专利名称：按植物偏爱密码子合成的鲑鱼降钙素基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学、酶学、生理学以及基因工程等领域。具体地，本发明涉及一种首次根据植物偏爱密码子设计人工合成的鲑鱼降钙素(Modified Salmon Calcitonin，msCT)的核酸序列。本发明还涉及鲑鱼降钙素在植物中的表达及其用途。
目前临床上用于治疗骨质疏松症的药物主要有雌激素、降钙素、维生素D3等以及正在研究和开发的新药有氟化物、二磷酸盐及骨细胞生长因子等。而第四届国际骨质疏松症研讨会报告认为，雌激素由于作用范围广泛，长期使用乳腺癌发生率有所增加(孟迅吾和周学瀛，1993，中华内分泌代谢杂志，9246)；维生素D3虽能增加机体对钙的吸收，但不一定会使钙有效地沉积到骨组织中，有时还会引起高血钙及高钙尿；正在研究中的氟化物、二磷酸盐虽可使骨量增加，但新生的骨组织结构异常，仅欧洲少数国家批准作临床试验，美国FDA(Food and Drug Administration)一直未批准同意临床试验(孟迅和周学瀛，1993，中华内分泌代谢杂志，9246；Reginster，Hormone Res，1995，4383)。
降钙素是以骨为靶细胞的生物活性多肽类激素，它与破骨细胞表面受体结合后可抑制破骨细胞增殖，阻止骨溶解。动物及临床药理研究表明降钙素能迅速减轻因骨质疏松症而引起的腰、脊痛，促进骨形成，抑制骨中钙和骨胶原的减少，适用于治疗男、女性骨质疏松症，疗效显著、安全可靠，并有镇痛作用。同时CT在治疗骨质疏松症、高血钙、甲状旁腺机能亢进、变形性骨炎及骨骼愈合等方面都显示了良好的疗效。
现在临床使用的CT剂型有注射、口服、鼻腔给药和栓剂等，主要是从鲑鱼鳃和猪甲状腺中分离纯化的非人型的降钙素，其来源有限、价格昂贵、且有弱的抗原性，限制了长期使用(张玉彬等，中国药学杂志，1996，31451-454)。
不同种属的天然CT都是由32个氨基酸组成的单元链多肽，其中1，7位的胱氨酸(Cys)形成二硫环，C-端都是脯氨酸(Pro)结构，其它位点的氨基酸残基组成有较大差别。Inouc等通过“氨基酸残基非活性嵌入法”对eCT(eel calcitonin)研究表明，CT的受体结合的主要部位在C-端的24-32序列区，在N-端形成与活性相关的α-螺旋二级结构，其中的8-17位是决定活性的重要部位(Inouc等，Eur J Biochem，1991，201607)。Epand等通过19-22位氨基酸残基缺失研究认为，19-22这一段序列对CT活性影响很小；园二色谱(CD)研究也认为19-22位之间氨基酸的缺失对肽的二级结构影响很小(Epand等，J Med Chem，1988，311585)。在天然CT中以鲑鱼降钙素(salmon calcitonin，sCT)、鳗鱼降钙降钙素(eCT)、鸡降钙素(chook calcitonin，cCT)活性较高，人降钙素(human calcitonin，hCT)和猪降钙素(pig calcitonin，pCT)活性低。hCT在体内易分解，同时hCT的活性(150U/mg)仅为天然sCT的(4500 U/mg)的1/30-1/50。目前以sCT应用最为广泛，对CT的结构改造一般都选择sCT(杨彬和丁振剀，中国药学杂志，1995，30643-646；Epand等，J Med Chem，1988，311585；Findlay等，Endocrinology，1985，117801)。
综上所述，CT对骨质疏松有确切的疗效，但存在来源有限和价格昂贵的不足；为了解除骨质疏松给患者带来的痛苦，提高人类健康水准，人们渴望得到既安全、稳定、又具活性和低成本的CT，用以预防或治疗威胁人类健康的骨质疏松。生物技术高速发展的今天，依托于基因工程手段的动物和植物生物反应器已为解决这一难题、规模化生产CT或直接食用表达CT的转基因食物达到预防或治疗骨质疏松症目的提供了一条可选择的途径，而且在理论和技术方面储备已趋成熟。
本发明中，我们用化学合成法，首次根据植物偏爱密码子设计了可以在植物中表达的具有生物活性的鲑鱼降钙素及其编码序列。
在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的在植物中表达的鲑鱼降钙素编码序列。
本发明的第二目的是提供一种在植物中表达的鲑鱼降钙素。
本发明的第三目的是提供一种利用重组技术生产上述新的鲑鱼降钙素的蛋白及核酸序列的方法。
本发明还提供了这种新的鲑鱼降钙素和编码序列的在植物中应用。
在本发明的一个方面，提供了一种人工设计并合成的含有新的鲑鱼降钙素(msCT1或msCT2)基因的克隆载体pUC57-msCT1或pUC57-msCT2，该载体包括根据植物偏爱密码子设计的鲑鱼降钙素的核酸序列，所述的核酸序列与SEQ ID NO.4中从核苷酸第25-117位DNA分子的核苷酸序列或与SEQ ID NO.5中从核苷酸第25-120位的核苷酸序列有至少60％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.4中从核苷酸第25-117位的核苷酸序列或与SEQ ID NO.5中从核苷酸第25-120位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.4中从核苷酸第25-117位的核苷酸序列或SEQ ID NO.5中从核苷酸第25-120位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种在植物中表达的鲑鱼降钙素，它包括具有SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7序列的多肽。
