专利名称：天然精氨酸酯酶的制备方法及其药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶的制备方法及其药物组合物，具体涉及一种天然精氨酸酯酶的制备方法及其药物组合物。属于生物医药技术领域。
背景技术：
蛇毒类凝血酶是蛇毒中与血浆凝血酶性质相似的一类酶的总称，通常具有精氨酸酯酶活性，又称为精氨酸酯酶。它可酶解血液中纤蛋白原，但不激活体内各种凝血因子。因此可在体外使血浆或血纤蛋白溶液凝固，而在体内生成的血纤蛋白凝块结构松散，易被纤溶系统清除，使纤蛋白原浓度显著下降，表现出抗凝作用。这种特性使精氨酸酯酶成为开发溶栓抗凝药物的重要来源，但精氨酸酯酶分子基因内部存在多种非同义核苷酸突变，使精氨酸酯酶的同功酶在功能上存在差异。蝮蛇蛇毒中含4种以上精氨酸酯酶同功酶，酶的分子量、糖基化程度、体内半衰期、底物专一性、比活性都有区别。因此在用作临床治疗药物时需要分开，进行结构确认，测定氨基酸组成、N-末端氨基酸序列，并精确测定相对分子量等资料。分离不完全会造成精氨酸酯酶终产品中含多种其它蛇毒蛋白，在临床应用可能出现副反应；同时蛋白结构和性质未得到充分鉴定的产品在生产中难于控制产品质量，不能保障药品使用的安全性，危害病人生命健康。因此，需要发展蛇毒精氨酸酯酶制备新技术，并对制备的精氨酸酯酶进行充分的结构和性质鉴定，才能保障用作药物时的安全性。
经对现有技术的文献检索发现，翟宁等在《中国医药工业杂志》(2005年36卷601-603页)发表了题为“尖吻蝮蛇毒中一种新类凝血酶的分离纯化”的论文，提出如下技术方案首先用阴离子交换色谱初步纯化，其次用高效凝胶过滤色谱进行精制，最后用高效凝胶过滤色谱分析制备的类凝血酶纯度。由于该方法使用凝胶过滤色谱作为制备手段之一，因此存在着上样量低、产量低、生产效率难于提高的缺点。同时，由于该研究未对制备的类凝血酶进行充分的蛋白结构和性质鉴定，难于用作治疗性药物。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种天然精氨酸酯酶的制备方法及其药物组合物，使其能够快速、简便制备天然精氨酸酯酶，以及制备含该天然精氨酸酯酶的药物组合物，用于治疗和预防多种血栓和栓塞性疾病。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明首先制备天然精氨酸酯酶，并对其进行结构确认，然后将其用于制备含该天然精氨酸酯酶的药物组合物。
本发明天然精氨酸酯酶的制备方法具体包括如下步骤(1)用装有三氮嗪固定的L-精氨酸分离材料的亲和层析柱在pH 6.0的缓冲液条件下吸附粗蛇毒原料中的天然精氨酸酯酶，再用pH 10.3的缓冲液洗脱，收集洗脱组分得到天然精氨酸酯酶粗品；(2)然后用弱阴离子离子交换层析对上述天然精氨酸酯酶粗品进行精制，在pH 7.0缓冲液条件下上样，用NaCl 0-0.3M的浓度梯度洗脱进行精制，得到天然精氨酸酯酶精制品，反相高效液相色谱和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明制备的天然精氨酸酯酶精制品纯度高于98％。
采用初凝法测上述天然精氨酸酯酶精制品的活性，结果表明该天然精氨酸酯酶的比活性大于每毫克蛋白10000降纤酶活力单位，用Edman降解法测定该天然精氨酸酯酶的N端氨基酸序列，为Val Ile Gly Gly Val Glu Cys Asp Ile AsnGlu His Arg Phe Leu，用基质辅助激光解离质谱方法测定该天然精氨酸酯酶完整分子的质量为34.07±0.20kDa，用TFMS(三氟甲磺酸)脱去所含糖链再用基质辅助激光解离质谱方法测定分子的质量为28.01±0.20kDa。所述天然精氨酸酯酶的这些结构数据有助于制定科学的原料药质量标准，在生产中更严格的控制药品质量，提高临床使用的安全性。
本发明药物组合物，含有安全和治疗有效量的上述天然精氨酸酯酶0.000083-0.129％以及药学上可接受的药物载体或辅料99.871-99.999917％。所述药物载体或辅料包括填充剂、粘合剂、崩解剂或溶胀性辅料、润滑剂、助流剂、抗粘着剂，吸收促进剂。
在控制生产环境的温度、湿度、水分的条件下，将上述天然精氨酸酯酶与各种类型的药物载体或辅料均匀混合，每剂量包括上述天然精氨酸酯酶(以蛋白质量计算为0.01-10μg)、填充剂0-200mg、粘合剂0-200mg、崩解剂或溶胀性辅料0-300mg、润滑剂0-20mg、助流剂0-15mg、抗粘着剂0-15mg、吸收促进剂0-300mg等，制备成相应的制剂形式。
