专利名称：重组人白细胞介素－4，其编码核酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明是关于重组人白细胞介素-4，及其编码核酸。
背景技术：
白细胞介素-4(IL-4)是一种促进B细胞增殖的因子，最早曾命名为B细胞生长因子-1(BCGF-1)，有实验室称为B细胞刺激因子-1(BSF-1)、T细胞生长因子-2(TCGF-2)。1986年基因克隆成功，国际统一命名为白细胞介素-4(interleukin4，IL-4)。
人IL-4基因定位于第5号染色体，由4个外显子和3个内含子组成，约10kb，是现知淋巴因子基因中较大的一个。成熟人IL-4分子由129氨基酸残基组成，15kDa，有2个糖基化点，含有6个半胱氨酸，参与分子内二硫键的组成。
IL-4对于B细胞、T细胞、肥大细胞、巨噬细胞和造细胞都有免疫调节作用。IL-4促进SAC或抗IgM预先刺激B细胞的增殖，这一生物学功能已被用来作为检测IL-4的生物学活性。IL-4促进B细胞MHC II类抗原、FcεR II/CD23和CD40的表达，并增强B细胞提呈抗原能力，使免疫系统对小量抗原刺激发生免疫应答。高剂量IL-4能诱导CD4-CD8+或CD4+CD8-或CD4-CD8-胸腺细胞的增殖。IL-4增强PHA刺激T细胞释放GM-CSF和G-CSF。在小鼠实验系统中，多数情况下IL-4对CTL和LAK细胞的分化有正调节作用；而对人的杀伤细胞则有时表现为负调节作用，如在人MLC中IL-4选择性地促进Th增殖，同时伴有CTL、NK和LAK功能的降低。此外IL-4还能抑制IL-2所诱导的NK白血病细胞LAK活性。最近发现，用IL-4与T细胞或B细胞温育，可降低高亲和力IL-2R位点数，但不影响低亲和力IL-2R的数量。IL-4还可刺激CD3阴性NK细胞克隆的生长。IL-4能刺激肥大细胞增殖，并与IL-3有协同作用，尤其对于粘膜和结缔组织型肥大细胞体外生长是必需的。IL-4能促进巨噬细胞提呈抗原和杀伤肿瘤细胞的功能。这可能与调节MHC II类抗原和FcR表达有关。IL-4与GM-CSF、IL-3和LPS有协同作用。IL-4可诱导外周血单核细胞分泌G-CSF和M-CSF，增强中性粒细胞介导的吞噬、杀伤活性和ADCC作用。IL-4是小鼠巨噬细胞趋化因子，并促进IL-1ra产生，但抑制单核细胞IL-1、TNF和IL-6的产生。IL-4能协同CSF刺激造血细胞的增殖，与G-CSF协同增强粒细胞集落形成，协同红细胞生成素(EPO)增强BFU-E的形成。
由于体内、体外均证实IL-4可以抑制IL-1、IL-6和TNF分泌，并促进IL-1ra产生，应用IL-4可能为治疗败血症休克提供一种新的方法。因此，获得生物活性更强的IL-4，通过基因工程人工合成，并尽可能提高其得率，在科研，医疗，和产业化方面无疑具有巨大的潜在价值。
发明内容
本发明的目的在于提供具有更高生物活性的重组人白细胞介素-4。
本发明的目的还在于提供编码上述重组IL-4，并可在大肠杆菌中实现高表达的核酸序列。
本发明的目的还在于提供可实现上述目的的载体和宿主细胞。
为例实现上述各发明目的，本发明实施了以下技术方案。
本发明提供一种重组人白细胞介素-4，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，其中第38位的氨基酸选自丙氨酸，甘氨酸和丝氨酸，第72位的氨基酸选自丝氨酸或苏氨酸，第100位氨基酸选自甘氨酸，丙氨酸和丝氨酸。根据蛋白质结构与氨基酸之间的关系，当蛋白质某个氨基酸如上所述地被性质相同或者相近的氨基酸取代后，其结构和功能一般不发生变化，能够获得同样甚至更好的效果。
本发明优选实施方式之一中，上述重组IL-4中，第38位氨基酸是丙氨酸，第72位是丝氨酸，且第100为是甘氨酸。
本发明的重组IL-4可用多种方法制备而得，既可以如本发明所述由重组IL-4编码核酸表达而得，也可以通过全化学合成获得。有关蛋白质或肽的制备在现有文献中多有记载，这些方法都适用于本发明重组IL-4的制备。此外，蛋白质的鉴定也是本领域的常规技术，在现有文献中多有记载。因此，根据本发明给定的氨基酸序列，本领域技术人员不难结合现有技术获得本发明的重组IL-4。
本发明还提供一种重组编码核酸，它编码权利要求1所述的重组人白细胞介素-4，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示，其中第112-114位选自GCT、GCA、GCC、GCG、GGT、GGA、GGC、GGG、TCT、TCC、TCA、TCG，第214-21 6位选自TCT、TCC、TCA、TCG、ACT、ACC、ACA、ACG，而且第298-300位选自GGT、GGA、GGC、GGG、GCT、GCA、GCC、GCG、TCT、TCC、TCA、TCG。
