专利名称：编码人成骨蛋白－1的重组核酸及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码人成骨蛋白-1的重组核酸及其表达。
背景技术：
OP-1(osteogenic protein-1)即成骨蛋白-1，是BMP即骨形态发生蛋白家族中的成员。有些文献中称之为BMP-7。人OP-1的cDNA编码NQEALR肽段。人OP-1(hOP-1)的cDNA含有一个1293bp的开放读框，编码431个氨基酸的hOP-1蛋白。在编码的第一个蛋氨酸后面分别为疏水性信号肽段、前体肽段和成熟肽段。成熟肽具7个Cys，形成三个链内二硫键，两成熟肽单体通过一个链间二硫键形成二聚体。成熟肽单体有一个位点被糖基化。信号肽段、前体肽段参与OP-1表达的胞内翻译后加工过程，这些加工过程只在真核细胞发生。在原核系统表达OP-1很难得到活性产物，国内外文献尚未见到成功报道。OP-1已经在CHO、COS-1和昆虫细胞中成功表达出有活性的成熟蛋白(Sampath TK，Maliakal JC，Hauschka PV，Jones WK，Sasak H，Tucker RF，White KH，Coughlin JE，Tucker MM，Pang RH，et al.J Biol Chem 1992 Oct 5；267(28)20352-62)。而且，上述表达所用仅限于OP-1的天然序列，至今尚为有关人工优化的报道。
OP-1具有广泛的生理功能，对骨骼、眼、肾、脑的发育起着重要调节作用[JenaN，Martinseisdedos C，Mccue P，et al.Exp cell Res，1997，23028-37.]。尤其是，OP-1在诱导骨组织和肾组织形成方面起重要作用。至今已有大量报道证实OP-1有助于骨及软骨组织缺损的修复，显示了良好的临床应用前景。骨折的治疗常使用大量的骨移植以诱发缺损处的愈合，自体或异体骨移植是最常被使用的方法，但各有其使用上的限制。目前已知当利用自体或异体骨移植治疗片段骨缺损，BMP蛋白能促进骨愈合。
但是，人们始终需要不断提高目的蛋白例如OP-1蛋白的表达量，这对于科研和进一步的产业化应用无疑具有巨大的潜在价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种编码hOP-1的重组核酸，能够实现在哺乳动物，尤其是CHO细胞中的高表达。
本发明的目的还在于提供用于实现以上目的载体。
本发明的目的还载体提供用于实现以上目的宿主细胞。
为了实现以上目的，本发明提供了一种编码hOP-1的重组核酸，其序列如SEQ ID NO1所述。
本发明的重组核酸可用多种方法获得，其中包括，以公开的天然序列(例如的Genbank登录号XM-030620)为模板进行定点诱变；或根据本发明给定的序列进行全合成。这些都已是本领域的常规技术。而且，核苷酸序列的鉴定也是本领域的常规技术，在现有文献中多有记载。因此，根据本发明给定的核苷酸序列，本领域技术人员不难结合现有技术制备得到本发明的编码hOP-1的重组核酸。
本发明还提供一种载体，其中含有本发明编码hOP-1的重组核酸。在本领域中，通过适当的克隆技术，将目的核酸片段插入合适的载体以实现保存，扩增和/或表达等目的，已是一般常规技术。合适载体的选择取决于克隆目的，载体容留，与宿主细胞的相容性，酶切位点等多种因素，本领域技术人员不难根据具体情况做出适当选择。可用以本发明的载体例如但不限于pMSG，pGEM，pET15b，pET32b(Invitrogen公司产品)等。
本发明还提供了一种细胞，包含本发明编码hOP-1的重组核酸，所述核酸处于与所述细胞相容的表达系统中。所述细胞选自哺乳动物细胞，尤其是CHO细胞。所述宿主细胞可以通过常规转染或转化而获得所述核酸。挑选与宿主细胞相容的表达载体已是本领域的常规技术，结合大量已有文献，不难做出此类选择。
从后文实施例中可以看出，本发明编码hOP-1的重组核酸显著提高了hOP-1蛋白在宿主细胞内的表达，最大提高可达6.3倍。
图1为本用于构建本发明表达载体的pMSG载体。
具体实施例方式
编码hOP-1的重组核酸及其制备本发明对hOP-1的编码核酸进行了重组设计，所得人工序列如SEQ ID NO1所述。用DNAstar软件的MegAlign功能将本发明人工序列与发表的hOP-1基因的编码区的DNA序列(自GeneBank登录号XM_030620)进行比较，发现两者有175个碱基的差异，均匀分布在这个编码区。
