专利名称：用固定化酯制备手性二氯菊酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种二氯菊酸的制备方法，具体地说，涉及一种用固定化酯酶制造手性R(+)-trans-二氯菊酸的方法。
目前，虽然化学拆分法可以制造手性R(+)-trans-二氯菊酸，但是需要使用价格很高的光学活性试剂，而且工艺流程比较繁杂。由手性催化剂催化环丙烷化反应虽然可以得到R(+)-trans-二氯菊酸，但尚难达到很高的光学纯度。因此研究开发方便经济的生物催化剂拆分法制造R(+)-trans-二氯菊酸也成为一个重要途径。
关于用生物催化剂动力学拆分方法制备手性R(+)-trans-二氯菊酸的报道有1、猪肝酯酶拆分法(M.Schneider et al.，Angew.Chem.Int.Ed.Eg.，2364(1984))。
2、球形节杆菌(Arthobacter globiformis)及其酯酶拆分方法(光田贤等， (日)特开昭60-244296(1985)，63-251099(1988))。
3、中国发明专利(邵昌平等，001 10029.7，(2000))。
上述文献中，猪肝酯酶拆分法，使用活力高的酶，得到了R(+)-trans-二氯菊酸的光学纯度达90％，但是，猪肝酯酶价格偏高，供生产使用有一定的限制，需通过酶固定化来解决。
球形节秆菌酯酶拆分法，水解率18.0％时，R(+)-trans-二氯菊酸的光学纯度可达＝88.9％，但是，此菌种难以得到，而且未经诱变或基因工程改造的菌株，活力比较低。
关于用固定化酯酶动力学拆分方法制备手性R(+)-trans-二氯菊酸未见有文献报道。
为实现上述目的，本发明提供的固定化酯酶制备手性二氯菊酸的方法，以消旋的二氯菊酸酯为原料，其结构式如下
式中，R为C1-C4烷基或孟基，其顺式与反式比例在10-90/90-10范围内；其制备步骤如下(除有特殊说明外，本发明提到的浓度均为重量百分浓度)1)制备固定化酯酶由酯酶共价结合到双功能基活化的固体载体上；其中，酯酶(EC.3.1.1.1)由新鲜的哺乳动物的肝脏或细菌以及酵母中提取，活力不低于0.1U/mg，；双功能基活化试剂包括双醛、双醚、双酚、双酸或双环氧等；固体载体包括硅胶、氧化铝、有机树脂或天然多糖等；2)将消旋的二氯菊酸酯、非离子表面型表面活性剂和固定化酯酶加入到pH＝3-11的缓冲溶液中，搅拌或振荡下进行催化水解反应，并通过加碱保持其pH值，其pH值优选6-8；其中，消旋的二氯菊酸酯在反应溶液中浓度为0.1-40％，优选1-10％；固定化酯酶用量在5-500U/g消旋的二氯菊酸酯，优选30-200U/g；非离子型表面活性剂包括蓖麻油聚氧乙烯、脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、失水梨糖脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯或蔗糖脂肪酸酯，其浓度范围为0.001-0.2％，优选0.01-0.1％。；缓冲液为无机盐缓冲溶液，如磷酸盐、碳酸盐或硼酸盐等缓冲溶液。
缓冲液也可以用有机盐缓冲溶液，如甘氨酸-氢氧化钠、巴比妥钠-盐酸或Tris-盐酸等缓冲溶液；水解反应温度为20-70℃，优选为30-60℃；水解反应时间为6-96小时，优选8-72小时。
3)将固定化酯酶与反应液分离，固定化酯酶用缓冲液冲洗后保存备用，反应液用浓盐酸酸化后，用有机溶剂萃取；4)有机相用碱水皂化，使反应生成的二氯菊酸进入水相，再用浓盐酸酸化，析出结晶。
本发明制备的固定化酯酶，具有一定的柔韧性，基本上保持了游离的空间选择性。它还具有很好的稳定性，可以反复使用，解决了酯酶在生产成本中所占比例过高的问题，使之能在工业化生产。
本发明用共价结合的固定化酯酶，水解消旋的二氯菊酸酯，通过动力学拆分，得到光学纯度90％左右的R(+)-trans-二氯菊酸。此固定化酯酶与游离酯酶相比，其活性和对映体选择性及非对映体选择性皆相差不多。特别重要的是，此固定化酯酶稳定性好，可以回收使用，至少循环使用10次以上，解决了游离酯酶只能使用1次的问题，使价格高的游离酯酶，通过共价结合固定化，可以实现在工业上反复使用，显著地降低酯酶在手性二氯菊酸生产成本中所占的分额。
