专利名称：一种重组人可溶性凋亡素2配体的构建与纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种重组人可溶性凋亡素2配体(recombinant human soluble apoptosis 2 ligand，简称rhsApo-2L)的构建与纯化工艺。
Apo-2L(apoptosis 2 ligand)，又称TRAIL(TNF relatedapoptosis-inducing ligand)，中文译为凋亡素2配体，或称肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体。是TNF(肿瘤坏死因子)家族的一个新成员，于1995年由Wiley SR等人克隆获得。人Apo-2L分子(hApo-2L)由281个氨基酸残基组成，是一种典型的II型跨膜蛋白。在正常的生理情况下，hApo-2L只能表达于细胞膜上，通过细胞与细胞之间的相互作用发挥功能。随着研究的深入，人们发现，hApo-2L的114-281位氨基酸残基所形成的分子，能游离于细胞之外，以可溶性的方式存在，因此将这种分子命名为可溶性的人Apo-2L分子(hsApo-2Lhuman soluble Apo-2L)。hsApo-2L与天然hApo-2L分子具有相同的生物学活性，能够非常有效的杀伤肿瘤细胞。与其它TNF家族成员相比，其抗癌作用具有以下特点(1)诱导肿瘤细胞凋亡的能力更强。TNF等在诱导肿瘤细胞凋亡时，一般需要化疗药物CHX(放线菌酮)等的存在，而hsApo-2L单独使用，就可有效杀伤细胞。(2)诱导肿瘤细胞凋亡的同时对正常细胞无毒副作用。研究证实，hsApo-2L对人脐静脉血管内皮细胞、肺成纤维细胞、乳腺细胞、肾脏细胞、前列腺上皮细胞、结肠平滑肌细胞、星状细胞等均无诱导凋亡的作用。(3)具有更广的抗癌谱。由于hsApo-2L的受体几乎组成性的表达于全身所有组织，因此hsApo-2L可作用于各种组织来源的肿瘤细胞，具有广泛的抗癌作用。研究也证实，hsApo-2L可诱导近2/3的肿瘤细胞系发生凋亡，其中包括乳腺癌、肝癌、前列腺癌、宫颈癌、结肠癌、淋巴癌以及肾脏肿瘤和中枢神经系统肿瘤等。(4)hsApo-2L仅对细胞核因子NFκB有很微弱的激活作用，说明在全身用药时不会象TNF那样产生严重的毒副作用。动物实验也证实，即使在hsApo-2L用量很大的情况下(10mg/kg/d，静脉注射)，也无明显的毒副作用产生。(5)可诱导对放化疗不敏感的细胞发生凋亡。在放化疗过程中，起关键作用的一个抗癌基因是p53，但由于一些恶变细胞的p53基因发生突变或缺失，致使它们对放化疗不敏感。而hsApo-2L杀伤细胞并不依赖p53，因此仍可诱导这些细胞发生凋亡。(6)与放化疗药物之间具有明显的协同作用，hsApo-2L的使用可明显降低放化疗药物的用量。
综上所述，hsApo-2L有望成为一种新的抗肿瘤药物，但目前尚没有一种有效的方法获得大量纯品。为方便利用镍离子柱进行亲和层析，本发明在hsApo-2L的N端添加了6个组氨酸，构建成了重组人可溶性凋亡素2配体(rhsApo-2L)，并在大肠杆菌中进行表达，建立了纯化工艺。
本发明的目的在于提供一种重组人可溶性凋亡素2配体(rhsApo-2L)的构建及纯化工艺，以便进一步将rhsApo-2L开发成为低毒高效的抗肿瘤药物。
本发明采用下述技术方案(1)分离健康汉族男性外周血淋巴细胞，提取其总RNA，通过反转录PCR(RT-PCR)获得hsApo-2L的cDNA。将目的DNA序列插入克隆载体pGEM-T Vector，构建成重组质粒pGEM-sApo2L。测序结果显示，目的cDNA的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列与实验设计完全一致。再将sApo-2L的cDNA由pGEM-sApo2L亚克隆入原核表达载体pQE-30，构建成高效重组表达质粒pQE30-sApo2L。并将重组质粒转入大肠杆菌M15(pREP4)，构建成高效表达rhsApo-2L的工程菌株M15(pREP4)/pQE-sApo2L。rhsApo2L的核苷酸序列和氨基酸序列见附录。