所述的填充剂选自淀粉、糊精、环糊精、糖粉、乳糖、甘露醇、磷酸氢钙或微晶纤维素、纤维素，也可以是它们的混合物。
所述的粘合剂选自淀粉浆、羟丙基淀粉、改良淀粉、预胶化淀粉、糊精、糖粉、糖浆、微晶纤维素、纤维素衍生物(包括羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素)、聚乙烯吡咯烷酮胶浆、明胶浆的一种，或它们的混合物。
所述的崩解剂或溶胀性辅料选自羟丙基淀粉、改良淀粉、淀粉、羧甲基淀粉、微晶纤维素、纤维素衍生物(包括羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、羧丙基纤维素、羧甲基纤维素钙)、交联聚乙烯吡咯烷酮、吐温-80、十二烷基硫酸钠、瓜耳胶、苍耳胶、黄原胶中的一种，或它们的混合物。
所述的润滑剂、助流剂、抗粘着剂可以选用改良淀粉、微晶纤维素、氢氧化铝、硼酸、苯甲酸钠、聚乙二醇、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、滑石粉、十二烷基硫酸镁、十二烷基硫酸钠或微粉硅胶、硬脂酸单甘油酯、粽桐酰硬脂酸甘油酯、氢化的蓖麻油、氢化植物油、轻矿物油、延胡索酸十八烷基钠中的一种，或它们的混合物。
所述的吸收促进剂可以选用泊洛沙姆、卵磷脂、去氧胆酸钠、月桂醇硫酸钠、苄泽7(Bri j78)、吐温-80、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇(PEG-6000)、海藻多糖、聚乳酸、明胶、瓜耳胶、苍耳胶、黄原胶中的一种，或它们的混合物。
上述含天然精氨酸酯酶的药物组合物可以被制备为注射剂、口服剂、喷雾剂、贴剂，通过常规途径进行给药，其中包括注射给药(包括但并不限于肌内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药)、胃肠道给药、透皮给药、鼻腔给药以及肺部给药。
所述的注射剂为冻干注射剂，每剂量按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.01-0.07％，以及药物载体或辅料99.93-99.99％，所述的药物载体或辅料为低分子右旋糖苷、泊洛沙姆、卵磷脂、去氧胆酸钠、海藻多糖、聚乳酸中的一种或几种的组合。
所述的口服剂为肠溶片，每剂量按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.013-0.129％、以及药物载体或辅料99.871-99.987％，所述的药物载体或辅料为去氧胆酸钠、羧甲基纤维素盐、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、明胶、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯、微晶纤维素、淀粉、交联羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁，微粉硅胶中的一种或几种的组合。
所述的喷雾剂，每剂量按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.000083-0.0012％以及药物载体或辅料99.9988-99.999917％，所述的药物载体或辅料为去氧胆酸钠、月桂醇硫酸钠、苄泽7中的一种或几种的组合。
所述的贴剂为贴片制剂，每剂量按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.0011-0.11％以及药物载体或辅料99.89-99.9989％，所述的药物载体或辅料为去氧胆酸钠、羟丙基甲基纤维、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇中的一种或几种的组合。
经过对比研究发现，本发明天然精氨酸酯酶的制备方法、鉴定方法同样可以用于其它蛇毒来源比如，来自于蝮蛇、蝰蛇、竹叶青的天然精氨酸酯酶的制备和鉴定。
本发明药物组合物可直接用于治疗和预防血栓，由血栓引起的多种栓塞性疾病(如脑血栓、脑栓塞、短暂性脑缺血发作，以及脑梗死再复发的预防；心肌梗死，不稳定性心绞痛以及心肌梗死再复发的预防；四肢血管病，包括股动脉栓塞、血栓闭塞性脉管炎、雷诺氏病；血液呈高粘状态、高凝状态、血栓前状态；突发性耳聋；肺栓塞，等等)。临床上出于治疗目的在使用本发明的天然精氨酸酯酶时，还可同时与其他治疗药物联合使用。
