专利名称：一种基因重组鲑鱼降钙素的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明属医药技术领域，具体涉及一种新的基因重组鲑鱼降钙素(简记为sCT)制备工艺。
目前，市场上的商品均为化学合成，但由于对硬件设备、合成试剂、生产环境要求苛刻，使得产品成本昂贵、规模化生产的固定投入巨大，且易污染环境。美国UNIGENE公司(Bio/Technology，1993，1164-70)等通过基因工程生产sCT是先由大肠杆菌表达得到羧基端(C末端)为甘氨酸(简记为Gly)的sCT前体，再经α-酰胺化酶(α-AE)的作用，加工为成熟重组sCT。由于所得的C末端为Gly的由33个氨基酸组成的sCT前体，必须用α-AE才能修饰C末端产生成熟sCT。问题是α-AE目前尚未商品化，通过生物提取或基因工程得到α-AE T艺复杂，不仅造成sCT生产周期延长，又提高了成本。也有研究通过使用具有乙酰化功能的真核细胞(如鼠垂体细胞AtT-20)来实现C末端酰胺化的(Protein Expression and Purification，1996，7347-354)，但是由于产率极低，故至今该酰胺化线路只能停留于实验室阶段。窦鸿等利用大肠杆菌BL(21)为宿主，首先表达、纯化得到33位为丙氨酸(简记为Ala)的sCT前体再利用羧基肽酶进行C端酰胺化，加工出成熟sCT(Productionof Recombinant Salmon Calcitonin by Amidation of Precursor Peptide Using EnzymaticTransacylation and Photolysis in Vitro.Dou Hong，Zhuang Mingqiang，Li Min，ChenChangqing，Mao Jifang.Biochem Biophys Res Commun.2000；267(1)362-367)，但其一，BL(21)宿主表达目的融合蛋白降解程度大于40％；其二，前体C术端为Ala，造成酰胺化产率下降；其三，羧基肽酶中带入的蛋白酶A可降解sCT前体和酰胺化产物。以上种种原因造成生产投入较大、产率较低，成本高。
本发明提出的制备基因重组鲑鱼降钙素工艺，具体步骤如下(1)构建含sCT前体cDNA融合表达载体pGEX-sCT前体的工程菌；(2)sCT工程菌的发酵；(3)分离、纯化sCT前体；(4)sCT前体的酰胺化及复性成为成熟sCT；(5)sCT活性的测定；其中，在构建sCT前体基因时，首先按其氨基酸序列，用大肠杆菌的偏爱密码编码成若干DNA片段，并化学合成DNA片段，再拼接成sCT前体的全长cDNA(见图3所示)，所拼接成的全长cDNA N端含蛋氨酸(Met)密码子，以便通过CNBr裂解产生与天然sCT完全相同的N端氨基酸序列，C末端为亮氨酸(Leu)密码子，以便使由大肠杆菌表达出的产物，可用羧基肽酶Y(CPD-Y)进行C末端酰胺化。
本发明中，sCT cDNA构建时退火、连接后的DNA片段直接与表达载体进行连接，转化大肠杆菌后，抽提质粒，双酶切，用琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，再测序证实，省去利用克隆载体构建sCT cDNA中间过程。
本发明中，构建的融合表达载体转化由Ecoli.B衍生的大肠杆菌宿主(蛋白酶缺陷型宿主)，以避免表达的目的蛋白降解，提高产量。
本发明中，sCT的前体采用羧基肽酶-Y(CPD-Y)进行酰胺化时，同时加入邻硝基苯甘氨酰胺(O-PNGA)，使得sCT前体的第33位Leu被O-PNGA取代，成为光敏感的sCT-O-PNGA，该产物经光解得线形sCT，并可通过空气氧化折叠，重建二硫键，得到具有生物活性sCT。
此举可提高酰胺化效率，降低酰胺化成本。
