专利名称：新型肿瘤凋亡素2配体基因、其表达的肿瘤凋亡素及其制法的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药生物工程技术领域，是从中国人外周血单个核细胞中获得的一种新型的肿瘤凋亡素2配体基因，并利用该基因制备人可溶性肿瘤凋亡蛋白——肿瘤凋亡素的方法。
本发明用Apo-2L I基因来制备人可溶性肿瘤凋亡素。以Apo-2L I基因为模板，通过PCR扩增，从编码序列5’端第297-801位核苷酸得到人可溶性肿瘤凋亡素基因，其编码的氨基酸相当于Apo-2L I蛋白N-端第100～267位氨基酸，故称其为Apo-2L I100基因，其与Apo-2L114基因一样，由504个核苷酸组成。其编码的蛋白与Apo-2L I114相同，也由168个氨基酸组成，称之为Apo-2L I100或肿瘤凋亡素。
制备Apo-2L I100所使用的表达载体为pBV220。pBV220由中国预防医学科学院病毒研究所提供，该载体是温控型的原核表达载体，其表达量较高。本发明通过合成寡聚核苷酸，置换原pBV220载体Bg1II与Xmn I之间的序列，所构建的表达载体命名为pBV-Apo-2L I100，该质粒转化大肠杆菌，所得的工程菌能直接表达具有生物学活性的Apo-2L I100。使Apo-2L I100表达量占工程菌总蛋白的40％以上，占破碎后工程菌上清总蛋白的10％以上，大大提高了肿瘤凋亡素Apo-2L I100的产量和质量，且制备方法简便。
本发明Apo-2L I基因的克隆，Apo-2L I100的制备，具体包括如下步骤一、构建cDNA文库，制备Apo-2L I基因1.制备人外周血单个核细胞总RNA(1)按常规方法从中国人外周血中分离淋巴细胞，进而用贴壁法获得单个核细胞；(2)用细菌内毒素激活单个核细胞以刺激细胞提高RNA的丰度，再用RNA抽提试剂盒(Qiagen公司)抽提总RNA。
2.筛选Apo-2L I基因(1)构建cDNA文库从上述总RNA中用Oligo-dT柱(Qiagen公司)纯化出总mRNA，以总mRNA为模板，用cDNA文库构建试剂盒(Clontech公司)建成cDNA文库。
(2)筛选出Apo-2L I基因按常规用随机引物法制备基因探针，杂交筛选上述cDNA文库，筛选出克隆。这些克隆的插入部分亚克隆到pSPORT1的Not I位点。经序列分析，其中一个克隆的基因其DNA序列由1727bp组成，含87bp的5’非翻译区，801bp的开放阅读框(编码267个氨基酸，即全长Apo-2L I蛋白)，3’非翻译区(含多聚腺苷酸化信号或称polyA尾)。该基因命名为Apo-2L I基因，其核苷酸序列见表1，其编码的氨基酸序列见表2。该质粒命名为pSPORT1-Apo-2L I。含此质粒的菌株Escherichia coli K802(基因型supE hard gal metB)已于2000年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏号CCTCCNo.200037；武汉大学)。
二、构建Apo-2L I100的原核表达工程菌株1.制备Apo-2L I100基因设计并合成引物，以Apo-2L I基因为模板，PCR扩增出编码序列Apo-2L I100基因。
2.构建原核表达载体pBV-Apo-2L I100设计并合成两条寡聚核苷酸双链，置换pBV220载体的Bgl II与Xmn I之间的序列，置换的序列是(1)将pBV220原启动子λPL置换为λPLPR串联启动子；(2)引入序列为5’-AGGAATTCACAATG-3’的SD序列。然后与Apo-2L I100基因和外源基因下游调控序列相连。这样所构建成的pBV-Apo-2L I100载体，其核糖体结合序列与蛋白翻译起始密码子之间的距离为7个核苷酸，以利于Apo-2L I100在细菌中的表达。
3.建立Apo-2L I100表达工程菌将上述pBV-Apo-2L I100转化大肠杆菌，筛选得到含重组质粒的克隆即为Apo-2L I100的工程菌。
三、制备Apo-2L I1001.发酵培养工程菌，使其表达Apo-2L I100；
2.超声破碎所得菌体，上清行金属亲和层析、凝胶过滤进一步纯化，即得Apo-2L I100。