本发明药物组合物可以被制成注射制剂，例如用生理盐水或含有葡萄糖、氯化钠等，和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备的水针制剂，也可以添加适当的辅料制备成粉针制剂或冻干制剂；也可以被制成通过胃肠道给药的口服制剂，如片剂和胶囊、分散片、肠溶制剂，可通过在常规方法的基础上针对该蛋白酶的特点进行制备。这些制剂的制备方式是采用常规制剂的基础上，需要专业的技术人员并且结合本发明所描述的该蛋白酶的具体理化特征情况，结合不同的制剂形式和辅料特点才能获得的。
在临床上使用本发明药物组合物时，治疗的有效量在单次给药剂量中的天然精氨酸酯酶通常约0.01μg/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳的该剂量是约0.001μg/千克体重-约1毫克/千克体重。这里所描述的剂量是常规的，在临床具体使用的剂量还应考虑给药途径、病人症状、健康状况等因素。此外，本发明的天然精氨酸酯酶还可与其他治疗剂一起使用。
按照本发明的方法和分子结构信息制备药物组合物，具有下述优点1、所述天然精氨酸酯酶的分子结构信息可用于生产过程中进行物质确认，制定更科学的质量控制标准，从而保证药物组合物在临床使用中的安全性；2、所述天然精氨酸酯酶制备方法的生产效率高、产品回收率高、生产成本低、产品纯度质量和比活性高，排除了其它蛇毒组份可能引起的毒副作用。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
如下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如洛(C.R.Lowe)著、刘毓秀译《亲和色谱导论》(科学出版社，1983年5月第1版)和John M.Walker编著《The Protein Protocols Handbook》(《蛋白质方法手册(第二版)》，多伦多，新泽西，Humana Press，2002)中所述的条件。生物活性测定方法和条件参照《中国药典(2005年版)》和《国家药品标准-降纤酶》(WS1-XG-031-2000)进行实验。
本发明实施案例中所采用的全部蛇毒来源，经过鉴定，为来自于Agkistrodon acutus(Guenther，尖吻蝮蛇)和Agkistrodon halys(ussriensisEmelianor，长白山白眉蝮蛇)。
实施例1尖吻蝮蛇天然精氨酸酯酶的制备称取尖吻蝮蛇蛇毒粗品15g，溶解于160ml磷酸钠缓冲液(5mM磷酸钠，1mM EDTA，pH6.0)，过滤去除不溶物，澄清样上至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(含10mM磷酸钠和1mM EDTA，pH6.0)平衡好的用三氮嗪固定的精氨酸亲和层析柱(5×10cm)中，依次用磷酸钠缓冲液(含10mM磷酸钠和1mM EDTA，pH 6.0)洗至280nm光吸收至基线后，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(10mM，pH10.3)洗脱，分步收集，合并具有纤维蛋白原初凝活性的组分，得到该天然精氨酸酯酶粗品。用福林酚测定法测定总蛋白150mg；用纤维蛋白原初凝法测定，总活性在800000-1200000单位左右。
调节天然精氨酸酯酶粗品合并液pH至7.0，上至预先用5倍体积的磷酸钠缓冲液(10mM，pH7.0)平衡的弱阴离子(DEAE)层析柱(5×10cm)，用磷酸钠缓冲液(10mM，pH7.0)和含0.3M NaCl的磷酸钠缓冲液(10mM，pH7.0)梯度洗脱，分步收集洗脱组分，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯度和表观分子量，合并表观分子量为单一条带40.5±0.2KDa的组份得天然精氨酸酯酶精制品，其纯度在98％以上。
用福林酚测定法测定天然精氨酸酯酶精制品的总蛋白75mg；用纤维蛋白原初凝法测定，总活性在850000单位左右，比活大于10000单位/mg蛋白。
精氨酸酯酶实验取天然精氨酸酯酶精制品0.2ml，加0.2ml L-BAPA液[Benzoyl-L-Arginyl-P-Nitroaniline Hydrocholoride(盐酸苯酰-L-精氨酰-P-硝基苯胺)5mg/5ml三羟甲基氨基甲烷缓冲液(0.15M，pH 8.2)]，置37℃保温，20分钟，溶液已经呈淡黄色，30分钟，溶液呈黄色。
