现象从而对其氨基酸残基进行了改造，将msCT第8位的缬氨酸变为甘氨酸、第16位的亮氨酸用丙氨酸置换、再删除22位的酪氨酸(mSCT[Gly8，Ala16，del-Tyr22])，msCT的生物活性由4500IU/mg提高到 8600IU/mg。
[0013]本发明降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽C端酰胺化可提高降钙素的活性约30倍C端酰胺化的本发明降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽生物学活性为4500IU/mg，C端非酰胺化的降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽生物学活性为100~200IU/mg)。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。
[0015]实施例1
本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽的氨基酸序列如下:AlaCysAspThrAlaThrCysValThrHisArgLeuAlaGlyLeuLeuSerArgSerGlyGlyValValLysAsnAsnPheVaIProThrAsnValGlySerLySAlaPheGlyThrCysSerAsnLeuSerThrCysGlyLeuGlyLysLeuSerGlnGIuAlaHi sLysLeuGlnThrProArgThrAsnThrGlySerGlyThrPro ;且降钙素基因相关妝与鲑鱼降钙素融合多肽C端酰胺化。
[0016]本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因由上海生工公司合成，融合多肽系本实验室构建菌株进行转入番茄后经亲和层析纯化获得。
[0017]本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因中有一段被称为“亲和手柄”(affinity handle)的编码序列相连接，这段“亲和手柄”可以与亲和层析柱上的配基特异性地结合，这样所表达的融合蛋白可以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来，所得到的融合多肽蛋白经化学方法或酶法切割开来之后，混合产物再上同一亲和柱，充作“亲和手柄”的一段多肽或蛋白以及尚未被切开的融合蛋白被吸附于柱上，而重组目的产物则处于流动相中。因此可得到较高纯度的降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽。
[0018]本实施方式在降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽的C端加上一个Gly为肽酰甘氨酸酰化单氧酶酰胺化提供氨基供体。
[0019]本实施方式在CGRP和msCT`氨基酸序列之间设计一个Kpn I酶切位点(如氨基酸序列下划线所示)，可用于验证阳性克隆及其它基因操作。对本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽进行动物实验:
实验1:
将骨质疏松模型大鼠随机分成两组(治疗组和模型组)，以正常大鼠为空白对照组；治疗组按体重0.g/kg剂量注射本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽，模型组注射同等剂量的生理盐水。实验进行84天，对大鼠血清酸性磷酸酶(TRAP)、碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(BGP)进行检测，并对大鼠进行了骨密度测定。检测结果如表1和表2所示。
[0020]表1大鼠血清TRAP、ALP、BGP测定结果(X土 S)
I 别鼠数TRAP(U/L)ALP(U/L)BGP(ug/L)
圣白对照组 _ 10 一 18.67±3.31 ' 152.84±21.081.20±0.25
_ 模型组 —10 一 29.96±3.05 ' 156.22±23.341.32±0.23
_ 治疗组1019.25±4.23** 233.70±42.05* 1.97±0.18**
表2大鼠股骨、胫骨、腰椎密度值(X土S)
组别鼠数股骨(g/cm3)腔骨(g/cm3)腰椎(g/cm3)
空白对照组 10__0.61±0.04__0.58±0.03__0.62±0.04_
模型组 -10_ 0.41±0.12' 0.42±0.080.44±0.06
治疗组100.59±0.07*0.59±0.05*0.58±0.04*根据表1和表2的实验数据说明本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽对骨质疏松具有优异的治疗效果，证明本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽具有鲑鱼降钙素活性。
[0021]实验2:
SD大鼠20只造成心肌缺血模型，然后随机分成两组(治疗组和模型组)，治疗组按体重2.5mg/kg剂量注射本实施方式降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽，模型组注射同等剂量的生理盐水。实验进行4次，对大鼠心肌进行危险区域(AAR)、坏死区(IS)及坏死区与危险区域的比值检测，检测结果如表3所示。
[0022]表3
【权利要求】
1.降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合基因表达的多肽，其特征在于降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；且降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽C端酰胺化。
2.权利要求1所述的降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽，其中将msCT第8位的缬氨酸变为甘氨酸、第16位的亮氨酸用丙氨酸置换、再删除22位的酪氨酸，msCT的生物活性由 4500IU/mg 提高到 8600IU/mg。
3.权利要求1所述的降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽，其中融合多肽生物学活性为4500IU/mg，C端非酰胺化的降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽生物学活性为 100 ~200IU/mg。
4.一种药物组合物，其特征在于含有权利要求1所述的降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽及一种或多种药用辅料。
5.权利要求4所述的组合物，其中所述的组合物为固体制剂或液体制剂。
6.权利要求5所述的组合物，其中所述的固体制剂为胶囊、软胶囊、片剂、含片、颗粒剂或滴丸；液体制剂为口服液或注射液。
7.权利要求1所述的降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽在制备治疗骨质疏松药物方面的应用。
8.权利要求1所述的降钙素基因相关肽与鲑鱼降钙素融合多肽在制备治疗心肌缺血造成的心肌梗塞药物方面的应用。
【文档编号】A61K38/17GK103665167SQ201210328864
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月7日 优先权日:2012年9月7日
【发明者】李虹 申请人:天津拓飞生物科技有限公司