2.建立cDNA文库，筛选Apo-2L I基因按常规将上述所得的总RNA，用Oligo-dT柱(Qiagen公司)纯化得总mRNA，以总mRNA为模板，用cDNA合成试剂盒(Clontch公司)进行cDNA第一链和第二链的合成，加上EcoRI接头后连接到λgt10载体中，并用λ噬菌体包装试剂盒(Clontech公司)包装成λ噬菌体文库，建成λgt10 cDNA文库，文库的滴度为6×106。
用随机引物法制备基因探针，杂交筛选此λgt10 cDNA文库(详见《分子克隆》第396～601页)。得到12个阳性噬菌斑。抽提其DNA，得12个纯化的λDNA，用Not I消化，1％琼脂糖凝胶电泳，Southern印迹确认与探针杂交。挑选杂交强度大的克隆，抽提其DNA，再把该DNA的插入部分亚克隆到pSPORTl(GIBCO公司)的Not I位点。测定质粒中插入部分的DNA序列。其中一个序列由1727bp组成，包含87bp的5’非翻译区，801bp开放阅读框和3’非翻译区(含多聚腺苷酸化信号或称polyA尾)，此片段即Apo-2L I基因，核苷酸序列如表1。含此基因的质粒即pSPORT1-Apo-2L I，含该质粒的菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏号CCTCC No.200037，中国武汉大学)。根据Kozak定义的翻译起始位点要求，第88-90位核苷酸(ATG，编码蛋氨酸)为翻译起始位点，由此得到的最大开放阅读框所编码的267个氨基酸序列如表2。二、构建Apo-2L I100原核表达载体以pBV220质粒为基础，构建可溶性肿瘤凋亡素Apo-2L I100的原核表达载体pBV-Apo-2L I100。具体步骤如下1.设计并合成引物P1、P2和寡聚核苷酸双链P3、P4 P1、P2为扩增编码Apo-2L I100基因的引物。P1引入蛋白合成起始密码子ATG及EcoR I酶切位点GAATTC；P2引入BamH I酶切位点GGATCC。
合成寡聚核苷酸双链P3、P4 P3、P4为置换原始pBV220载体Bg1 II与Xmn I之间的外源基因上游调控序列及下游序列。P3的斜体部分为λPLPR串联启动子，阴影部分为cI抑制蛋白结合位点，黑体部分为核糖体结合序列，5’端引入Bg1 II酶切位点AGATCT，3’端引入EcoR I酶切位点GGATTC；P4的5’端引入了BamH I酶切位点GGATCC，3’端引入Xmn I酶切位点GAANNNNTTC。
2.构建表达载体pBV-Apo-2L I100构建表达载体pBV-Apo-2L I100的流程如
图1，具体步骤如下以P1、P2为引物，以质粒pSPORT1-Apo-2L I为模板，PCR扩增Apo-2L I100基因编码序列，产物以EcoR I和BamH I酶切(NEB公司)。以Bg1 II和EcoR I酶切P3，BamH I和Xmn I酶切P4。以Bg1 II和Xmn I双酶切pBV220质粒。各酶切片段琼脂糖凝胶回收相应大小的片段，用T4 DNA连接酶连接各片段，所得到的重组质粒即肿瘤凋亡素Apo-2L I100的表达载体pBV-Apo-2L I100。三、转化大肠杆菌，建立工程菌按常规将pBV-Apo-2L I100转化大肠杆菌BL21[基因型hsdS gal(λcIts857indl Sam7 nin5lacUV5-T7)]，从氨苄抗性菌落中分离质粒，酶切鉴定，测序确认为pBV-Apo-2L I100。所得的细菌即为本发明的工程菌。四、制备Apo-2L I100挑取一个工程菌菌落，接入含有氨苄青霉素(100μg/ml)的5ml LB培养液的试管中于32℃培养过夜。LB培养基配方(g/L)为蛋白胨∶酵母粉∶NaCl＝10∶5∶5。
把过夜培养的细菌按1∶100接入含有氨苄青霉素(100μg/ml)的2×YT培养基中，培养6小时。2×YT培养基配方(g/L)为蛋白胨∶酵母粉∶NaCl＝16∶10∶5。
再把培养的细菌按1∶40接入含有氨苄青霉素(100μg/ml)的半合成培养基中进行发酵。32C培养5-7小时；升温至42℃培养4-5小时。用恒流泵以0.2ml/min/L培养基添加补料，溶解氧控制在30～50％之间。得到约20-30克/升发酵液的湿菌体。半合成发酵培养基中配方(g/L)为蛋白胨∶酵母粉∶KH2PO4∶K2HPO4∶Na2HPO4·12H2O∶(NH4)2SO4∶NH4Cl＝5∶5∶2∶4∶7∶1.2∶0.2；发酵补料配方(g/L)为葡萄糖∶酵母粉∶蛋白胨∶MgSO4·7H2O＝200∶70∶70∶5.7。