本发明实施方式之一中，所述重组核酸中的第112-114位是GCT，第214-216位是TCT，而且第298-300位是GGT。
本发明的重组核酸可用多种方法获得，其中包括，以公开的天然序列(例如GeneBank登录号XM_004053)为模板进行定点诱变；或根据本发明给定的序列进行全合成。这些都已是本领域的常规技术。而且，核苷酸序列的鉴定也是本领域的常规技术，在现有文献中多有记载。因此，根据本发明给定的核苷酸序列，本领域技术人员不难结合现有技术制备得到本发明的编码IL-4的重组核酸。
本发明还提供一种载体，其中含有本发明的重组核酸。在本领域中，通过适当的克隆技术，将目的核酸片段插入合适的载体以实现保存，扩增和/或表达等目的，已是一般常规技术。合适载体的选择取决于克隆目的，载体容留，与宿主细胞的相容性，酶切位点等多种因素，本领域技术人员不难根据具体情况做出适当选择。可用以本发明的载体例如但不限于pUC18、pUC19、pUC57、pBluescript sk+/sk-。
本发明实施方式之一中，所述载体还含有操作性连接于所述重组核酸序列5’端的信号肽序列，从而使该编码核酸在大肠杆菌中以分泌的形式表达。所述信号肽序列可使用但不限于大肠杆菌OmpA信号肽(GenBank登录号U40577)。
本发明还提供含有本发明重组IL-4编码核酸的宿主细胞，例如大肠杆菌。本发明实施方式之一中，所述宿主细胞是含有本发明所述载体的大肠杆菌。对于大肠杆菌的基因工程操作在本领域内已相当成熟。例如，按照标准技术，通过常规转染、转化、微注射等多种方法都可将目的核酸导入宿主细胞，并结合常规筛检方法，可获得良好的再现性。
图1是本发明所用表达载体pUC18的酶切图。
图2是本发明重组IL-4对PBMC促生长作用与阳性对照的比较图。
具体实施例方式
重组IL-4的氨基酸序列本实施例的重组IL-4氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，与天然序列(Genbank登录号XM-004053)的区别在于第38位，第72位和第100位上发生突变。本实施方式中，第38位由原来的天冬酰胺变为丙氨酸，第72位由原来的谷氨酰胺变为丝氨酸，第100位由原来的脯氨酸变为甘氨酸。编码重组IL-4的重组核苷酸序列根据本实施例重组IL-4的氨基酸序列，并考虑大肠杆菌密码子使用的偏爱性，设计得到编码本实施例重组IL-4的氨基酸序列，如SEQ ID NO2所示。在本实施方式中，第112-114位是GCT，第214-216位是TCT，而且第298-300位是GGT。核酸的人工合成为了简化表达产物的纯化程序，在本实施例重组编码核酸的5′端直接操作性连接了一段一段大肠杆菌的信号肽序列，这样可使核酸在大肠杆菌中以分泌的形式表达。本实施方式选用大肠杆菌ompA基因的信号肽序列增加的序列如下。大肠杆菌OmpA信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO3(GenBank登录号U40577)所示，其编码序列如SEQ ID NO4(GenBank Accession NumberU40577)所示。
此外，为了启动翻译，在该信号肽序列的5′端增加启动Met密码子atg。而且，为了便于后续的克隆操作，在atg的5′端再增加了个EcoRI位点，在本实施例重组编码核酸的3′端增加一个HindIII位点。至此，本实施例人工合成的插入片段序列如下所示，记作IL-4/OpmAgaattcatgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtagcgcaggcc 69CACAAATGCGACATCACCCTGCAGGAAATCATCAAAACCCTGAACTCTCTGACCGAACAGAAAACCCTGTGCACCGAACT 149GACCGTTACCGACATCTTCGCTGCTTCTAAAGCTACCACCGAAAAAGAAACCTTCTGCCGTGCTGCTACCGTTCTGCGTC 229AGTTCTACTCTCACCACGAAAAAGACACCCGTTGCCTGGGTGCTACCGCTCAGTCTTTCCACCGTCACAAACAGCTGATC 309CGTTTCCTGAAACGTCTGGACCGTAACCTGTGGGGTCTGGCTGGTCTGAACTCTTGCGGTGTTAAAGAAGCTAACCAGTC 389TACCCTGGAAAACTTCCTGGAACGTCTGAAAACCATCATGCGTGAAAAATACTCTAAATGCTCTTCTaagctt456本实施例采用标准长片段融合PCR制备以上IL-4/OpmA。按照常规引物设计的原则将上述序列及其互补链拆分成26个长度约为83～88b长度的寡核苷酸片段作为。这些引物可以自己合成，也可以委托已商业化的专业机构合成。例如，本实施例的引物片段并委托上海生工公司合成。然后，进行标准融合PCR来获得本实施例的IL-4/ompA基因片段，具体操作如下(1)反应体系在0.2ml PCR管中加入以下各物质组分 体积