本发明中，在利用CPD-Y进行C末端酰胺化时，反应体系中加入DMSO(二甲亚砜)、Papstatin A，以增加酰胺化效率、抑制CPD-Y带入的非特异水解酶活性，达到提高产率降低成本的目的。
本发明利用基因工程生产重组sCT，其步骤如
图1所示。下面进一步描述各步骤
1.合成sCT前体DNA片段及构建含sCT前体cDNA的融合表达载体的工程菌为提高sCT在大肠杆菌中的表达量，按照sCT前体的氨基酸序列，用大肠杆菌的偏爱密码，编码成若干DNA片段，使位于全长cDNA3’端为Leu的密码子，以便使由大肠杆菌表达出的产物，可用CPD-Y进行C末端酰胺化。DNA片段采用亚磷酸二酯法合成。将合成的DNA片段按常规用《BASICMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY》方法拼接起来。首先将片段磷酸化，再加热至96℃后，退火到室温，拼接成全长sCT前体cDNA，然后通过连接酶的作用与经BamH1、Xho1双酶切的pGEX-4T-3表达载体相连接，成为pGEX-sCT前体表达载体，转化大肠杆菌，获得工程菌。将其质粒DNA经双酶切和DNA测序鉴定插入序列后，进行融合蛋白诱导表达的鉴定。
2.sCT工程菌的高密度发酵将工程菌接种于LB培养基，37℃培养过夜，作为一级种子，次日将一级种子接种于含2％甘油的2-YT培养基中，37℃振摇培养，用作二级种子(详见Lee SY，TIBTECH，1996，1498-105)，然后将二级种子接种于发酵培养基的发酵罐中进行补料分批培养。整个发酵过程pH控制在6.9左右，溶解氧在30％左右，搅拌速度逐渐增大，最高转速每分钟1200转(详见M.Yabuta，Y.Suzuki，K.Ohsuye. Appl Microbiol Biotechnol.1995，42703-708)。
3.分离纯化sCT前体按常规采用亲和层析从高密度发酵获得的菌体中纯化得到谷胱甘肽巯基转移酶(GST)-sCT前体的融合蛋白，经酶或化学裂解，再经离子交换层析、梯度反相凝胶脱盐，获得高纯度的sCT的前体。
本步骤中，对融合蛋白可进行S-磺酸化，以提高溴化氰的裂解效率。使产生的S-磺酸化sCT(SO3-sCT)具有高稳定性、高比活性。
4.sCT前体经体外酰胺化，复性成为成熟sCT将含1mM EDTA、200mM O-PNGA的溶液用5N NaOH调pH值到6.0，加入sCT前体、CPD-Y，DMSO、Papstatin A于30℃保温，反应完成后用RP-C18脱盐和纯化，冷冻干燥，得到光敏感的中间体sCT-O-PNGA。将产物溶解于60mMNaHSO3甲醇-水溶液中，充入氩气5分钟，开始光解可得到线形sCT，反应完成后用RP-C18脱盐，再用高效液相(HPLC)纯化。纯化得到的线形肽，经空气氧化折叠，重建二硫键[以二甲基亚砜，半胱氨酸，K3(FeCN6)或谷胱甘肽为介质的系统]，得到具有生物活性的sCT。
5.测定活性按《中国药典》方法，将体重为40-50g同一来源、同一品系、同一性别的健康大白鼠，随机分成5组(对照组、生产样品高浓度组、生产样品低浓度组、标准品高浓度组、标准品低浓度组)，每组10只，编号后，分别按顺序，尾静脉注射0.4ml相应浓度的sCT标准品、生产样品及空白稀释液。给药后准确1小时，分别取血样，用邻甲酚酞络合剂比色法测定血钙。实验结果按《中国药典》附录检定统计法中量反应平行线计算，随机设计法计算效价以及实验误差。并进行统计学可靠性检验。
本发明同以往的基因工程制备sCT工艺相比优点在于工艺简单、成本低廉、生产周期短。
基因重组sCT的制备一.材料与方法1.限制性内切酶BamH1、Xho1购自Biolab，T4连接酶、T4激酶购自Promaga；凝血酶、羧基肽酶购自Sigma。
2.菌种与质粒pGEX-4T-3购自Pharmacia Biotechs。E.coli WA873购自E.coli Genetic Stock Center，U.S.A。