在本发明的另一方面，还提供了几种表达载体，它包含上述的DNA分子。
在本发明的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是烟草和番茄。
在本发明的另一方面，还提供了一种在植物中产生和表达具有活性的鲑鱼降钙素的方法，其步骤如下(1)将人工合成的编码具有鲑鱼降钙素活性多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成鲑鱼降钙素蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.4中从核苷酸第25-117位的核苷酸序列或与SEQ ID NO.5中从核苷酸第25-120位的核苷酸序列有至少60％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成鲑鱼降钙素的重组细胞；(3)在适合表达鲑鱼降钙素的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)再生重组细胞，获得表达鲑鱼降钙素的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。
较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.4中第25-117位的序列或SEQ IDNO.5中第25-120位的序列。
在本发明中，术语“鲑鱼降钙素编码序列”指编码具有鲑鱼降钙素活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.4中第25-117位或SEQ ID NO.5中第25-120位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.4序列的编码框第25-117位核苷酸或位于SEQID NO.5序列的编码框第25-120位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.4中第25-117位核苷酸序列同源性低至约60％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.6所述的序列，与SEQ IDNO.5中第25-120位核苷酸序列同源性低至约60％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.7所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.4中从第25-117位或与SEQ ID NO.5中从第25-120位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.4中从核苷酸第25-117位或SEQ ID NO.5中从核苷酸第25-120位的核苷酸序列的同源性至少60％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与天然的鲑鱼降钙素相同功能的蛋白的SEQ ID NO.4或SEQID NO.5中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，术语“鲑鱼降钙素”指具有鲑鱼降钙素活性的SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7序列的多肽。该术语还包括具有与鲑鱼降钙素在植物中表达相同功能的SEQ ID NO.6或SEQID NO.7序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-20个，较佳地1-15个，更佳地1-10个，最佳地1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为15个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的在植物中偏爱的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个植物偏爱密码子所表达的氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括在植物中的表达的鲑鱼降钙素的活性片段和活性衍生物。
本发明的鲑鱼降钙素的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与鲑鱼降钙素DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗鲑鱼降钙素的抗血清获得的多肽或蛋白。
在本发明中，“鲑鱼降钙素保守性变异多肽”是指与SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。
表1