有多种方法可获得序列已知的聚核苷酸，这些都已是本领域的常规技术。例如，本发明的人工序列可通过长链PCR合成来制备(参见Chrisostomos Prodromouand Larurence H.Pearl，1992，ProtocolRecursive PCRa novel technique for totalgene synthesis，Protein Engineering，5827～829.)。具体的说，参照该文献所述，根据本发明的人工序列设计重叠PCR引物，从序列的5′至3′，包括正向引物F1-18(SEQ ID NO2-19)，及反向引物B1(SEQ ID NO20)。其中，为了进行后续操作，在第一正向引物F1的5′端增加保护性碱基及Nhe I位点，即ctcgctagc；同理，在反向引物B1的5′端增加保护性碱基及位点Xho I catctcgag。合成引物(上海生化公司)并用PEGA纯化，在无菌水中制备成500ng/μL的储备液。
在如下PCR体系中进行反应F1和B1终浓度100ng/μL，其余片段为20nM/μL，1X PCR反应缓冲液，1.5mM MgCl2，200nM的dNTPs，Pfu DNA聚合酶10U。反应程序为94℃，预变性5分钟；主循环为94℃变性1分钟，55℃1分钟，72℃5分钟，循环30次；72℃，后延伸5分钟。
上述PCR完毕后，在1％琼脂糖电泳上鉴定合成产物。割取1300bp左右的明显条带，用Promega公司的胶回收试剂盒进行回收。人工序列的鉴定取5微升如上制备的本发明重组DNA，与1微升pGEM-T easy载体(Promega产品)混合，加入2微升10X连接缓冲液(Promega产品)和1微升NEB的T4 DNA连接酶，充分混合后在16℃反应10小时以上。按常规方法用所得重组载体转化大肠杆菌DH5a菌株，经蓝/白斑筛选获得阳性克隆。酶切鉴定确认带有目的插入片段的克隆，在ABI377全自动测序仪上对其进行双向测序。确认序列与本发明设计的SEQ ID NO1完全相符。该克隆在本发明中命名为pGEM/rhOP-1，其中的“r”表示重组。天然hOP-1基因的制备为了进行后文表达水平比较试验，另制备天然hOP-1基因。
取新鲜胎盘组织200mg(上海长海医院提供)，剪碎后在液氮中研磨至极细，立即加入2ml TRIZOL匀浆(购自Invitrogene公司)，按厂家说明书提取总RNA。所提总RNA在1.5％琼脂糖电泳上鉴定完整性，28sRNA、18sRNA两条标志带完整清晰，表明所需的RNA没有降解。
根据已经发表的hOP-1 DNA序列(GenBank登录号XM_030620)设计引物，其中引物F(SEQ IN NO21)设计在ORF上游6～20bp，并引入以斜体表示的HindIII位点。引物R(SEQ IN NO22)中引入以斜体表示的BamHI位点引物F5 GC AAGCTTAGCGCGTAGAGCCG 3引物R5 TA GGATCCCTAGTGGCAGGCC 3合成上述引物(上海生工公司)并进行PAGE纯化。采用反转录试剂盒(Promega公司)，将以上提取的总RNA以随机六核苷酸引物反转录成单链cDNA模板。对反转录模板用引物F和引物R扩增hOP-1完整基因。具体扩增条件为50微升反应体系，其中包含1X PCR反应缓冲液，引物F和引物R的浓度均为100pM，镁离子1.5mM，模板cDNA浓度为100微摩尔，含5U Pfu DNA聚合酶(购自NEB公司)。扩增程序为预变性94℃2分钟；主循环94℃1分钟，58℃1分钟，72℃2.5分钟，共30个循环；后延伸72℃5分钟。平行进行5管扩增以获取足量的扩增产物。以上扩增产物在1％琼脂糖电泳上进行鉴定。发现有一分子量约1kb的单一条带，与预期大小相符。用胶回收试剂盒(Bio101产品)，按照产品说明书，进行凝胶回收，得到纯化的DNA。
按照产品说明书，将上述所得纯化DNA插入pGEM-T载体(Promega产品)，获得重组DNA。然后，用上述重组DNA按常规操作转化大肠杆菌DH5a菌株，通过蓝/白斑筛选获得阳性克隆。挑选阳性克隆进行酶切鉴定，确认带有目的插入片段的转化克隆。在ABI377全自动测序仪上对所得阳性转化克隆进行双向测序，确认与已知hOP-1天然基因序列完全一致。该克隆在本发明中命名为pGEM/hOP-1。hOP-1基因天然序列与人工序列的表达及比较用常规方法抽提前述天然hOP-1基因克隆pGEM/hOP-1和编码hOP-1的重组核酸克隆pGEM/rhOP-1的DNA。分别用Nhe I和Xho I进行双酶切。在0.8％琼脂糖电泳上进行分离，各切取分子量约1.3kd左右的带后用Promega公司的凝胶回收试剂盒回收该片段，即天然和重组hOP-1 DNA。
将上述回收的天然和重组DNA连接到pMSG表达载体(购自Pharmacia公司)的Nhe I/Xho I位点上，获得含天然hOP-1基因的表达载体pMSG/hOP-1和含本发明重组hOP-1基因的载体pMSG/rhOP-1。
用购自Invitrogene公司的转染试剂盒，按照说明书，采用脂质体法，用以上所得表达载体转染CHO细胞。转染后的CHO细胞经连续3个月的霉酚酸筛选，其浓度从0.05uM到10uM，每两周增加一次浓度，每次霉酚酸的用量约为前一次的2倍，具体视细胞生长情况而定。