3.琼脂糖、生物琼脂购自Sigma，酵母粉、蛋白胨购自Oxid；质粒抽提试剂盒购自上海华舜生物工程公司；Glutathione Sepharose 4B、SP-Sepharose Fast Flowresin、G-25购自Pharmacia Biotech，RP-C18购自Merk。
4.质粒DNA的制备及片段的回收按华舜生物工程公司试剂盒操作手册。其它常规操作按Molecular Cloning ；发酵产物的鉴定用SDS-PAGE法，染色胶用BioRad DENSITOMETER扫描；融合蛋白的纯化按GlutathioneSepharose 4B操作手册进行。
5.高密度发酵参照[M.Yabuta，Y.Suzuki，K.Ohsuye.Appl MicrobiolBiotechnol.1995，42703-708]。
6.sCT的复性参照David Andreu，Fernando Alvericio，Nuria A.SoleMark C.Munson，Mare Ferrer；and George Barany.(1994)in Methods inMolecular Biology.Vol.35Peptide synthesis protocols(PenningtonM.W.and Dunn B.M.，Eds.)，pp91-169，Humana Press Inc.，Totowa，NJ。
7.活性鉴定按《中国药典》sCT的生物测定法测定注射sCT后大鼠血清钙下降程度。
二.具体操作1.合成sCT前体DNA片段及构建含sCT前体cDNA的融合表达载体的工程菌将sCT前体cDNA分为F′1-F′8，8个DNA片段采用亚磷酸二酯法由上海Sangon合成，序列详见图3。在连接反应管中加入上述8个DNA片段各20pmol，10倍浓度的连接酶缓冲液3μl，T4激酶10单位，再加水19μl，使Tris-HCl、MgCl2、二硫苏糖醇的终浓度分别为50mM、10mM、10mM，置37℃ 30分钟，再96℃ 2分钟灭活T4激酶，经30分钟退火至20℃左右。取10μl退火片段溶液，加入6μl BamH1、Xho1双酶切的pGEX-4T-3载体溶液、连接酶5单位，再加连接酶缓冲液2μl，使Tris-HCl、MgCl2、二硫苏糖醇的终浓度分别为50mM、10mM、10mM，在14℃连接过夜。吸取该连接载体溶液10μl，加200μl WA837大肠杆菌溶液(约含106-107个感受态细胞)，冰浴30分钟后，42℃ 90秒钟，加入800μl LB培养基，37℃振摇培养45分钟后涂板。其插入序列通过双酶切后由1％琼脂糖凝胶鉴定大小，再由DNA测序证实。拼接成的全长cDNA为120bp，如图3所示，其中包括5’BamH1位点(I)，3’Xho1位点(II)，两个终止密码(III)，在GST与sCT编码序列之间加入ATG构成CNBr裂解位点(IV)。为便于体外酰胺化修饰，在sCTC术端加Leu密码子CTG(V)。
2.高密度发酵3μl OD600＝0.7的工程菌接种于3ml LB培养基37℃培养过夜作为一级种子，次日将3ml一级种子接种于200ml含2％甘油的2-YT培养基中振摇培养至OD600＝0.7用作二级种子，然后按常规将二级种子接种于含3L发酵培养基的发酵罐中进行补料分批培养。整个发酵过程pH控制在6.9左右并不断搅拌，为维持溶解氧在30％左右，需要不断增加搅拌速度，转数从起始每分钟50转，逐渐加大，在7小时左右达到最高速，每分钟1200转，然后供应纯氧，以维持大肠杆菌的需氧量。分批培养5小时后菌体密度达到50D600随后进入10小时的补料培养阶段，菌体生长近10倍。