专利名称：一株产酸性β－甘露聚糖酶的黑曲霉及其发酵和生产甘露寡糖的方法
技术领域：
本发明涉及一株黑曲霉，该黑曲霉的发酵方法以及用其发酵产物生产甘露寡糖的方法，特别是涉及一株产酸性β-甘露聚糖酶的黑曲霉，该黑曲霉的发酵方法以及用其发酵产物生产甘露寡糖的方法。制备的甘露聚糖酶和甘露寡糖用作饲料和食品添加剂。
国内外对β-甘露聚糖酶及甘露寡糖的研究已有几十年的历史，但一直到1985年以后，随着酶和寡糖应用领域的开发，相关研究竞争显著加剧。最新研究涉及酶的产生、纯化与特性研究、基因克隆与重组表达以及甘露寡糖的酶法生产等方面。标志性进展有1987年日本理化研究所对产生碱性β-甘露聚糖酶的芽胞杆菌AM-001所进行的研究，通过多种方法选育，酶活力由36u/ml提高到了430u/ml。1995年，美国ChemGen公司研制了一种碱性β-甘露聚糖酶，其菌种Bacillus lentus的产酶能力达400u/ml，随后开发用作饲料添加剂，是目前美国销量最大的饲料用酶。
国内对β-甘露聚糖酶和甘露寡糖生产技术的研究处于国际先进水平。中国科学院微生物研究所马延和等(微生物学报，1991，31(6)443-448；微生物学通报，1992，19(1)13-17)较早提出利用碱性β-甘露聚糖酶生产甘露寡糖的方法。利用嗜碱芽孢杆菌N16-5以魔芋粉为原料，发酵生产β-甘露聚糖酶，发酵液的酶活力达到500u/ml，甘露寡糖后提取收率80％以上。制备的甘露寡糖用作保健食品和饲料添加剂。
国内外对耐高温、酸性和中性β-甘露聚糖酶的研究也有不少努力，如杨文博等(微生物学通报，1995，22(3)154-157)研究了产β-甘露聚糖酶地衣芽孢杆菌的分离筛选及发酵条件。崔福绵等(微生物学报，1999，39(1)60-63)报道了枯草芽孢杆菌中性β-甘露聚糖酶的产生及性质。张峻等(食品与发酵工业，2001，27(2)5-7)研究地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的制备。但所筛选菌种产生的酸性和中性β-甘露聚糖酶酶活力均较低，最高产酶活力仅在120u/ml左右。
β-甘露聚糖酶重组研究的进展不快。Mendoza-N-S(1995)将克隆自Bacillus subtilisNM-39的β-甘露葡聚糖酶基因转入大肠杆菌PH5a表达。酶活力仅为4.9u/ml(Biochim.Biophys.Acta-G；1243(3)552-554)。Stalbrand-H(1995)利用Tricho dermareesei克隆的β-甘露葡聚糖酶基因在酿酒酵母中表达，酶活力也不高(Appl.Environ.Microbiol.61(3)1090-1097)。Tang-C-M等(2001)用毕赤酵母表达来源于Agaricus bisporus strain C54-carb8的甘露聚糖酶基因cel4，表达量提高了3倍，值得进一步研究(Appl.Environ.Microbiol.67(5)2298-2303)。
酶法分解制备甘露寡糖，一直是β-甘露聚糖酶应用研究的重点内容。微生物来源的β-甘露聚糖酶及甘露寡糖在我国虽然已被批准作饲料添加剂使用，但由于酶产率低，生产成本高，至今仍未有适用于甘露寡糖大量生产的产品，β-甘露聚糖酶最高对甘露寡糖的转化率也只有29％。美国奥特奇公司销售从饲料酵母中提取的甘露寡糖，寡糖含量65％，售价56元/公斤，成本偏高。中科院微生物所用碱性β-甘露聚糖酶酶解魔芋制备甘露寡糖，较大幅度降低了成本。国内外关于微生物来源的β-甘露聚糖酶及甘露寡糖研究和生产方面已申请的相关专利有6个，都是关于碱性β-甘露聚糖酶的，国外5个专利的产酶活力在36-400u/ml，国内马延和等1999年所申请专利中，所生产的酶活力为500u/ml，菌种为专性嗜碱芽孢杆菌，最适pH为10。
本发明提供的黑曲霉为黑曲霉(Aspergillus niger)AS2710 CGMCC №0658及其突变体或变异体。