出血毒实验取天然精氨酸酯酶精制品，加氯化钠注射液制成每1ml中含25单位的溶液作为供试品溶液。取体重18-22g的小白鼠5只，背部皮下注射供试品溶液0.2ml，注射后24小时处死动物，剥皮观察，小鼠背部注射部位均没有出血现象。
神经毒实验取天然精氨酸酯酶精制品，用氯化钠注射液制成每1ml中含75单位的溶液作为供试品溶液，取体重为300～500g的鸽3只，每1kg体重静脉注射供试品溶液0.5ml，观察24小时，动物没有出现抽搐、死亡。
体外溶栓实验取人-枸橼酸血浆[3.8％g枸橼酸钠溶液-人血(1∶9)比例混合，3000转/min离心30分钟]0.3ml，加400IU/ml肝素钠溶液0.05ml，混匀，加入天然精氨酸酯酶精制品0.05ml，37℃保温，20s左右溶液明显变稠，45s后凝结成块，此时加入1％氯醋酸溶液，振荡，凝快全部溶解，呈澄清透明溶液。
实施例2白眉蝮蛇天然精氨酸酯酶制备称取长白山白眉蝮蛇蛇毒粗品20g，溶解于200ml磷酸钠缓冲液(含5mM磷酸钠和1mMEDTA，pH 6.0)，上样至预先用10倍体积磷酸钠缓冲液(含10mM磷酸钠和1mM EDTA，pH 6.0)平衡的用三氮嗪固定的精氨酸亲和层析柱(2.5×20cm)中，依次用磷酸钠缓冲液(含10mM磷酸钠和1mM EDTA，pH 6.0)洗至280nm光吸收至基线，甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(10mM，pH 10.6)洗脱结合的蛋白，分步收集，合并具有纤维蛋白原初凝活性的组份，得到天然精氨酸酯酶粗品。用福林酚测定法测定总蛋白130mg；用纤维蛋白原初凝法测定，总活性在280000单位。
调天然精氨酸酯酶粗品pH至7.0，上至预先用5倍体积的磷酸钠缓冲液(10mM，pH 7.0)平衡的弱阴离子(DEAE)层析柱(5×10cm)，以磷酸钠缓冲液(10mM，pH7.0)和含0.3M NaCl的磷酸钠缓冲液(10mM，pH7.0)梯度洗脱，分步收集洗脱组分，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析纯度和表观分子量，合并表观分子量为单一条带40.1±0.2KDalton的组份，得到白眉蝮蛇的天然精氨酸酯酶精制品，其纯度在98％以上。
用福林酚测定法测定精制白眉蝮蛇的天然精氨酸酯酶制品的总蛋白20mg；用纤维蛋白原初凝法测定，总活性在210000单位左右，比活大于10000单位/mg蛋白。
精氨酸酯酶实验取白眉蝮蛇的天然精氨酸酯酶精制品0.2ml，加0.2mlL-BAPA液[Benzoyl-L-Arginyl-P-Nitroaniline Hydrocholoride(盐酸苯酰-L-精氨酰-P-硝基苯胺)5mg/5ml三羟甲基氨基甲烷缓冲液(0.15M，pH 8.2)]，置37℃保温，25分钟，溶液已经呈淡黄色，30分钟，溶液呈黄色。
出血毒实验取白眉蝮蛇的天然精氨酸酯酶精制品，加氯化钠注射液制成每1ml中含25单位的溶液作为供试品溶液，取体重18-22g的小白鼠5只，背部皮下注射供试品溶液0.2ml，注射后24小时处死动物，剥皮观察，小鼠背部注射部位均没有出血现象。
神经毒实验取天然精氨酸酯酶精制品，用氯化钠注射液制成每1ml中含75单位的溶液作为供试品溶液，取体重为300～500g的鸽3只，每1kg体重静脉注射供试品溶液0.5ml，观察24小时，动物没有出现抽搐、死亡。
体外溶栓实验取人-枸橼酸血浆[3.8％g枸橼酸钠溶液与人血按1∶9的体积比混合，3000转/min离心30分钟]0.3ml，加400IU/ml肝素钠溶液0.05ml，混匀，加入白眉蝮蛇的天然精氨酸酯酶精制品0.05ml，37℃保温，30s左右溶液明显变稠，45s后凝结成块，此时加入1％氯醋酸溶液，振荡，凝快全部溶解，呈澄清透明溶液。
实施例3测定天然精氨酸酯酶分子质量取天然精氨酸酯酶精制品与芥子酸基质混合，点约1μl于靶上，自然干燥后，装入质谱仪(Brukerg公司生产，型号AutoFlex MALDI-TOF-TOF-MS)，N2激光源(波长337nm)；用正离子线性方式检测(飞行管长1.22M，加速电压20KV)，得到MALDI-TOP MS图谱，在m/z 17503、34069、68138存在质量峰，分别是半分子质量、分子质量和二倍分子质量，因此天然精氨酸酯酶分子质量为34.07±0.20kDa。