发明还包括人工合成的在植物中表达的鲑鱼降钙素或多肽的类似物。这些类似物与鲑鱼降钙素的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化、酰胺化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的在植物中表达的鲑鱼降钙素时，可以将鲑鱼降钙素编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成鲑鱼降钙素表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞、番茄细胞及其它植物细胞。
还可用Northern印迹法技术分析鲑鱼降钙素基因产物的表达，即分析鲑鱼降钙素的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
降钙素RNA的Northern印迹分析和特异抗体的鲑鱼降钙素Western印迹分析可以联合使用，以证实在生物样本中鲑鱼降钙素的表达。
此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有鲑鱼降钙素核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码的核酸分子。
本发明还提供了检测样品中是否存在鲑鱼降钙素核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于鲑鱼降钙素核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。
本发明的鲑鱼降钙素核苷酸编码序列通常可以用人工合成的方法获得。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
除了用重组法生产sCT融合蛋白或非融合蛋白之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。
表2为本发明的按植物偏爱密码子设计人工合成的鲑鱼降钙素msCT1与天然鲑鱼降钙素核苷酸序列(GenBank Accession No.Y00765.1)的同源比较(GAP)表。相同的核苷酸在两个序列之间用点标出。
表3为本发明的按植物偏爱密码子设计人工合成的鲑鱼降钙素msCT1与天然鲑鱼降钙素的氨基酸序列(GenPept Accession No.CAA68734.1)的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用用氨基酸单字符标出。
表4为本发明的按植物偏爱密码子设计人工合成的鲑鱼降钙素msCT2与天然鲑鱼降钙素核苷酸序列(GenBank Accession No.Y00765.1)的同源比较(GAP)表。相同的核苷酸在两个序列之间用点标出。
表5为本发明的按植物偏爱密码子设计人工合成的鲑鱼降钙素msCT2与天然鲑鱼降钙素的氨基酸序列(GenPept Accession No.CAA68734.1)的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用用氨基酸单字符标出。
实施例1鲑鱼降钙素基因的合成1.基因合成(gene synthesis)由于sCT的活性对其构象有很大程度的依存性，因此氨基酸残基置换或删除其活性也会有很大的改变(杨彬和丁振剀，中国药学杂志，1995，30643-646)。我们根据sCT的活性与构象间的这种关系，对其氨基酸残基进行了适当的置换和删除。如将天然sCT第8位的缬氨酸(V)变为甘氨酸(G)；第16位的亮氨酸(L)用丙氨酸(A)置换，再删除22位的酪氨酸(Y)。实验证明，经过改进后的sCT的活性由改进前的4500U/mg(天然sCT)提高到改进后的8600U/mg。经过调整后的sCT一级结构为CSNLSTCGLGKLSQEAHKLQTPRTNTGSGTP。
我们依据sCT一级结构的氨基酸序列，按植物基因偏爱密码子(Murray等，Nucl AcidRes，1989，17477-498；Chiapello等，Gene，1998，2091-38)原则，同时考虑该基因便于克隆入植物表达载体，设计了包括相应限制性内切酶切位点并具有植物偏爱密码子的msCT1基因核苷酸序列(见SEQ ID NO.4)。
此外，为了更有利于鲑鱼降钙素的酰胺化，在msCT1的基础上在其羧基末端加上有利于酰胺化的甘氨酸，由此设计了包括相应限制性内切酶切位点并具有植物偏爱密码子的msCT2基因核苷酸序列(见SEQ ID NO.5)。
我们将所设计的msCT1和msCT2核苷酸序列提供给上海生物工程有限公司，并委托其合成。合成工作完成后公司提供的序列报告单对合成的序列特征作了如下描述msCT1核苷酸序列为137bp，msCT2核苷酸序列为140bp，msCT1和msCT2两端都有5个酶切位点(XhoI、XbaI、BamHI、SacI、EcoRI)，并通过用SmaI平端切割、连接，分别克隆入pUC57(2710bp)，并命名为pUC57-msCT1和pUC57-msCT2。这与我们设计的序列是吻合的。为了证实合成序列的可靠性，用M13+为引物对pUC57-msCT1和pUC-msCT2测序。测序结果证实按植物偏爱密码子设计和合成的msCT1和msCT2基因已成功完成。
2.酶切(restriction enzyme digestion)将含合成基因的质粒载体用BamHI及SacI双酶切，切下合成的鲑鱼降钙素基因.