10×Pfu PCR缓冲液 5μl寡核苷酸引物片段 1μl50×dNTP混合物 1μl50×Pfu DNA聚合酶 1μlPCR专用水 补至40μl总体积 50μl(2)反应条件预变性94℃2min；主循环95℃1min，60℃40s，72℃1min，循环35次；后延伸72℃10min。
通过凝胶电泳观察结果，由凝胶回收预定大小的IL-4/ompA片段。然后，按照按照常规方法，将该片段克隆于质粒pGEM-T Easy(Promega)，进行基因测序。测序工作已商业化。例如，本实施例的测序工作委托上海基康公司进行。根据测序结果确定了序列完全正确的克隆，记作pIL-4/ompA。表达载体的构建本实施例采用pUC18载体作为表达载体。将上述pIL-4/ompA片段用EcoRI及HindIII酶切，在1％琼脂糖电泳上分离，用PROMEGA公司的胶回收试剂盒回收长度大约0.45kb左右的片段。然后用MBI公司的连接试剂盒把IL-4/ompA基因片段连接于原核表达载体pUC18载体的上，构成pUC18-IL-4/ompA表达载体。
具体地说，在微量离心管中加入以下各物质根据设计的酶切位点，用EcoRI及HindIII酶切表达质粒pUC18。在微量离心管中加入以下各物质pUC18质粒DNA 3μg10×限制酶缓冲液 3μlEcoRI和HindIII 15U1mg/ml乙酰化BSA 3μl无核酸酶的水 至40μl37℃孵育4小时，以DNA标记作对照，电泳，胶回收酶切的质粒pUC18，置-20℃保存待用。
用相同的反应体系和反应条件，用EcoRI及HindIII酶切携带目的核酸的质粒pGEM-T Easy即pIL-4/ompA，凝胶回收目的片段IL-4/ompA。
连接酶切表达质粒pUC18及目的片段IL-4/ompA在0.2ml PCR管中加入以下各物10×连接缓冲液 2μl100mM DTT2μl10mM ATP 1μl50ng/μl经酶切的pUC182μlT4连接酶 1μl
目标片段1μl无核酸酶的水11μl总体积 20μl4C连接过夜。然后，把连接构建好的质粒pUC18转化入表达工程菌DH5a中，培养于氨苄青霉素培养皿上。挑取单菌落进行扩增培养。抽提质粒，用EcoRI及HindIII酶切鉴定，方法同前。酶切产物在1％琼脂糖电泳上进行鉴定，挑选大小争取的克隆进行测序。将序列完全正确的克隆记作pUC18-IL-4/ompA。重组IL-4的表达与纯化取pUC18-IL-4/ompA克隆储备液100μl分别接种到5ml含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB液体培养基中，37℃，260rpm震荡培养至OD值达0.4～1.0，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.5～1mmol/L。培养3小时，从每种培养物中取出1ml转移到离心管中，离心，去上清；裂解菌体进行SDS蛋白电泳，用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺进行染色，检测目的蛋白的表达。
用ELISA法检测(用CloneTech公司的试剂盒)的结果表明，该菌株分泌表达的目的产物占菌体可溶性蛋白的28％，高于本技术领域内目前所能达到表达水平，即表达产物占菌体可溶性蛋白低于10％(该信息来源？文献出处？)。
采用离子交换层析、疏水层析和分子筛层析进行蛋白纯化，采用HPLC和SDS-PAGE电泳进行重组蛋白的纯度测定，其纯度在95％以上。重组IL-4生物活性检验(一)促人外周血淋巴细胞(PBMC)生长作用用淋巴细胞分离液(Sigma产品)分离单核细胞。用预温的RPMI1640培养液洗涤细胞两次，每次400×g离心10分钟，去上清。
在含5％的小牛血清和1％(V/V)PHA的RPMI1640培养基、5％CO2培养箱中培养48小时。500RPM离心收集细胞，用含有10％小牛血清的DEME培养基配制成5×104细胞/ml的悬液。