黑曲霉(Aspergillus niger)AS2710，已于2001年12月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC№0658。
本发明的黑曲霉从田箐种子分离得到，种子培养基可用PDA或Czapek’s培养基，在麸皮培养基及麸皮—豆粕(1∶0.1-0.4，加水1∶1)培养基上生长良好。最适生长温度为25-28℃。该黑曲霉在麸皮豆粕培养基上，生长初期1-3天菌丝为白色，后形成黑色孢子。
黑曲霉AS2710能分泌酸性β-甘露聚糖酶。β-甘露聚糖酶的耐热性能好，工作温度范围是30-85℃，最适反应温度70℃；反应pH2-9.2，最适pH3.0-3.8；酶活力在摇瓶条件下达到150u/ml，符合饲料用酶条件，是国内外最高水平。
本发明的另一个目的是提供用黑曲霉AS2710发酵生产β-甘露聚糖酶的方法。
一种用权利要求1所述黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤(一)制备发酵菌种将斜面培养的黑曲霉(Aspergillus niger)AS2710经液体菌种培养和一级液体培养以及至少二级液体培养后，得到发酵菌种；(二)利用上述得到的菌种发酵生产酸性β-甘露聚糖酶。
所述(一)制备发酵菌种的具体过程是1)斜面菌种使用总含糖量10-20％的麦芽汁培养基，加2％琼脂，划线接种，在30-35℃条件下，摇床培养20-24小时，4℃冰箱中保存3个月内；2)液体菌种和一级液体培养使用总含糖量10-20％的麦芽汁培养基，种子液的接种量分别为5-20％，在30-35℃摇床培养20-24小时，或在30-35℃条件下，静止培养24-48小时。
3)二级液体培养使用含糖量10-20％淀粉水解糖化液，接种量分别为5-20％，在30-35℃摇床培养20-24小时，或在30-35℃条件下，静止培养24-48小时。
所述(二)利用得到的菌种发酵生产酸性β-甘露聚糖酶可以采用液体发酵方法生产，也可以采用固体发酵方法生产。当用液体方法生产时，使用的发酵培养基配方以重量份数计包括魔芋精粉或田箐胶30-85份、麦芽根粉5-10份、麸皮5-30份、玉米芯0-30份、豆粕0-10份、尿素或硫酸铵0-0.5份；原料∶水＝1∶1.5-10，菌种的接种量为5-30％，15-40℃的条件下，静止培养1-10天；或在25-40℃下通气培养，使pO2＝30％，pH＝5-7；过滤发酵液得到酸性β-甘露聚糖酶；所述液体发酵培养基中的玉米芯、豆粕、尿素或硫酸铵分别为10-25份、2-8份、0.1-0.4份。当采用固体发酵方法生产时，使用的发酵培养基配方以重量份数计包括魔芋精粉或田箐胶30-85份、麦芽根粉5-10份、麸皮5-30份、玉米芯0-30份、豆粕0-10份、尿素或硫酸铵0-0.5份；原料∶水＝1∶0.5-1.5。发酵成熟后用于制备β-甘露聚糖酶；固体发酵产物加2-6倍水浸泡后过滤得到酸性β-甘露聚糖酶；所述固体发酵培养基中的玉米芯、豆粕、尿素或硫酸铵分别为10-25份、2-8份、0.1-0.4份。
本发明的又一目的是提供一种利用本发明的黑曲霉生产甘露寡糖的方法。
利用黑曲霉(Aspergillus niger)AS2710所产的酸性β-甘露聚糖酶制备甘露寡糖的方法，是用酸性β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖。
所述甘露聚糖为魔芋精粉或/和田箐胶。
本发明利用高细胞密度液体发酵技术和固体发酵技术制备新型酸性β-甘露聚糖酶，缩短了发酵周期和甘露聚糖酶产量高峰出现的时间，使菌株产酶高峰在60hr即已经出现，降低了生产成本，使甘露聚糖酶和甘露寡糖在饲料和食品工业中的进一步广泛应用成为可能。由于本发明菌株产酶发酵可采用固体培养法，生产设备和原料成本低，酶产量高，不易污染杂菌，产品成本比90年代研究的最好水平低50％以上。