挑选阳性克隆进行细胞培养，培养基为15％胎牛血清(Gibco)+RPM1640/DEME；37℃，5％CO2培养箱中培养72小时进行扩增。然后用极度稀释法进行单克隆化。用ELISA方法检测培养物上清液中的表达量，其中，一抗为鼠抗人OP-1单抗(购自深圳晶美公司)，二抗为HRP标记的兔抗鼠单克隆抗体(购自华美生物工程公司)。测定结果含天然hOP-1基因的CHO克隆最高表达强度为22.13mg/μL；含本发明编码hOP-1的重组核酸即工序列的CHO克隆最高表达强度则高达139.43mg/μL，是天然基因表达强度的6.3倍。由此证明，本发明编码hOP-1的重组核酸与天然hOP-1基因相比，显著提高了其在CHO细胞中的表达。hOP-1表达产物的生物活性鉴定将CHO细胞株pMSG/hOP-1和pMSG/rhOP-1分别接种在50ml RPMI1640培养基，37℃，5％CO2培养箱中进行培养。7日后取25ml细胞培养液，500RPM离心10分钟取上清。
将上述两种来源培养上清分别置于Millipore Microcon MW15000的离心浓缩管中，5000rpm离心30分钟，使其浓缩10倍左右。然后，以1∶5、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100的稀释比加入成骨细胞MC3T3-E1细胞培养基(GIBCO BRL公司产品V0743)中。
将500μl上述加有不同浓度OP-1上清液的成骨细胞MC3T3-E1细胞培养基加入到96孔板中，每种浓度6个孔。以不加OP-1上清液的成骨细胞MC3T3-E1细胞培养基作为阴性对照。然后在每个孔中加入20微升细胞密度为1×106细胞/ml的成骨细胞MC3T3-E1，37℃培养72小时后取50微升细胞测定碱性磷酸酶(AP)活性。活性测定用NBT/BCIP法进行显色反应，在酶标仪上读取495nm处的光吸收。结果如下 从上述结果可以看出，无论是rhOP-1，还是rhHOP-1，其表达产物都有显著的刺激成骨细胞AP表达的能力。由于AP水平是成骨细胞分化指征之一，说明我们获得的含rhHOP-1细胞株能够表达有生物活性的OP-1蛋白。其中，rhHOP-1上清液具有更高的生物活性，因为其表达强度较高。
序列表<110>上海中信国健药业有限公司<120>编码人成骨蛋白-1的重组核酸及其用途<130>020764<160>22<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1293<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<400>1atgcacgtgc gctccctgcg cgccgccgcc ccccactcct tcgtggccct gtgggccccc 60ctgttcctgc tgcgctccgc cctggccgac ttctccctgg acaacgaggt gcactcctcc120ttcatccacc gccgcctgcg ctcccaggag cgccgcgaga tgcagcgcga gatcctgtcc180atcctgggcc tgccccaccg cccccgcccc cacctgcagg gcaagcacaa ctccgccccc240atgttcatgc tggacctgta caacgccatg gccgtggagg agggcggcgg ccccggcggc300cagggcttct cctaccccta caaggccgtg ttctccaccc agggcccccc cctggcctcc360ctgcaggact cccacttcct gaccgacgcc gacatggtga tgtccttcgt gaacctggtg420gagcacgaca aggagttctt ccacccccgc taccaccacc gcgagttccg cttcgacctg480tccaagatcc ccgagggcga ggccgtgacc gccgccgagt tccgcatcta caaggactac540atccgcgagc gcttcgacaa cgagaccttc cgcatctccg tgtaccaggt gctgcaggag600cacctgggcc gcgagtccga cctgttcctg ctggactccc gcaccctgtg ggcctccgag660gagggctggc tggtgttcga catcaccgcc acctccaacc actgggtggt gaacccccgc720cacaacctgg gcctgcagct gtccgtggag accctggacg gccagtccat caaccccaag780ctggccggcc tgatcggccg ccacggcccc cagaacaagc agcccttcat