取96孔板，每孔中加入100微升细胞悬液，100微升系列稀释的本实施例重组IL-4待测样品(200ng/ml)，以标准品天然人IL-4(购自R&D公司)(200ng/ml)为阳性对照，以不加IL-4作为阴性对照，37℃，5％CO2培养箱中培养48小时。每处理3个重复孔。
MTT检测取经过上述处理的样品0.1毫升，加入1/10体积浓度为5mg/ml的MTT溶液，37℃培养30分钟后在酶标仪上读取570nm处的吸光度。以三个重复孔读数的平均数作为计算和比较的依据。结果表明，本实施例重组IL-4的活性明显高于对照样品。
表重组IL-4活性测定结果IL-4浓度(ng/ml)0.1 0.5 1 2.5 5 1015202550100阳性对照 0.03 0.07 0.09 0.22 0.51 0.87 1.12 1.27 1.38 1.41 1.41待测样品 0.31 0.35 0.51 0.89 1.27 1.53 1.75 1.82 1.88 1.89 1.87还根据以上数据制作的图2。从中可以看出，本实施例的重组IL-4促进PBMC生长的活性明显高于阳性对照。(一)与受体IL-4Rα的亲和力为了检测3个氨基酸取代后对亲和力的影响，用固相杂交法检测IL-4受体IL-4Rα与IL-4的亲和力(Ldzerda，R.L.，et.al.，Human interleukin 4 receptorconfers biological responsiveness and defines a novel receptor superfamily，J.Exp.Med.171861-873(1990))。简要地说，即本实施例重组IL-4和天然IL-4与固定化受体IL-4Rα的竞争结合。
具体地说，用预先包被了链霉亲和素的96孔板进行，然后用生物素标记的bio-IL-4Rα与96孔板上的链霉亲和素结合，用含有2％Tween-20的PBS洗涤20次。然后在每个孔中加入100μl HRP标记的天然IL-4(100ng/ml)，4℃下温育过夜后，用含有2％Tween-20的PBS洗涤20次。加入100μl未经标记的本实施例重组IL-4/，4℃温育过夜后，用含有2％Tween-20的PBS洗涤20次。
MTT检测取经过上述处理的样品0.1毫升，加入1/10体积浓度为5mg/ml的MTT溶液，37℃培养30分钟后在酶标仪上读取570nm处的吸光度。以三个重复孔读数的平均数作为计算和比较的依据。
结果经上述测定和计算，阳性对照对IL-4Rα的亲和力常数Kd＝75pM，而本实施例重组IL-4R的Kd＝0.35pM。改造后其亲和力提高了213倍。
序列表<110>上海中信国健药业有限公司<120>重组人白细胞介素-4，其编码核酸及其应用<130>020766<160>4<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>129<212>PRT<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(38)..(38)<223>Xaa＝Ala，Gly，Ser<220><221>misc_feature<222>(72)..(72)<223>Xaa＝Ser，Thr<220><221>misc_feature<222>(100)..(100)<223>Xaa＝Gly，Ala，Ser<400>1His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser1 5 10 15Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile20 25 30Phe Ala Ala Ser Lys Xaa Thr Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala35 40 45Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg50 55 60Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Xaa Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile65 70 75 80Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu85 90 95Asn Ser Cys Xaa Val Lys Glu Ala Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe100 105 110Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser115 120 125Ser<210>2<211>387<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<220><221>misc_feature<222>(112)..