从社会和生态效益方面来看，饲料原料特别是饼粕中抗营养的甘露聚糖是饲料利用率低，粪便氮磷排泄量大，土地和水域富营养化污染的最主要原因。应用β-甘露聚糖酶可大大提高畜禽和鱼类对饲料的利用效率，节约饲料粮，提高生产性能，减少污染及治理污染的成本，意义显著。
我国拥有丰富的甘露聚糖植物原料特色资源。甘露聚糖在田箐、魔芋中有如淀粉样的大量积累，是制备甘露寡糖的优良原料。本发明可促进农产品加工、轻工、化工等多个行业的技术进步，经济效益、社会效益和行业影响非常显著。
本发明的酸性β-甘露聚糖酶一方面可直接用作饲料添加剂，一方面可用来制备甘露寡糖，能够大大提高生产规模和经济效益。本发明建立了酶法生产甘露寡糖的技术平台，利用高效酶转化技术，提高转化效率，用色谱分离、膜分离等后提取精制技术，提高酶和寡糖的产率和纯度，大力推进甘露寡糖的产业化研究。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
3)二级液体培养使用含糖量15％的淀粉水解糖化液300ml，接种量为60ml，在33条件下摇床培养20-24小时，或在33条件下，静止培养24-48小时。即制成发酵菌种。
实施例2.利用液体发酵方法生产β-甘露聚糖酶使用的发酵培养基配方以重量份数计为魔芋精粉79.5份、麦芽根粉10份、麸皮5份、豆粕5份、尿素0.5份；原料∶水＝1∶6，菌种的接种量为30％，35的条件下通气培养，使pO2＝30％，pH＝6.5。每隔24小时检测酶活，达产酶高峰时终止发酵，产物经过滤制备成酸性β-甘露聚糖酶。
酶活力测定方法参照Akino(Appl.Microbiol.Biotechnol.1987，26323-327)的方法测定以0.5ml，0.5％(W/V)槐豆胶(Locust bean gam)作底粉，用pH10，0.05mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液加入0.1ml稀释酶液，70保温10分钟，用二硝基水杨酸试剂测产生的还原糖，1个酶活力单位定义为上述反应条件下，一分钟释放1mmol相当于D-甘露糖的还原糖的酶量，结果如表1所示。
表1酸性β-甘露聚糖酶产量为
β-甘露聚糖酶的产量在培养的前2天快速增加，第2天达到产酶高峰。第3天开始缓慢降低。
实施例3.利用固体发酵方法生产β-甘露聚糖酶使用的发酵培养基配方以重量份数计为田箐胶70份、麦芽根粉10份、麸皮19.5份、硫酸铵0.5份；原料∶水＝1∶1。每隔12小时检测酶活，达产酶高峰时终止发酵，产物加4倍水浸泡后过滤得到酸性β-甘露聚糖酶，结果如表2所示。固体发酵方式的产酶量低于高密度液体方式。
表2酸性β-甘露聚糖酶产量为
β-甘露聚糖酶的产量在培养的前三天快速增加，5天后减少。
实施例4.酸性β-甘露聚糖酶的制备液体发酵的发酵液直接过滤，固体发酵产物加2-6倍水浸泡后过滤。采用板框压滤，滤液加硅藻土作为助滤剂，过滤压力在0-5kg/cm2之间。滤液加硫酸铵至饱和，4静置24小时，离心制备粗酶制品。高密度液体发酵酶产量为0.2-1.0％(w/v)，固体发酵酶产量为0.1-0.5％。得到的酸性β-甘露聚糖酶可用于制作饲用、医用、和工业用酶制剂。
实施例5.酶解制备甘露寡糖魔芋精粉加水4倍，加热煮沸使粉充分溶解，冷却至40，加入8％的酸性β-甘露聚糖酶粗酶制品，搅拌均匀，反应10-48小时，胶体完全消化成液体后，取样检测糖组成。寡糖占总糖80％以上后终止反应。干燥制成甘露寡糖。所制寡糖用作饲料和食品添加剂、农药等。
实施例6.酶解制备甘露寡糖田箐胶加水8倍，加热煮沸使胶充分溶解，冷却至60，加入2％(0.5-10％)的酸性β-甘露聚糖酶粗酶制品，搅拌均匀，反应10-48小时，胶体完全消化成液体后，取样检测糖组成。寡糖占总糖80％以上后终止反应。干燥制成甘露寡糖。所制寡糖用作饲料和食品添加剂、农药等。
权利要求