反应液用浓盐酸酸化后，用4-甲基-2-戊酮萃取(10ml，2次)，再向萃取液中加入等体积的1N NaOH水溶液，振荡分相，使水解反应生成的手性二氯菊酸形成钠盐进入水相。水相再用浓盐酸酸化，静置，使手性二氯菊酸逐渐结晶析出。结晶用蒸馏水淋洗，干燥，得手性二氯菊酸97mg，产率10.40％，为理论产率(23.90％)的43.52％。手性二氯菊酸的四个异构体的组成比例用气相色谱法测定(-环糊精手性毛细管柱(30m)分离，氢火焰鉴定器)。取手性二氯菊酸样品50mg，加入等克分子的氯化亚砜，吡啶和(-)-孟醇的甲苯溶液，于110℃回流1小时，进行衍生化后，测定其四个异构体的组成比例为S(-)-cis＝0.07％，R(+)-cis＝0.07％，S(-)-trans＝11.04％，R(+)-trans＝88.82％。
离心分离回收的固定化酯酶用0.1MNaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH＝8)洗3次，置于冰箱中保存，留待下一次循环使用。
实施例2取固定化猪肝酯酶(由自制的游离猪肝酯酶10000U/g，共价结合固定化于戊二醛活化的天然氨基多糖上得到，活力回收为40.0％，湿的固定化酶的单位活力为10.4U/g)，按实施例1同样的方法和条件进行水解反应和分析测定，得手性二氯菊酸93mg，产率为9.98％，为理论产率的41.74％。测定其四个异构体的组成比例为S(-)-cis＝0.02％，R(+)-cis＝0.02％，S(-)-trans＝9.77％，R(+)-trans＝90.19％。
实施例3将实施例1回收保存的固定化猪肝酯酶，按实施例1同样的方法和条件进行水解反应和分析测定，分离回收固定化酯酶，循环使用10次以上，第11次反应，得手性二氯菊酸89mg，产率为9.55％，为理论产率的39.95％。其四个异构体的组成比例为S(-)-cis＝0.17％，R(+)-cis＝0.27，S(-)-trans＝13.47％，R(+)-trans＝86.11％。
实施例4取固定化猪肝酯酶(由自制的游离猪肝酯酶(10000U/g)，共价结合固定化于戊二醛活化的天然氨基多糖上得到，活力回收为87.0％，湿的固定化酶的单位活力为27.35U/g)，按实施例1和实施例3同样的方法和条件进行水解反应和分析测定。第1次反应，得手性二氯菊酸104mg，产率为11.16％，为理论产率的46.69％。其四个异构体的组成比例为S(-)-cis＝0.16％，R(+)-cis＝0.14％，S(-)-trans＝12.06％，R(+)-trans＝87.64％。第10次反应，得手性二氯菊酸64mg，产率为6.87％，为理论产率的28.73％。其四个异构体的组成比例为S(-)-cis＝0.16％，R(+)-cis＝0.09％，S(-)-trans＝16.63％，R(+)-trans＝83.12％。循环使用10次以后，固定化猪肝酯酶的活力降低约1/3，对映体选择性降低约1/4。
实施例5取上述固定化猪肝酯酶50U，非离子表面活性剂用Span 80，取50mg，按实施例1同样的方法和条件进行水解反应和分析测定。得手性二氯菊酸77mg，产率为8.39％，为理论产率的35.06％。其四个异构体的组成比例为S(-)-cis＝2.19％，R(+)-cis＝2.53％，S(-)-trans＝12.20％，R(+)-trans＝83.07％。
实施例6取假丝酵母(Candida lipolytica)酯酶(Fluka Co.出品)100U，按实施例1同样的方法和条件进行固定化，得固定化酯酶，其活力回收为98％，湿的固定化酶的单位活力为36.06U/g。取此固定化酯酶50U，按实施例1同样的方法和条件进行水解反应和分析测定。得手性二氯菊酸62mg，产率为6.74％，为理论产率的28.22％。其四个异构体的组成比例为S(-)-cis＝0.20％，R(+)-cis＝0.25％，S(-)-trans＝13.20％，R(+)-trans＝86.36％。
实施例7取双环氧辛烷(1，2，5，6-Diepoxyoctane，97％，Fisher Scientific出品)作为双功能基话化剂，按实施例1同样的方法和条件进行固定化，得固定化酯酶，其活力回收为69％，湿的固定化酶的单位活力为16.2U/g。取此固定化酯酶50U，按实施例1同样的方法和条件进行水解反应和分析测定。得手性二氯菊酸68mg，产率为7.40％，为理论产率的30.96％。其四个异构体的组成比例为S(-)-cis＝0.16％，R(+)-cis＝0.14％，S(-)-trans＝12.06％，R(+)-trans＝87.64％。