(2)利用LB培养液发酵工程菌，经IPTG诱导，rhsApo-2L以可溶性和包涵体两种形式表达，其中可溶性表达产物占超声上清蛋白总量的20％以上。为避开包涵体复杂的变性复性过程，本发明选择可溶性部分进行纯化。含rhsApo-2L的超声上清经镍离子柱和G25凝胶排阻层析两步纯化，即得到纯度达95％以上的rhsApo-2L纯品。经Hela(人宫颈癌)细胞检测，纯化的rhsApo-2L在浓度为50ng/ml时可引起50％的细胞发生凋亡，该作用浓度与文献报道的hsApo-2L的作用浓度一致。
本发明运用重组DNA技术，在大肠杆菌中表达了rhsApo2L，且表达产物以高活性可溶性形式存在。下游纯化方式简便，收率高，达到临床用药的质量要求。纯品经Hela细胞检测，其活性水平与hsApo-2L一致。
本发明用下述实例进行说明实施例1hsApo-2L cDNA的克隆及重组表达载体的构建根据文献报道的hApo-2L cDNA序列，设计上下游引物如下上游引物P15’》CGGGATCCGTG AGA GAA AGA GGT CCT C《3’BamHI下游引物P25’》GGGGTACCAGG TCA GTT AGC CAA CT《3’KpnI为获得代表中国人特征的hsApo-2L基因，本研究从汉族健康男性志愿者中抽取静脉血，分离淋巴细胞，用RPMI1640、5％小牛血清培养，并加入本公司生产的干扰素α-1b至终浓度为200U/ml，置CO2培养箱中孵育18小时。收集细胞，用Gibco公司的Trizol试剂提取总RNA。用Promega公司的M-MLV反转录试剂盒进行反转录。以反转录产物为模板，P1、P2为引物进行PCR，PCR循环条件为95℃，2分钟→(95℃，40秒→56℃，1分钟→72℃，1分钟)×30个循环→72℃，10分钟→4℃。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离，回收0.52kb片段，与Promega公司的pGEM-T Vector连接，构建成重组质粒pGEM-sApo2L。测序结果显示，目的基因序列与实验设计完全一致。然后用BamH I/KpnI双酶切重组质粒pGEM-sApo2L，回收酶切产物中的0.52kb片段，与经同样酶切处理的原核表达载体pQE-30连接，构建成重组表达质粒pQE30-sApo2L。然后将重组质粒转化大肠杆菌M15(pREP4)，构建成高效表达rhsApo-2L的工程菌株M15(pREP4)/pQE-sApo2L。
实施例2rhsApo-2L的表达及纯化工程菌株M15(pREP4)/pQE-sApo2L经LB液体培养基(含氨苄青霉素100ug/ml、卡那霉素25ug/ml，下同)过夜活化，100倍放大培养，37℃培养至对数生长期，迅速将温度降至30℃，加入IPTG至终浓度为0.1mM，诱导表达4小时。收集菌体，用20mM磷酸盐缓冲液(PH8.0)，洗涤一次，每克湿菌体加入20ml溶液A(50mMNaH2PO4·300mM NaCl·10mM imidazole·PH8.0)，超声破碎。离心后收集超声上清，上经溶液A预平衡的镍离子柱，然后用溶液B(50mM NaH2PO4·300mM NaCl·20mM imidazole·PH8.0)冲洗杂蛋白，溶液C(50mM NaH2PO4·300mM NaCl·200mM imidazole·PH8.0)洗脱目的蛋白。然后将洗脱组分上G25凝胶排阻层析柱，脱去NaCl及imidazole，将缓冲液换成50mM PB(PH8.0)，即得到rhsApo-2L的纯品。附录一种重组人可溶性凋亡素2配体(rhsApo-2L)的核苷酸序列和氨基酸序列<110>北京三元基因工程有限公司<120>一种重组人可溶性凋亡素2配体的构建与纯化工艺<160>2<210>1<211>543<212>DNA<213>人工序列<220><223>在人可溶性凋亡素2配体cDNA的5’端添加了36个碱基，其中包括1个蛋氨酸的密码子和6个组氨酸的密码子。<400>1atgagaggat cgcatcatca tcatcatcat ggatccgtga gagaaagagg tcctcagaga 60gtagcagctc acataactgg gaccagagga agaagcaaca cattgtcttc tccaaactcc 120aagaatgaaa aggctctggg ccgcaaaata aactcctggg aatcatcaag gagtgggcat 180tcattcctga gcaacttgca cttgaggaat ggtgaactgg tcatccatga aaaagggttt 240tactacatct