1.黑曲霉(Aspergillus niger)AS2710 CGMCC №0658及其突变体或变异体。
2.一种用权利要求1所述黑曲霉发酵生产β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步骤(一)制备发酵菌种将斜面培养的黑曲霉(Aspergillus niger)AS2710经液体菌种培养和一级液体培养以及至少二级液体培养后，得到发酵菌种；(二)利用上述得到的菌种发酵生产酸性β-甘露聚糖酶。
3.根据权利要求2所述的发酵工艺，其特征在于所述(一)制备发酵菌种的具体过程是1)斜面菌种使用总含糖量10-20％的麦芽汁培养基，加2％琼脂，划线接种，在30-35℃条件下，摇床培养20-24小时，4℃冰箱中保存3个月内；2)液体菌种和一级液体培养使用总含糖量10-20％的麦芽汁培养基，种子液的接种量分别为5-20％，在30-35℃摇床培养20-24小时，或在30-35℃条件下，静止培养24-48小时。3)二级液体培养使用含糖量10-20％淀粉水解糖化液，接种量分别为5-20％，在30-35℃摇床培养20-24小时，或在30-35℃条件下，静止培养24-48小时。
4.根据权利要求2所述的发酵工艺，其特征在于所述(二)利用得到的菌种发酵生产酸性β-甘露聚糖酶是采用液体发酵方法生产，使用的发酵培养基配方以重量份数计包括魔芋精粉或田箐胶30-85份、麦芽根粉5-10份、麸皮5-30份、玉米芯0-30份、豆粕0-10份、尿素或硫酸铵0-0.5份；原料∶水＝1∶1.5-10，菌种的接种量为5-30％，15-40℃的条件下，静止培养1-10天；或在25-40℃下通气培养，使pO2＝30％，pH＝5-7；过滤发酵液得到酸性β-甘露聚糖酶。
5.根据权利要求4所述的发酵工艺，其特征在于所述液体发酵培养基中的玉米芯、豆粕、尿素或硫酸铵分别为10-25份、2-8份、0.1-0.4份。
6.根据权利要求2所述的发酵工艺，其特征在于所述(二)利用得到的菌种发酵生产酸性β-甘露聚糖酶是采用固体发酵方法生产，使用的发酵培养基配方以重量份数计包括魔芋精粉或田箐胶30-85份、麦芽根粉5-10份、麸皮5-30份、玉米芯0-30份、豆粕0-10份、尿素或硫酸铵0-0.5份、它料；原料∶水＝1∶0.5-1.5。发酵成熟后用于制备β-甘露聚糖酶；固体发酵产物加2-6倍水浸泡后过滤得到酸性β-甘露聚糖酶。
7.根据权利要求6所述的发酵工艺，其特征在于所述固体发酵培养基中的玉米芯、豆粕、尿素或硫酸铵分别为10-25份、2-8份、0.1-0.4份。
8.利用权利要求1所述黑曲霉发酵得到的β-甘露聚糖酶制备甘露寡糖的方法，是用酸性β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述甘露聚糖为魔芋精粉或/和田箐胶。
10.用权利要求2的方法得到的β-甘露聚糖酶及用权利要求8的方法得到的甘露寡糖在饲料和食品添加剂中的应用。
全文摘要
本发明的名称为一株产酸性β－甘露聚糖酶的黑曲霉及其发酵和生产甘露寡糖的方法。本发明的目的是提供一株能分泌酸性β－甘露聚糖酶的黑曲霉。本发明提供的黑曲霉为黑曲霉(Aspergillus niger)AS2710 CGMCC №0658及其突变体或变异体。黑曲霉AS2710的发酵工艺，包括以下步骤(一)制备发酵菌种将斜面培养的黑曲霉(Aspergillus niger)AS2710经液体菌种培养和一级液体培养以及至少二级液体培养后，得到发酵菌种；(二)利用上述得到的菌种发酵生产酸性β－甘露聚糖酶。利用本发明菌株生产酸性β－甘露聚糖酶，生产设备和原料成本低，酶产量高，不易污染杂菌，产品成本比90年代研究的最好水平低50％以上。
文档编号C12N1/14GK1428415SQ0114478
公开日2003年7月9日 申请日期2001年12月25日 优先权日2001年12月25日
发明者丁宏标, 马延和, 张木 申请人:北京锐思嘉业饲料应用技术研究中心