ggtggccttc840ttcaaggcca ccgaggtgca cttccgctcc atccgctcca ccggctccaa gcagcgctcc900cagaaccgct ccaagacccc caagaaccag gaggccctgc gcatggccaa cgtggccgag960aactcctcct ccgaccagcg ccaggcctgc aagaagcacg agctgtacgt gtccttccgc 1020gacctgggct ggcaggactg gatcatcgcc cccgagggct acgccgccta ctactgcgag 1080ggcgagtgcg ccttccccct gaactcctac atgaacgcca ccaaccacgc catcgtgcag 1140accctggtgc acttcatcaa ccccgagacc gtgcccaagc cctgctgcgc ccccacccag 1200ctgaacgcca tctccgtgct gtacttcgac gactcctcca acgtgatcct gaagaagtac 1260cgcaacatgg tggtgcgcgc ctgcggctgc cac1293<210>2<211>72<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>2ctcgctagca tgcacgtgcg ctccctgcgc gccgccgccc cccactcctt cgtggccctg60tgggcccccc tg72<210>3<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>3ctgtgggccc ccctgttcct gctgcgctcc gccctggccg acttctccct ggacaacgag60gtgcac 66<210>4<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>4caacgaggtg cactcctcct tcatccaccg ccgcctgcgc tcccaggagc gccgcgagat60gcagcg 66<210>5<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>5cgagatgcag cgcgagatcc tgtccatcct gggcctgccc caccgccccc gcccccacct60gcaggg 66<210>6<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>6gcccccacct gcagggcaag cacaactccg cccccatgtt catgctggac ctgtacaacg60ccatgg 66<210>7<211>83<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>7ccgtggagga gggcggcggc cccggcggcc agggcttctc ctacccctac aaggccgtgt60tctccaccca gggccccccc ctg83<210>8<211>82<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>8cagggccccc ccctggcctc cctgcaggac tcccacttcc tgaccgacgc cgacatggtg60atgtccttcg tgaacctggt gg 82<210>9<211>83<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>9cgtgaacctg gtggagcacg acaaggagtt cttccacccc cgctaccacc accgcgagtt60ccgcttcgac ctgtccaaga tcc83<210>10<211>83<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>10tgtccaagat ccccgagggc gaggccgtga ccgccgccga gttccgcatc tacaaggact60acatccgcga gcgcttcgac aac83<210>11<211>82<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>11gagcgcttcg acaacgagac cttccgcatc tccgtgtacc aggtgctgca ggagcacctg60ggccgcgagt ccgacctgtt cc 