比较例1取自制的游离猪肝酯酶(10000U/g)50U，按实施例1同样的方法和条件进行水解反应和分析测定，得手性二二氯菊酸121mg，产率为12.98％，为理论产率的54.31％。测定其四个异构体的组成比例为S(-)-cis＝0.25％，R(+)-cis＝0.18％，S(-)-trans＝7.45％，R(+)-trans＝92.13％。
比较例2取固定化猪肝酯酶(由自制的游离猪肝酯酶(10000U/g)共价结合固定化于戊二醛活化的硅胶上得到，活力回收为36.9％，湿的固定化酶的单位活力为17.5U/g)60U，按实施例1和实施例3的同样的方法和条件进行水解反应和分析测定，得手性二氯菊酸59mg，产率为6.33％，为理论产率的26.48％。测定其四个异构体的组成比例为S(-)-cis＝0.12％，R(+)-cis＝0％，S(-)-trans＝8.79％，R(+)-trans＝91.09％。此固定化猪肝酯酶第3次循环水解反应，得手性二氯菊酸28mg，产率为3.04％，为理论产率的12.59％。测定其四个异构体的组成比为S(-)-cis＝0.16％，R(+)-cis＝0.06％，S(-)-trans＝11.24％，R(+)-trans＝88.59％。第4次循环水解反应，仅得手性二氯菊酸5mg，表明此固定化猪肝酯酶酶的流失很严重。
权利要求
1.一种固定化酯酶制备手性二氯菊酸的方法，以消旋的二氯菊酸酯为原料，其结构式如下 式中，R为C1-C4烷基或孟基，其顺式与反式比例在10-90/90-10范围内；其制备步骤如下1)制备固定化酯酶由酯酶共价结合到双功能基活化的固体载体上其中，酯酶(EC.3.1.1.1)由新鲜的哺乳动物的肝脏或细菌以及酵母中提取，活力不低于0.1U/mg；双功能基活化试剂为双醛、双醚、双酚、双酸或双环氧；固体载体为硅胶、氧化铝、有机树脂或天然多糖；2)将消旋的二氯菊酸酯、非离子表面型表面活性剂和固定化酯酶加入到pH＝3-11的缓冲溶液中，搅拌或振荡下进行催化水解反应，并通过加碱保持其pH值；水解反应温度为20-70℃，反应时间为6-96小时；其中，消旋的二氯菊酸酯在反应溶液中浓度为0.1-40％；固定化酯酶用量在5-500U/g消旋的二氯菊酸酯；非离子型表面活性剂为蓖麻油聚氧乙烯、脂肪醇聚氧乙烯醚、壬基酚聚氧乙烯醚、失水梨糖脂肪酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯或蔗糖脂肪酸酯，其浓度范围为0.001-0.2％；缓冲液为无机盐或有机盐缓冲溶液；3)将固定化酯酶与反应液分离，固定化酯酶用缓冲液冲洗后保存备用，反应液用浓盐酸酸化后，用有机溶剂萃取；4)有机相用碱水皂化，使反应生成的二氯菊酸进入水相，再用浓盐酸酸化，析出结晶。
2.如权利要求1所述的固定化酶制备手性二氯菊酸的方法，其特征在于，所述消旋的二氯菊酸酯浓度为1-10％。
3.如权利要求1所述的固定化酶制备手性二氯菊酸的方法，其特征在于，所述固定化酯酶用量为30-200U/g底物。
4.如权利要求1所述的固定化酶制备手性二氯菊酸的方法，其特征在于，所述非离子型表面活性剂浓度为0.01-0.1％。
5.如权利要求1所述的固定化酶制备手性二氯菊酸的方法，其特征在于，所述反应溶液pH＝6-8。
6.如权利要求1所述的固定化酶制备手性二氯菊酸的方法，其特征在于，所述水解反应温度为30-60℃，水解反应时间为8-72小时。
7.如权利要求1所述的固定化酶制备手性二氯菊酸的方法，其特征在于，所述无机盐缓冲溶液为磷酸盐、碳酸盐或硼酸盐组冲溶液。
8.如权利要求1所述的固定化酶制备手性二氯菊酸的方法，其特征在于，所述有机盐缓冲溶液为甘氨酸-氢氧化钠、巴比妥钠-盐酸或Tris-盐酸缓冲溶液。
全文摘要
一种固定化酯酶制备手性二氯菊酸的方法，由酯酶共价结合到双功能基活化的固体载体上，将消旋的二氯菊酸酯、非离子表面型表面活性剂和固定化酯酶加入到缓冲溶液中进行催化水解反应，将固定化酯酶与反应液分离，固定化酯酶用缓冲液冲洗后保存备用，反应液用浓盐酸酸化后，用有机溶剂萃取；有机相用碱水皂化，使反应生成的二氯菊酸进入水相，再用浓盐酸酸化，析出结晶。该方法明显地提高了酶反应速度和对手性二氯菊酸的选择。制备的固定化酯酶可以反复使用。
文档编号C12P7/40GK1427080SQ01144909
公开日2003年7月2日 申请日期2001年12月21日 优先权日2001年12月21日
发明者邵昌平, 刘韧, 白长敏, 潘桂枝, 韩梅, 郑卓 申请人:中国科学院大连化学物理研究所