37℃培养12小时，加入0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达，随着目的蛋白表达量增加到一定程度，菌体的比生长速率明显减小，生长趋势开始减缓故终止发酵。发酵菌体终浓度53 OD600、重量150克/升，经SDS-PAGE鉴定，最终融合蛋白表达量占可溶菌体蛋白30％。诱导后融合蛋白表达量的变化，通过SDS-凝胶电泳图谱(图4)可以明显地看出，加入IPTG后目的蛋白的表达量随诱导时间的增加而增加。图中泳道1为标准蛋白，泳道2为IPTG诱导前菌体蛋白电泳，3为IPTG诱导1小时菌体蛋白电泳，4为IPTG诱导1.5小时菌体蛋白电泳，4为IPTG诱导2小时菌体蛋白电泳，6为IPTG诱导2.5小时菌体蛋白电泳。分子量30kDa的条带为目的蛋白，即GST-sCT前体融合蛋白3.纯化sCT前体3.1.GST-sCT前体融合蛋白的纯化将100g大肠杆菌菌体置于1000ml pH7.2的磷酸缓冲液中，冰浴中超声破碎，加入20％Triton-X100终浓度1％，静置30分钟，15,000g离心25分钟，取上清液与40ml Glutathione Sepharose 4B混合，温和振摇30分钟，500g离心5分钟，将沉淀装柱，磷酸缓冲液洗脱至OD280＜0.02，再用3倍于柱体积缓的冲液(10mM glutathione，50mMTris-HCl，pH8.0)洗脱，洗脱样品用SDS-凝胶电泳分析结果见图5，可溶性的菌体总蛋白经过亲和树脂纯化，获得的目的融合蛋白GST-sCT前体纯度大于80％。
3.2.S-磺酸化及溴化氰裂解用55％饱和(NH4)2SO4沉淀GST-sCT前体融合蛋白，15,000g离心15分钟，加水调整蛋白浓度至10mg/ml。加入1/10体积1M Tris-HCl调至pH8.0，按52mg Na2SO3/ml融合蛋白和25mg Na2S4O4/ml融合蛋白的比例分别加入Na2SO3和Na2S4O4，避光反应12小时。经G-25柱(6×60cm)脱盐(预先用10mMTris-HCl，pH8.0平衡)。收集洗脱液的流穿峰，加尿素至终浓度8M，加浓HCl至终浓度50mM，加入溴化氰避光反应4小时，得重组sCT前体等裂解产物(图5)。
3.3.裂解产物纯化将上述裂解反应液加4倍体积水，经SP-Sepharose Fast Flow层析柱，用1号液(2M尿素，10mMHCl)洗脱至OD280＜0.02，换2号液(2M尿素，10mMHCl，100mM NaCl)，用分光光度计，以220nm检测，收集该吸收峰的洗脱液。收集液经RP-C18柱，先用3号液(5％乙腈95％水0.1％三氟乙酸)洗脱至OD220＜0.02，再用38％-49％乙腈梯度洗脱，收集样品，冰冻干燥得到重组sCT前体。HPLC分析产物，条件是流动相丙为水0.1％三氟乙酸，流动相丁为乙腈0.1％三氟乙酸，流速为每分钟1ml，线性梯度为40分钟丁流动相由0到80％，所得重组sCT前体产物纯度大于95％。用电喷雾质谱鉴定sCT前体，见图6，图谱结果按3×(m/z)-3计算，表明sCT前体的分子量为3708，与理论计算完全一致。
4.体外酰胺化将含1mM EDTA、200mM O-PNGA的溶液用5N NaOH调pH值到6.0，加入sCT前体至终浓度1mM、羧基肽酶60μg、DMSO至终浓度4％、PAPSTATIN A50μM，置30℃水浴中120分钟后用RP-C18脱盐，冷冻干燥，得到光敏感中间体sCT-O-PNGA，图谱结果按3×(m/z)-3计算(图6)，与理论值相符。将其溶解于60mM NaHSO3甲醇-水(甲醇∶水＝1∶1)溶液中，充入氩气后进行光解，可得到线形sCT，反应完成后，RP-C18脱盐，冷冻干燥，用HPLC进行纯化，条件同上。得到的线形sCT纯度大于95％。
5.复性将sCT 1mg溶于1ml pH为8.0含0.1M Tris-HCl和5mM半胱氨酸的溶液中，置37℃ 5分钟。HPLC纯化产物，条件同上。得到的sCT纯度大于99％。用电喷雾质谱鉴定sCT见图7，图谱表明sCT分子量为3432，与理论计算值完全一致。