测定天然精氨酸酯酶分子含糖量取天然精氨酸酯酶精制品溶液(52μg/ml)脱盐冷冻燥，加入20μl三氟甲磺酸(TFMS)，-70℃反应过夜，然后加入-20℃预冷的乙腈1200μl，混匀，用离心超滤管(YM-10)于12000rpm、4℃条件下，离心35min超滤去除乙腈和TFMS；再重复一次加预冷乙腈-超滤去除乙腈和三氟甲磺酸，最后再加入600μl超纯水，混合均匀，离心超滤，除去残留乙腈和三氟甲磺酸，收集所剩溶液用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析发现在电泳图中共出现表观分子量36.3、34.9、33.8、30.4kDa共4个条带，其中36.3、34.9、33.8kDa三条带总共含量约10％，条带30.4kDa含量约85％，推测为完全脱糖链的尖吻蝮蛇天然精氨酸酯酶制品。回收条带30.4kDa的蛋白，与芥子酸基质混合，点约1μl于靶上，自然干燥后，装入质谱仪(Brukerg公司生产，型号AutoFlex MALDI-TOF-TOF-MS)，N2激光源(波长337nm)，用正离子线性方式检测(飞行管长1.22M，加速电压20KV)，得到质谱图谱，在m/z 28007处存在一个质量峰，是天然精氨酸酯酶脱糖后的分子质量，为28.01±0.20kDa。因此含糖量为天然精氨酸酯酶完整分子质量减去为脱糖链后分子质量34.07-28.01，含糖量约为6.06±0.20kDa。
测定N端15个氨基酸序列取脱糖天然精氨酸酯酶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的条带30.4kDa，用半干式蛋白转膜系统将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，利用Edman降解的方法，从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列，N末端氨基酸残基被苯异硫氰酸酯修饰，然后从多肽链上切下修饰的残基，再经HPLC(高效液相色谱)鉴定，连续测试获得了前17个循环的氨基酸高效液相色谱鉴定图谱。N端15个氨基酸序列为Val Ile Gly Gly Val Glu Cys Asp Ile Asn Glu His Arg Phe Leu天然精氨酸酯酶的pH稳定性测试取天然精氨酸酯酶精制品40μl分别加入600μl pH为4、5、6的0.1M醋酸钠缓冲液，pH为7、8的40mM Tris-HCl缓冲液和pH为9、10、11、12的10nm的Gly-NaOH缓冲液中，混合均匀后与37℃水浴中孵育一周，于12％还原SDS-PAGE电泳分析各个样品。电泳结果显示，在pH 4、5、6条件下，纯化分离的天然精氨酸酯酶在表观分子量为40.3±0.2KD处存在唯一蛋白条带；在pH 7，8和9条件下，样品在表观分子量为40.3±0.2KD和约28.1±0.2KD处存在两个蛋白条带；在pH 10、11、12条件下，样品中几乎已经看不出在表观分子量为40.3±0.2KD处的蛋白条带，说明几乎全部降解。因此，该天然精氨酸酯酶在pH 4、5、6条件下比较稳定，在生产和储存过程中尽可能保持pH 4-6。
实施例4含天然精氨酸酯酶的肠溶片含天然精氨酸酯酶的肠溶片I含天然精氨酸酯酶的肠溶片I按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.013％、去氧胆酸钠25.886％、羧甲基纤维素盐16.179％、低取代羟丙基纤维素10.678％、交联聚乙烯吡咯烷酮8.090％、明胶9.707％、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯0.971％、微晶纤维素3.236％、淀粉19.415％、交联羧甲基纤维素钠5.177％，硬脂酸镁0.324％，微粉硅胶0.324％。
上述肠溶片I的制备方法为取天然精氨酸酯酶精制品40mg溶解于10ml注射用水，再加990ml注射用水后，加去氧胆酸钠80g搅拌溶解后，冷冻干燥，然后与羧甲基纤维素盐50g、低取代羟丙基纤维素25g、交联聚乙烯吡咯烷酮10g、明胶30g混合制粒干燥，用醋酸纤维素邻苯二甲酸酯3g包衣，过筛收集18-24目大小的颗粒，和微晶纤维素10g、淀粉60g、交联聚乙烯吡咯烷酮15g、交联羧甲基纤维素钠16g、低取代羟丙基纤维素8g，硬脂酸镁1g和微粉硅胶1g，混和均匀压制成2000片，得到含天然精氨酸酯酶的肠溶片I。