超声破碎发酵菌体，上清用0.22μm的滤膜过滤；再用3×20cm的TALON Metal AffinityRsins(Clontech公司)柱行金属亲合层析，10mmol/L咪唑，pH7.0，洗5个床体积以洗脱杂蛋白，再以100mmol/L咪唑，pH7.0，洗5个床体积以洗脱Apo-2L I100；Sephacryl S-200进一步纯化Apo-2L I100，即可得到高纯度Apo-2L I100。
表1.Apo-2L I基因核苷酸序列表1 CCT CAC TGA CTA TAA AAG AAT AGA GAA GGA AGG GCT TCA GTG ACC GGC TGC CTG GCT GAC 6061 TTA CAG CAG TCA GAC TCT GAC AGG ATC ATG GCT ATG ATG GAG GTC CAG GGG GGA CCC AGC 120121 CTG GGA CAG ACC TGC GTG CTG ATC GTG ATC TTC ACA GTG CTC CTG CAG TCT CTC TGT GTG 180181 GCT GTA ACT TAC GTG TAC TTT ACC AAC GAG CTG AAG CAG ATG CAG GAC AAG TAC TCC AAA 240241 AGT GGC ATT GCT TGT TTC TTA AAA GAA GAT GAC AGT TAT TGG GAC CCC AAT GAC GAA GAG 300301 AGT ATG AAC AGC CCC TGC TGG CAA GTC AAG TGG CAA CTC CGT CAG CTC GTT AGA AAG GAA 360361 AAG CAA CAA AAT ATT TCT CCC CTA GTG AGA GAA AGA GGT CCT CAG AGA GTA GCA GCT CAC 420421 ATA ACT GGG ACC AGA GGA AGA AGC AAC ACA TTG TCT TCT CCA AAC TCC AAG AAT GAA AAG 480481 GCT CTG GGC CGC AAA ATA AAC TCC TGG GAA TCA TCA AGG AGT GGG CAT TCA TTC CTG AGC 540541 AAC TTG CAC TTG AGG AAT GGT GAA CTG GTC ATC CAT GAA AAA GGG TTT TAC TAC ATC TAT 600601 TCC CAA ACA TAC TTT CGA TTT CAG GAG GAA ATA AAA GAA AAC ACA AAG AAC GAC AAA CAA 660661 ATG GTC CAA TAT ATT TAC AAA TAC ACA AGT TAT CCT GAC CCT ATA TTG TTG ATG AAA AGT 720721 GCT AGA AAT AGT TGT TGG TCT AAA GAT GCA GAA TAT GGA CTC TAT TCC ATC TAT CAA GGG 780781 GGA ATA TTT GAG CTT AAG GAA AAT GAC AGA ATT TTT GTT TCT GTA ACA AAT GAG CAC TTG 840841 ATA GAC ATG GAC CAT GAA GCC AGT TTT TTT GGG GCC TTT TTA GTT GGC TAA CTG ACC TGG 900901 AAA GAA AAA GCA ATA ACC TCA AAG TGA CTA TTC AGT TTT CAG GAT GAT ACA CTA TGA AGA 960961 TGT TTC AAA AAA TCT GAC CAA AAC AAA CAA ACA GAA AAC AGA AAA CAA AAA AAC CTC TAT 10201021 GCA ATC TGA GTA GAG CAG CCA CAA CCA AAA AAT TCT ACA ACA CAC ACT GTT CTG AAA GTG 10801081 ACT CAC TTA TCC CAA GAA AAT GAA ATT GCT GAA AGA TCT TTC AGG ACT CTA CCT CAT ATC 