3.连接(ligation)将切下的基因连入已经用BamHI及SacI切好的质粒pBI121和pCAMBIA2300植物表达载体大片段中，用蓝白筛选检测转化的大肠杆菌阳性克隆。
4.基因的PCR检测以以下序列为引物，用合成的基因为模板对所含msCT1基因进行PCR检测SCTF1GATCCATGTGCTCTAACCTTTCTACT (SEQ ID NO.1)SCTR2AGCTCTTATTATGGAGTTCCAGATCC (SEQ ID NO.2)PCR条件为94℃ 5分钟，随之以94℃ 30秒、54℃ 30秒和72℃ 1分钟进行35个循环，最后以72℃延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为预计的112bp。此外，还通过酶切和测序均证明msCT1基因已成功构建到植物表达载体pBI121和pCAMBIA2300，获得的含msCT1基因的植物表达载体分别被称为pBI-msCT1和p2300-msCT1。
以以下序列为引物，用合成的基因为模板对所含msCT2基因进行PCR检测SCTF1GATCCATGTGCTCTAACCTTTCTACT (SEQ ID NO.1)SCTR3AGCTCTTATTATCCTGGAGTTCCAGA (SEQ ID NO.3)PCR反应条件为94℃ 5分钟，随之以94℃ 30秒、54℃ 30秒和72℃ 1分钟进行35个循环，最后以72℃延伸10分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为预计的115 bp。此外，还通过酶切和测序均证明msCT2基因已成功构建到植物表达载体pBI121和pCAMBIA2300，获得的含msCT2基因的植物表达载体分别被称为pBI-msCT2和p2300-msCT2。
实施例2鲑鱼降钙素基因的序列信息与同源性分析本发明的鲑鱼降钙素msCT1基因的全长为137 bp(含接头)，详细序列见SEQ ID NO.4，其中开放读框位于22-117位核苷酸。根据推导出的全长鲑鱼降钙素的氨基酸序列，共32个氨基酸残基，分子量为3318.74，pI为8.89，详细序列见SEQ ID NO.6。
本发明的鲑鱼降钙素msCT2基因的全长为140 bp(含接头)，详细序列见SEQ ID NO.5，其中开放读框位于22-120位核苷酸。根据推导出的全长鲑鱼降钙素的氨基酸序列，共33个氨基酸残基，分子量为3375.79，pI为8.89，详细序列见SEQ ID NO.7。
将按植物偏爱密码子设计合成的鲑鱼降钙素msCT1和msCT2全长序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它们与天然鲑鱼降钙素基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上，msCT1和msCT2与天然鲑鱼降钙素基因的编码序列(GenBank Accession No.Y00765.1)分别有63.2％和63.3％的相同性(见表2和表4)，在氨基酸水平上，msCT1和msCT2与天然鲑鱼降钙素(GenPept Accession No.CAA68734.1)都有90％的相同性(见表3和表5)。由上可见，在植物中表达的按植物偏爱密码子设计合成的鲑鱼降钙素与天然鲑鱼降钙素无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性，可以认为两者在功能上也有很高相似性。
实施例3鲑鱼降钙素在烟草和番茄细胞中进行真核细胞表达含目的基因(鲑鱼降钙素msCT1和msCT2基因)表达载体的农杆菌株的构建在成功地构建了含鲑鱼降钙素基因的植物表达载体pBI-msCT1、p2300-msCT1、pBI-msCT2和p2300-msCT2后，通过冻融法，将pBI-msCT1、p2300-msCT1、pBI-msCT2和p2300-msCT2分别导入农杆菌(如EHA105或LBA4404)中，利用农杆菌介导的叶盘法技术转化模式植物烟草和番茄。利用叶盘法转化烟草1.用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落，接种于2ml YEB液体(Sm+，Kan+)，28度，200rpm振荡培养24-36小时；2.室温下4,000g离心10min；3.弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5左右；4.取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；5.将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；6.把经侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；7.将叶片转到含卡那霉素(Kan)的筛选培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan50mg/L+cb 250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见抗性愈伤组织的形成；8.约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan25mg/L)上进行生根培养，2-7天左右生根；9.等根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。转化番茄1.将番茄种子灭菌后播于1/2MS培养基上，约10天左右长出子叶；2.农杆菌培养过夜，OD为0.8-1.5，室温下4,000g离心10min；3.弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，加入子叶浸泡10分钟；4.在无菌滤纸上吸干菌液；将子叶放在MS1培养基上，共培养两天；5.将叶片转到含Kan的愈伤和分化培养基(MS+ZT 1.0mg/L+I AA 1.0mg/L+Kan 50mg/L+cb250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见抗性愈伤组织的形成和植株再生；6.待芽长大后约1-2厘米的时将幼芽移植在生根培养基中(1/2 MS)上进行生根培养，2-7天左右生根；7.根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，在珍珠岩中驯化一周，用1％的MS浇灌，移入土中。