含天然精氨酸酯酶的肠溶片II含天然精氨酸酯酶的肠溶片II按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.019％、去氧胆酸钠25.884％、羧甲基纤维素盐16.178％、低取代羟丙基纤维素10.678％、交联聚乙烯吡咯烷酮8.089％、明胶9.707％、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯0.971％、微晶纤维素3.236％、淀粉19.413％、交联羧甲基纤维素钠5.177％，硬脂酸镁0.324％，微粉硅胶0.324％。
上述肠溶片II的制备方法为取天然精氨酸酯酶精制品60mg溶解于10ml注射用水，再加990ml注射用水后，加去氧胆酸钠80g搅拌溶解后，冷冻干燥。然后与羧甲基纤维素盐50g、低取代羟丙基纤维素25g、交联聚乙烯吡咯烷酮10g、明胶30g混合制粒干燥，用醋酸纤维素邻苯二甲酸酯3g包衣，过筛收集18-24目大小的颗粒，和微晶纤维素10g、淀粉60g、交联聚乙烯吡咯烷酮15g、交联羧甲基纤维素钠16g、低取代羟丙基纤维素8g，硬脂酸镁1g和微粉硅胶1g，混和均匀压制成2000片，得到含天然精氨酸酯酶的肠溶片II。
含天然精氨酸酯酶的肠溶片III含天然精氨酸酯酶的肠溶片III按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.032％、去氧胆酸钠25.881％、羧甲基纤维素盐16.176％、低取代羟丙基纤维素10.676％、交联聚乙烯吡咯烷酮8.088％、明胶9.706％、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯0.971％、微晶纤维素3.235％、淀粉19.411％、交联羧甲基纤维素钠5.176％，硬脂酸镁0.324％，微粉硅胶0.324％。
含天然精氨酸酯酶的肠溶片III的制备方法为取天然精氨酸酯酶精制品100mg溶解于10ml注射用水，再加990ml注射用水后，加去氧胆酸钠80g搅拌溶解后，冷冻干燥，然后与羧甲基纤维素盐50g、低取代羟丙基纤维素25g、交联聚乙烯吡咯烷酮10g、明胶30g混合制粒干燥，用醋酸纤维素邻苯二甲酸酯3g包衣，过筛收集18-24目大小的颗粒，和微晶纤维素10g、淀粉60g、交联聚乙烯吡咯烷酮15g、交联羧甲基纤维素钠16g、低取代羟丙基纤维素8g，硬脂酸镁1g和微粉硅胶1g，混和均匀压制成2000片，得到含天然精氨酸酯酶的肠溶片III。
含天然精氨酸酯酶的肠溶片IV含天然精氨酸酯酶的肠溶片IV按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.065％、去氧胆酸钠25.874％、羧甲基纤维素盐16.171％、低取代羟丙基纤维素10.673％、交联聚乙烯吡咯烷酮8.085％、明胶9.702％、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯0.970％、微晶纤维素3.234％、淀粉19.405％、交联羧甲基纤维素钠5.175％，硬脂酸镁0.323％，微粉硅胶0.323％。
含天然精氨酸酯酶的肠溶片IV的制备方法为取天然精氨酸酯酶精制品200mg溶解于10ml注射用水，再加990ml注射用水后，加去氧胆酸钠80g搅拌溶解后，冷冻干燥，然后与羧甲基纤维素盐50g、低取代羟丙基纤维素25g、交联聚乙烯吡咯烷酮10g、明胶30g混合制粒干燥，用醋酸纤维素邻苯二甲酸酯3g包衣，过筛收集18-24目大小的颗粒，和微晶纤维素10g、淀粉60g、交联聚乙烯吡咯烷酮15g、交联羧甲基纤维素钠16g、低取代羟丙基纤维素8g，硬脂酸镁1g和微粉硅胶1g，混和均匀压制成2000片，得到含天然精氨酸酯酶的肠溶片IV。
含天然精氨酸酯酶的肠溶片V含天然精氨酸酯酶的肠溶片V按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.129％、去氧胆酸钠25.857％、羧甲基纤维素盐16.160％、低取代羟丙基纤维素10.666％、交联聚乙烯吡咯烷酮8.080％、明胶9.696％、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯0.970％、微晶纤维素3.232％、淀粉19.393％、交联羧甲基纤维素钠5.171％，硬脂酸镁0.323％，微粉硅胶0.323％。