11401141 AGT TTG CTA GCA GAA ATC TAG AAG ACT GTC AGC TTC CAA ACA TTA ATG CAA TGG TTA ACA 12001201 TCT TCT GTC TTT ATA ATC TAC TCC TTG TAA AGA CTG TAG AAG AAA GCG CAA CAA TCC ATC 12601261 TCT CAA GTA GTG TAT CAC AGT AGT AGC CTC CAG GTT TCC TTA AGG GAC AAC ATC CTT AAG 13201321 TCA AAA GAG AGA AGA GGC ACC ACT AAA AGA TCG CAG TTT GCC TGG TGC AGT GGC TCA CAC 13801381 CTG TAA TCC CAA CAT TTT GGG AAC CCA AGG TGG GTA GAT CAC GAG ATC AAG AGA TCA AGA 14401441 CCA TAG TGA CCA ACA TAG TGA AAC CCC ATC TCT ACT GAA AGT GCA AAA ATT AGC TGG GTG 15001501 TGT TGG CAC ATG CCT GTA GTC CCA GCT ACT TGA GAG GCT GAG GCA GGA GAA TCG TTT GAA 15601561 CCC GGG AGG CAG AGG TTG CAG TGT GGT GAG ATC ATG CCA CTA CAC TCC AGC CTG GCG ACA 16201621 GAG CGA GAC TTG GTT TCA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAC TTC AGT AAG TAC GTG TTA TTT 16801681 TTT TCA ATA AAA TTC TAT TAC AGT ATG TCA AAA AAA AAA AAA AAA AA 1727表2.Apo-2LI氨基酸序列表1 MAMMEVQGGP SLGQTCVLIV IFTVLLQSLC VAVTYVYFTN ELKQMQDKYS KSGIACFLKE DDSYWDPNDE 7071 ESMNSPCWQV KWQLRQLVRK EKQQNISPLV RERGPQRVAA HITGTRGRSN TLSSPNSKNE KALGRKINSW 140141 ESSRSGHSFL SNLHLRNGEL VIHEKGFYYI YSQTYFRFQE EIKENTKNDK QMVQYIYKYT SYPDPILLMK 210211 SARNSCWSKD AEYGLYSIYQ GGIFELKEND RIFVSVTNEH LIDMDHEASF FGAFLVG 26权利要求
1.一种肿瘤凋亡素2配体全基因即Apo-2L I基因，其特征在于编码序列由801个核苷酸组成，与编码281个氨基酸的肿瘤凋亡素2配体基因即Apo-2L基因序列相比，少了位于后者编码序列5’端第271-313位的42个核苷酸。
2.权利要求1所述的Apo-2L I基因编码的肿瘤凋亡素2配体Apo-2L I，其特征是由267个氨基酸组成，与281个氨基酸组成的肿瘤凋亡素2配体Apo-2L相比，少了位于后者N端第91-104位的14个氨基酸。
3.权利要求1所述Apo-2L I基因用以制备肿瘤凋亡素Apo-2L I100的方法，其特征在于以Apo-2L I基因为模板扩增得Apo-2L I100基因，再以pBV220构建pBV-Apo-2L I100表达载体，转化，建立工程菌，所表达的Apo-2L I100直接有生物学活性。
4.权利要求2、3所述肿瘤凋亡素2配体Apo-2L I或肿瘤凋亡素Apo-2L I100用于制备杀伤肿瘤细胞药物或制剂的用途。
全文摘要
本发明涉及医药生物工程技术领域,是从中国人外周血单个核细胞获得的一种新型肿瘤凋亡素2配体全基因,即Apo－2L I基因;并利用该基因制备人可溶性肿瘤凋亡素蛋白,即肿瘤凋亡素或称Apo－2L I
文档编号C12N15/12GK1367248SQ02110880
公开日2002年9月4日 申请日期2002年2月22日 优先权日2002年2月22日
发明者王梁华, 焦炳华 申请人:中国人民解放军第二军医大学