82<210>12<211>82<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>12gtccgacctg ttcctgctgg actcccgcac cctgtgggcc tccgaggagg gctggctggt60gttcgacatc accgccacct cc 82<210>13<211>84<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>13gccacctcca accactgggt ggtgaacccc cgccacaacc tgggcctgca gctgtccgtg60gagaccctgg acggccagtc catc 84<210>14<211>84<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>14gacggccagt ccatcaaccc caagctggcc ggcctgatcg gccgccacgg cccccagaac60aagcagccct tcatggtggc cttc 84<210>15<211>89<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>15ggtggccttc ttcaaggcca ccgaggtgca cttccgctcc atccgctcca ccggctccaa60gcagcgctcc cagaaccgct ccaagaccc 89<210>16<211>90<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>16cgctccaaga cccccaagaa ccaggaggcc ctgcgcatgg ccaacgtggc cgagaactcc60tcctccgacc agcgccaggc ctgcaagaag 90<210>17<211>91<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>17ccaggcctgc aagaagcacg agctgtacgt gtccttccgc gacctgggct ggcaggactg60gatcatcgcc cccgagggct acgccgccta c 91<210>18<211>95<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>18gctacgccgc ctactactgc gagggcgagt gcgccttccc cctgaactcc tacatgaacg60ccaccaacca cgccatcgtg cagaccctgg tgcac 95<210>19<211>96<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>19cagaccctgg tgcacttcat caaccccgag accgtgccca agccctgctg cgcccccacc60cagctgaacg ccatctccgt gctgtacttc gacgac 96<210>20<211>84<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>20catctcgagt ggcagccgca ggcgcgcacc accatgttgc ggtacttctt caggatcacg60ttggaggagt cgtcgaagta cagc 84<210>21<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>21gcaagcttag cgcgtagagc cg 22<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>引物<400>22taggatccct agtggcaggc c 2权利要求
1.一种编码人成骨蛋白-1的重组核酸，其序列为SEQ ID NO1。
2.一种载体，其中包含权利要求1所述的序列。
3.一种细胞，包含权利要求1所述的重组核酸，所述基因处于与所述细胞相容的表达系统中。
4.根据权利要求3所述的细胞，选自哺乳动物细胞。
5.根据权利要求4所述的细胞，它是CHO细胞。
全文摘要
本发明提供了一种编码人成骨蛋白－1的重组核酸，能够实现在哺乳动物，尤其是CHO细胞中的高表达。本发明还提供了包含该重组编码核酸的载体、宿主细胞。本发明还提供了一种利用人成骨蛋白－1的重组核酸治疗骨损伤包括开放性骨折的方法。
文档编号C12N15/63GK1443847SQ0211097
公开日2003年9月24日 申请日期2002年3月8日 优先权日2002年3月8日
发明者王皓, 李春澍, 王一栋, 刘庆法 申请人:上海中信国健药业有限公司