利用western blot检测鲑鱼降钙素在转基因烟草和番茄植株中的表达1.蛋白的提取a)取50mg叶片，加入100ul 1*PBS(KH2PO40.2g/l，Na2HPO41.15g/l，KCl0.2g/l，NaCl 8g/l)于1.5ml离心管中研磨；b)13000，4℃离心10分钟；c)取上清，备用。注以上过程于冰上进行。2.蛋白的定量参考Bradford法(Bradford，1976)。取2ul蛋白样品，加入1ml Bradford试剂，混匀后，分光光度计测OD595。3.SDS-PAGE分离蛋白SDS-PAGE的制备参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)；a)加样前，将样品置于含50mmol/L DTT的加样缓冲液(2*加样缓冲液甘油2.4g，1M Tris-HClpH6.8 1ml；溴酚兰0.01％，H2O定容至20ml)，煮沸10分钟；b)室温100V电压下聚丙烯酰胺凝胶电泳，直到指示剂(溴酚兰)前沿达到凝胶底部。4.蛋白质向硝酸纤维膜上转移a)转移之前，用转移缓冲液(39mmol甘氨酸，48mmolTris Base，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝胶和硝酸纤维膜30分钟；b)室温下用半干式电转仪转移1h，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸；5.膜上蛋白的检测a)将硝酸纤维膜浸在封闭液中，37℃缓慢摇动、封闭60分钟(封闭液取5g脱脂奶粉溶于100ml 1*PBS(含0.5g叠氮钠))；b)再将滤膜浸泡在洗涤缓冲液中，37℃洗涤两次，每次15分钟；c)加入第一抗体(抗鲑鱼降钙素的抗体)，37℃温育30分钟；同步骤b)，洗涤三次；d)加入第二抗体(亲和素-碱性磷酸酶复合物)，37℃温育30分钟；同步骤b)，洗涤两次；e)加入底物显色观察蛋白条带。
表263.2％ identity in 95 nt over lap304050607080Query TGCTCTAAGCTTTCTACTTGCGGACTTGGAAAGCTTTCTCAAGAGGCTCATAAGCTTCAA::::: ::::::: :: : :: :: :: :: :: :::::: :: :: : ::Sbjct TGCTCCAACCTCAGCACCTGTGTGCTGGGCAAACTGTCCCAAGAGCTGCACAAATTGCAG250 260 270 280 290 30090 100 110Query ACT---CCAAGAACTAACACTGGATCTGGAACTCC:::: : :: ::::: ::: ::: :: ::Sbjct ACGTACCCCCGCACCAACACGGGAAGTGGCACGCC310 320 330 340Query本发明的按植物偏爱密码子设计人工合成的鲑鱼降钙素msCT1核苷酸序列Sbjct天然鲑鱼降钙素核苷酸序列(GenBank Accession No.Y00765.1)表3ldentities＝29/32(90％)，Positives＝29/32(90％)，Gaps＝1/32(3％)Query2 CSNLSTCGLGKLSQEAHKLQT-PRTNTGSGTP 32CSNLSTC LGKLSQE HKLQT PRTNTGSGTPSbjct248 CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP 343Query本发明的按植物偏爱密码子设计人工合成的鲑鱼降钙素msCT1氨基酸序列Sbjct天然鲑鱼降钙素氨基酸序列(GenBank Accession No.CAA68734.1)表463.3％ identity in 98 nt overlap；score3040 50 607080Query TGCTCTAACCTTTCTACTTGCGGACTTGGAAAGCTTTCTCAAGAGGCTCATAAGCTTCAA::::: ::::::: :: : :: :: :: :: :: :::::: :: :: : ::Sbjct TGCTCCAACCTCAGCACCTGTGTGCTGGGCAAACTGTCCCAAGAGCTGCACAAATTGCAG250 260 270 280 290 30090 100 110Query ACT---CCAAGAACTAACACTGGATCTGGAACTCCAGG:::: : :: ::::: ::: ::: :: :: ::Sbjct ACGTACCCCCGCACCAACACGGGAAGTGGCACGCCTGG310 320 330 340Query本发明的按植物偏爱密码子设计人工合成的鲑鱼降钙素msCT2核苷酸序列Sbjct天然鲑鱼降钙素核苷酸序列(GenBank Accession No.Y00765.1)表5ldentities＝30/33(90％)，Positives＝30/33(90％)，Gaps＝1/33(3％)Query2 CSNLSTCGLGKLSQEAHKLQT-PRTNTGSGTPG 33CSNLSTC LGKLSQE HKLQT PRTNTGSGTPGSbjct83CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTPG 115Query本发明的按植物偏爱密码子设计人工合成的鲑鱼降钙素msCT2氨基酸序列Sbjct天然鲑鱼降钙素氨基酸序列(GenBank Accession No.CAA68734.1)本发明涉及的序列及记号分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度26bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1GATCCATGTGCTCTAACCTTTCTACT(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度26bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2AGCTCTTATTATGGAGTTCCAGATCC(3)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)长度26bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.3AGCTCTTATTATCCTGGAGTTCCAGA(4)SEQ ID NO.4的信息