6.活性测定按《中国药典》方法。将体重40-50g同一来源、同一品系、同一性别的健康大白鼠，随机分成5组(对照组、人降钙素类似物样品高浓度组、人降钙素类似物样品低浓度组、标准品高浓度组、标准品低浓度组)，每组10只，编号后，分别按顺序，尾静脉注射1×10-2单位和5×10-2单位两种浓度的降钙素标准品和人降钙素类似物样品0.4ml/只，对照组注射空白稀释液0.4ml/只。给药后准确1小时，分别取血样，用邻甲酚酞络合剂比色法测定血钙。实验结果按《中国药典》附录检定统计法中量反应平行线计算，随机设计法计算效价以及实验误差。并进行统计学可靠性检验。结果见表2。
表2.测定sCT的活性sCT样品标准品剂量 0.01单位 0.05单位 0.01单位 0.05单位7.29 5.84 7.55 6.586.71 5.84 7.61 5.556.23 6.57 7.56 6.107.07 6.23 6.81 5.267.15 5.84 7.15 5.59反应值y7.39 5.63 7.39 5.608.21 6.29 7.60 5.898.00 5.89 6.70 5.807.45 5.81 6.70 5.657.30 6.00 7.40 6.00结论回归非常显著、偏离平行不显著，可靠性检验通过，实验结果成立。FL％＝33％。效价4100iu/mg。95％可信限率6232-2747。
权利要求
1.一种基因重组鲑鱼降钙素的制备工艺，包括(1)构建含sCT前体cDNA融合表达载体pGEX-sCT前体的工程菌；(2)sCT工程菌的发酵；(3)分离、纯化sCT前体；(4)sCT前体的酰胺化及复性成为成熟sCT；(5)sCT活性的测定；其特征在于构建sCT前体基因时，首先按其氨基酸序列，用大肠杆菌的偏爱密码编码成若干DNA片段，并化学合成DNA片段，再拼接成sCT前体的全长cDNA，所拼接成的全长cDNA N端含蛋氨酸密码子，以便通过CNBr裂解产生与天然sCT完全相同的N端氨基酸序列，C末端为亮氨酸密码子，以便使由大肠杆菌表达出的产物，可用羧基肽酶Y进行C末端酰胺化。
2.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于构建的融合表达载体转化由Ecoli.B衍生的大肠杆菌宿主，以避免表达的目的蛋白降解。
3.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于sCT的前体采用羧基肽酶-Y进行酰胺化时，同时加入邻硝基苯甘氨酰胺，使得sCT前体的第33位Leu被O-PNGA取代，成为光敏感的sCT-O-PNGA，该产物经光解得线形sCT，并可通过空气氧化折叠，重建二硫键，得到具有生物活性sCT。
4.根据权利要求3所述的制备工艺，其特征在于在利用CPD-Y进行C末端酰胺化时，反应体系中加入二甲亚砜、Papstatin A，以增加酰胺化效率、抑制CPD-Y带入的非特异水解酶活性。
5.根据权利要求3所述的制备工艺，其特征在对融合蛋白进行S-磺酸化，以提高溴化氰的裂解效率。
全文摘要
本发明涉及一种基因重组鲑鱼降钙素(sCT)的制备工艺，是对原工艺作了许多重要改进，例如，使大肠杆菌基因表达的sCT前体C末端为亮氨酸，以便能使用CPD－Y进行C末端酰胺化；构建的融合表达载体转化由Ecoli.B衍生的大肠杆菌宿主，以避免表达的目的蛋白降解，提高融合蛋白产量等等。本发明方法工艺简单、成本低廉、生产周期短，且不会造成环境污染。
文档编号C12N15/16GK1441058SQ0211105
公开日2003年9月10日 申请日期2002年3月15日 优先权日2002年3月15日
发明者窦鸿, 赵东, 朱彤 申请人:窦鸿, 赵东, 朱彤