含天然精氨酸酯酶的肠溶片V的制备方法为取天然精氨酸酯酶精制品400mg溶解于10ml注射用水，再加990ml注射用水后，加去氧胆酸钠80g搅拌溶解后，冷冻干燥，然后与羧甲基纤维素盐50g、低取代羟丙基纤维素25g、交联聚乙烯吡咯烷酮10g、明胶30g混合制粒干燥，用醋酸纤维素邻苯二甲酸酯3g包衣，过筛收集18-24目大小的颗粒，和微晶纤维素10g、淀粉60g、交联聚乙烯吡咯烷酮15g、交联羧甲基纤维素钠16g、低取代羟丙基纤维素8g，硬脂酸镁1g和微粉硅胶1g，混和均匀压制成2000片，得到含天然精氨酸酯酶的肠溶片V。
实施例5注射制剂的制备与检验1、冻干注射制剂含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂I冻干注射制剂I每瓶按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.05％、低分子右旋糖苷99.95％。
含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂I的制备方法为准确称取低分子右旋糖苷200克于注射用水中，搅拌溶解，再投入实施例1中所得天然精氨酸酯酶精制品10毫克，搅拌溶解，调节pH值为5.0～6.0，搅匀，测定pH值、澄明度及含量合格后，补加注射用水至20升体积，用0.22μm微孔滤膜滤过至澄明，每瓶按1ml的量无菌分装于2ml管制抗生素瓶中，加半塞，送入冷冻干燥箱中，降温至-40℃，停板冷，开启冷凝器，当冷凝器温度达-40℃时，开启真空系统，打开蝶阀，以每小时2-4℃自然升温至35℃；停机、压塞、出箱、轧盖，即可得到含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂“注射用精氨酸酯酶”20000瓶。
含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂II含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂II每瓶按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.07％、低分子右旋糖苷99.93％。
含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂II的制备方法为准确称取甘露醇300克于注射用水中，搅拌溶解，再投入实施例1所得天然精氨酸酯酶精制品20毫克，搅拌溶解，调节pH值为5.0～6.0，搅匀，测定pH值、澄明度及含量合格后，补加注射用水至20升体积，用0.22μm微孔滤膜滤过至澄明，每瓶按lml的量无菌分装于2ml管制抗生素瓶中，加半塞，送入冷冻干燥箱中，降温至-40℃，停板冷，开启冷凝器，当冷凝器温度达-40℃时，开启真空系统，打开蝶阀，以每小时2-4℃自然升温至35℃；停机、压塞、出箱、轧盖，即可得到含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂“注射用精氨酸酯酶”20000瓶。
含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂III含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂III每瓶按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.01％、泊洛沙姆99.99％。
含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂III的制备方法为准确称取泊洛沙姆400克于注射用水中，搅拌溶解，再投入实施例1所得天然精氨酸酯酶精制品40毫克，搅拌溶解，调节pH值为5.0～6.0，搅匀，测定pH值、澄明度及含量合格后，补加注射用水至20升体积，用0.22μm微孔滤膜滤过至澄明，每瓶按1ml的量无菌分装于2ml管制抗生素瓶中，加半塞，送入冷冻干燥箱中，降温至-40℃，停板冷，开启冷凝器，当冷凝器温度达-40℃时，开启真空系统，打开蝶阀，以每小时2-4℃自然升温至35℃；停机、压塞、出箱、轧盖，即可得到含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂“注射用精氨酸酯酶”20000瓶。
含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂IV含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂IV每瓶按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.011％、卵磷脂55.549％、去氧胆酸钠44.440％。