(114)<223>nnn＝GCT，GCA，GCC，GCG，GGT，GGA，GGC，GGG，TCT，TCC，TCA，TCG<220><221>misc_feature<222>(214)..(216)<223>nnn＝TCT，TCC，TCA，TCG，ACT，ACC，ACA，ACG<220><221>misc_feature<222>(298)..(300)<223>nnn＝GGT，GGA，GGC，GGG，GCT，GCA，GCC，GCG，TCT，TCC，TCA，TCG<400>2cacaaatgcg acatcaccct gcaggaaatc atcaaaaccc tgaactctct gaccgaacag 60aaaaccctgt gcaccgaact gaccgttacc gacatcttcg ctgcttctaa annnaccacc 120gaaaaagaaa ccttctgccg tgctgctacc gttctgcgtc agttctactc tcaccacgaa 180aaagacaccc gttgcctggg tgctaccgct cagnnnttcc accgtcacaa acagctgatc 240cgtttcctga aacgtctgga ccgtaacctg tggggtctgg ctggtctgaa ctcttgcnnn 300gttaaagaag ctaaccagtc taccctggaa aacttcctgg aacgtctgaa aaccatcatg 360cgtgaaaaat actctaaatg ctcttct 387<210>3<211>20<212>PRT<213>大肠杆菌(E.Coli.)<400>3Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr1 5 10 15Val Ala Gln Ala20<210>4<211>60<212>DNA<213>大肠杆菌(E.Coli.)<400>4aaaaagacag ctatcgcgat tgcagtggca ctggctggtt tcgctaccgt agcgcaggcc60
权利要求
1.一种重组人白细胞介素-4，其氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，其中第38位的氨基酸选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸，第72位的氨基酸选自丝氨酸和苏氨酸，第100位氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸。
2.根据权利要求1所述的重组人白细胞介素-4，其中第38位氨基酸是丙氨酸，第72位是丝氨酸，且第100为是甘氨酸。
3.一种重组核酸，它编码权利要求1所述的重组人白细胞介素-4，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示，其中第112-114位选自GCT、GCA、GCC、GCG、GGT、GGA、GGC、GGG、TCT、TCC、TCA、TCG，第214-216位选自TCT、TCC、TCA、TCG、ACT、ACC、ACA、ACG，而且第298-300位选自GGT、GGA、GGC、GGG、GCT、GCA、GCC、GCG、TCT、TCC、TCA、TCG。
4.根据权利要求3所述的重组核酸，其中，第112-114位是GCT，第214-216位是TCT，而且第298-300位是GGT。
5.一种载体，其中含有权利要求3或4所述的重组核酸。
6.根据权利要求5所述的载体，还含有操作性连接于所述重组核苷酸序列5′端的大肠杆菌OmpA信号肽。
7.一种重组宿主细胞，其中含有权利要求3或4所述的重组核酸。
8.根据权利要求8所述的宿主细胞，所述细胞是大肠杆菌。
9.根据权利要求9所述的宿主细胞，含有权利要求6所述的载体。
全文摘要
本发明提供一种重组人白细胞介素－4，它具有更高的生物活性。本发明还提供编码该重组人白细胞介素－4的核酸，载体，以及表达该重组蛋白的宿主细胞。
文档编号C12N15/63GK1443776SQ0211097
公开日2003年9月24日 申请日期2002年3月8日 优先权日2002年3月8日
发明者胡辉, 李春澍, 李晶, 王皓 申请人:上海中信国健药业有限公司