专利名称：肝活素制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物药品的制备方法，尤指一种从江浙蝮蛇毒中提取精氨酸酯酶作为肝病治疗药的方法，利用这种方法可得高纯度的精氨酸酯酶，使更加适合于应用在肝病治疗药中。
本发明的方法包括如下步骤步骤a取江浙蝮蛇毒冻干粉溶于0.05M Tris-HCl，pH7.8缓冲液中，4℃下离心除去不溶物，取上清液；步骤b上清液先经DEAE纤维素DE-52柱层析，层析柱先用Tris-HCl缓冲液平衡后，用含NaCl的缓冲液从0至0.5M进行梯度洗脱，收集含精氨酸酯酶活性的组分，浓缩，去盐后，进行下一步分离；步骤c用CM-Sepharose柱层析分离，平衡液是0.05M醋酸钠pH5.0缓冲液，洗脱液含0至0.5M NaCl pH5.0的醋酸钠缓冲液梯度洗脱，收集含精氨酸酯酶活性组分，浓缩，去盐后再做下一步分离；步骤d用Sephadex-75柱层析凝胶过滤分离，洗脱液为0.05M NaHCO3含0.1M NaCl溶液，收集精氨酸酯酶组分，浓缩，去盐，冻干后得产品。
所说的去盐是采用透析法，浓缩采用超滤浓缩法。
利用上述方法所得到的产品经动物试验表明不含毒素及有害成分，纯度在90％以上(HPLC法检测)。
蝮蛇毒中含有二十多种酶类及毒蛋白，要高度纯化其中一种成分的难度极大。本发明采用的三步层析分离法，能把精氨酸酯酶高度纯化，除掉毒性成分，保证用药的安全性。本发明的方法中首先经过初步除去不溶物后，即进行三步层析分离，第一步分离的目的在于初步纯化，把精氨酸酯酶与蛇毒的其他成分分开，适于大规模加工，每次可用蛇毒原料20克。第二步分离是用阴离子交换剂，与第一步的阳离子交换剂不同，再次把碱性蛋白质分离，使精氨酸酯酶的纯度进一步提高。第三步分离是按分子量的差异把残余的毒素蛋白除尽。因蝮蛇神经毒素的分子量为15000，出血毒素约50000至60000，而精氨酸酯酶的分子量在30000左右，分子量间的差别大，容易用凝胶过滤(即分子筛)法把它们分开达到高度纯化的目的，采用0.05M NaHCO3含NaCl的溶液作为洗脱液，可增加精氨酸酯酶的溶解度，从而获取最大收率。用以上方法从蝮蛇毒1克可得到产品约3毫克，可装针剂约30支，每支精氨酸酯酶为100单位。
权利要求
1.一种肝活素制备方法，其特征是该方法包括如下步骤步骤a取江浙蝮蛇毒冻干粉溶于0.05M Tris-HCl，pH7.8缓冲液中，4℃下离心除去不溶物，取上清液；步骤b上清液先经DEAE纤维素DE-52柱层析，层析柱先用Tris-HCl缓冲液平衡后，用含NaCl的缓冲液从0至0.5M进行梯度洗脱，收集含精氨酸酯酶活性的组分，浓缩，去盐后，进行下一步分离；步骤c用CM-Sepharose柱层析分离，平衡液是0.05M醋酸钠pH5.0缓冲液，洗脱液含0至0.5M NaCl pH5.0的醋酸钠缓冲液梯度洗脱，收集含精氨酸酯酶活性组分，浓缩，去盐后再做下一步分离；步骤d用Sephadex-75柱层析凝胶过滤分离，洗脱液为0.05M NaHCO3含0.1M NaCl溶液，收集精氨酸酯酶组分，浓缩，去盐，冻干后得产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所说的去盐是采用透析法，浓缩采用超滤浓缩法。
全文摘要
本发明涉及从江浙蝮蛇毒中提取肝活素的方法,这种肝活素的主要成分为精氨酸酯酶,其药理功能是降低血粘度,改善微循环,对肝炎病毒感染细胞的发展有抑制作用,能促进肝功能的恢复。由于江浙蝮蛇毒中含有神经毒素和出血毒素等有害成分,本发明的方法是利用经过三柱层板分离纯化,能将这些毒性物质除掉,精氨酸酯酶的含量达90%以上。动物试验表明毒性很小,试验剂量为临床用量的数十倍,因而可保证临床用药安全。
文档编号C12N9/00GK1357623SQ0114431
公开日2002年7月10日 申请日期2001年12月14日 优先权日2001年12月14日
发明者周肖林, 陈远聪 申请人:周肖林, 陈远聪