attcccaaac atactttcga tttcaggagg aaataaaaga aaacacaaag 300aacgacaaac aaatggtcca atatatttac aaatacacaa gttatcctga ccctatattg 360ttgatgaaaa gtgctagaaa tagttgttgg tctaaagatg cagaatatgg actctattcc 420atctatcaag ggggaatatt tgagcttaag gaaaatgaca gaatttttgt ttctgtaaca 480aatgagcact tgatagacat ggaccatgaa gccagttttt tcggggcctt tttagttggc 540taa 543<210>2<211>180<212>PRT<213>人工序列<220><223>在人可溶性凋亡素2配体分子的N端添加了12个氨基酸，其中包括1个蛋氨酸和6个组氨酸。<400>2Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Val Arg Glu1 5 10 15Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly
20 25 30Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala35 40 45Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His50 55 60Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile65 70 75His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg80 85 90Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met95 100 105Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu110 115 120Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu125 130 135Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys140 145 150Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile155 160 165Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly170 175 180
权利要求
1.一种重组人可溶性凋亡素2配体(rhsApo-2L)的构建与纯化工艺，其特征在于(1)PCR扩增引物设计如下N端引物5’》CGGGATCCGTG AGA GAA AGA GGT CCTC《3’BamHIC端引物5’》GGGGTACCAGG TCA GTT AGC CAA CT《3’KpnI(2)由上述引物PCR扩增的cDNA与原核表达载体pQE30组装成高效重组表达质粒；(3)上述重组表达质粒转化大肠杆菌M15(pREP4)，用IPTG诱导表达，表达产物以可溶性形式存在工程菌内；(4)上述工程菌发酵后破碎菌体，收集上清，采用镍离子亲和层析和凝胶排阻层析两步法纯化产品。
全文摘要
本发明涉及一种重组人可溶性凋亡素2配体(rhsApo－2L)的制备方法。rhsApo－2L与hsApo－2L相比，其分子N端多了12个氨基酸，其中包括6个组氨酸，以方便利用镍离子柱进行纯化。本发明利用RT－PCR技术，扩增得到hsApo－2L基因，并将之与原核表达载体pQE－30相连，构建成重组表达质粒，然后转化大肠杆菌M15(pREP4)。重组子经IPTG诱导，rhsApo－2L以可溶性形式表达，表达量占超声上清蛋白总量的20％以上。表达产物经镍离子柱和凝胶排阻层析两步纯化，纯度达95％以上，生物活性与hsApo－2L一致。
文档编号C12N15/09GK1428425SQ01144948
公开日2003年7月9日 申请日期2001年12月25日 优先权日2001年12月25日
发明者刘永全, 刘红燕, 牛晓霞 申请人:北京三元基因工程有限公司