(i)序列特征(A)长度137bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.41 ccgctcgagt ctagaggatc catgtgctct aacctttcta cttgcggact tggaaagctt61 tctcaagagg ctcataagct tcaaactcca agaactaaca ctggatctgg aactccataa121 taagagctcg aattccg(5)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)长度140bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.51 ccgctcgagt ctagaggatc catgtgctct aacctttcta cttgcggact tggaaagctt61 tctcaagagg ctcataagct tcaaactcca agaactaaca ctggatctgg aactccagga121 taataagagc tcgaattccg(6)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)长度32个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型多肽(iii).序列描述SEQ ID NO.6
1MCSNLSTCGLGKLSQEAHKLQTPRTNTGSGTP 32(7)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)长度33个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型多肽(iii).序列描述SEQ ID NO.71 MCSNLSTCGLGKLSQEAHKLQTPRTNTGSGTPG 3权利要求
1.一种人工合成的DNA分子，其特征在于，它包括根据植物偏爱密码子设计的编码具有鲑鱼降钙素活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ IDNO.4中从核苷酸第25-117位的核苷酸序列或与SEQ ID NO.5中从核苷酸第25-120位的核苷酸序列有至少60％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.4中从核苷酸第25-117位的核苷酸序列或与SEQ ID NO.5中从核苷酸第25-120位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码具有SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.4中从核苷酸第25-117位的核苷酸序列。
4.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.5中从核苷酸第25-120位的核苷酸序列。
5.一种在植物中表达的鲑鱼降钙素多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.6氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
6.一种在植物中表达的鲑鱼降钙素多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
7.如权利要求5所述的多肽，其特征在于，该多肽是在植物中表达的具有SEQ IDNO.6序列的多肽。
8.如权利要求6所述的多肽，其特征在于，该多肽是在植物中表达的具有SEQ IDNO.7序列的多肽。
9.一种载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA。
10.一种用权利要求9所述载体转化的宿主细胞，其特征在于它是真核细胞。
11.一种在植物中产生和表达具有鲑鱼降钙素活性的多肽的方法，特征在于其步骤如下(1)将人工合成的编码具有鲑鱼降钙素活性多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成鲑鱼降钙素蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.4中从核苷酸第25-117位的核苷酸序列或与SEQ ID NO.5中从核苷酸第25-120位的核苷酸序列有至少60％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入宿主细胞，形成鲑鱼降钙素蛋白的重组细胞；(3)在适合表达鲑鱼降钙素的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)再生重组细胞，获得表达鲑鱼降钙素的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。
12.一种核酸分子，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。
13.一种用于检测样品中是否存在鲑鱼降钙素核苷酸序列的方法，其特征在于它包括用权利要求12所述探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于鲑鱼降钙素核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间，引物长度为15～50个核苷酸。
全文摘要
本发明提供了一种按植物偏爱密码子设计合成的鲑鱼降钙素的基因。涉及包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体。该表达载体具有在普通植物中高效表达的特性。还涉及被所说的表达载体转化的植物细胞，以及由所说的转化细胞产生的表达鲑鱼降钙素的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。本发明还提供了在样品中检测鲑鱼降钙素核酸序列和多肽的方法。
文档编号C12P21/02GK1390847SQ0213611
公开日2003年1月15日 申请日期2002年7月19日 优先权日2002年7月19日
发明者唐克轩, 赵凌侠, 孙小芬 申请人:复旦大学