含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂IV的制备方法为准确称取卵磷脂1000克、去氧胆酸钠800g于注射用水中，搅拌溶解，再投入实施例1所得天然精氨酸酯酶精制品200毫克，搅拌溶解，调节pH值为5.0～6.0，搅匀，测定pH值、澄明度及含量合格后，补加注射用水至20升体积，用0.22μm微孔滤膜滤过至澄明，每瓶按1ml的量无菌分装于2ml管制抗生素瓶中，加半塞，送入冷冻干燥箱中，降温至-40℃，停板冷，开启冷凝器，当冷凝器温度达-40℃时，开启真空系统，打开蝶阀，以每小时2-4℃自然升温至35℃；停机、压塞、出箱、轧盖，即可得到含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂“注射用精氨酸酯酶”20000瓶。
含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂V含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂V每瓶按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.025％、海藻多糖99.975％。
含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂V的制备方法为准确称海藻多糖800g于注射用水中，搅拌溶解，再投入实施例1所得天然精氨酸酯酶精制品200毫克，搅拌溶解，调节pH值为5.0～6.0，搅匀，测定pH值、澄明度及含量合格后，补加注射用水至20升体积，用0.22μm微孔滤膜滤过至澄明，每瓶按1ml的量无菌分装于2ml管制抗生素瓶中，加半塞，送入冷冻干燥箱中，降温至-40℃，停板冷，开启冷凝器，当冷凝器温度达-40℃时，开启真空系统，打开蝶阀，以每小时2-4℃自然升温至35℃；停机、压塞、出箱、轧盖，即可得到冻干制剂“注射用精氨酸酯酶”20000瓶，得到含天然精氨酸酯酶的注射剂。
含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂VI含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂VI每瓶按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.025％、聚乳酸99.975％。
含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂VI的制备方法为准确称聚乳酸800g于注射用水中，搅拌溶解，再投入实施例1所得天然精氨酸酯酶精制品200毫克，搅拌溶解，调节pH值为5.0～6.0，搅匀，测定pH值、澄明度及含量合格后，补加注射用水至20升体积，用0.22μm微孔滤膜滤过至澄明，每瓶按1ml的量无菌分装于2ml管制抗生素瓶中，加半塞，送入冷冻干燥箱中，降温至-40℃，停板冷，开启冷凝器，当冷凝器温度达-40℃时，开启真空系统，打开蝶阀，以每小时2-4℃自然升温至35℃；停机、压塞、出箱、轧盖，即可得到含天然精氨酸酯酶的冻干注射制剂“注射用精氨酸酯酶”20000瓶。
2、注射制剂的检查装量差异参照制剂通则(《中国药典(2000年版)》二部附录)项下有关规定检查，共测定3个批号各6个样品，结果表明本品装量符合国家制剂标准的相关规定。澄明度检查取三个批号本品各五瓶，照澄明度检查细则和判断标准操作，每瓶用注射针注入4ml注射用水后检查，检查毛点总数每瓶均＜5个，其中色点数每瓶≤3个，结果表明本品澄明度符合国家制剂标准的相关规定；溶液的颜色和澄清度按照《中国药典(2000年版)》二部附录方法检查，取本品五瓶，每瓶按标示量加水制成1ml中含0.5mg的溶液，分别与标准比色液黄色1号和浊度标准液1号比较，结果本品三批颜色均低于黄色1号，澄清度检查结果均未超过0.5号标准浊度液，说明本品的颜色与澄清度符合规定；pH值照《中国药典(2000年版)》二部附录pH值测定法试验，取本品一瓶，加水4ml使之溶解，测定制剂的pH值，参照本品的处方、工艺研究，确定本品的pH值在范围内；水分取三批样品照《中国药典(2000年版)》二部附录方法进行水分测定，控制本品质量的水分含量为不得过3.0％；无菌参照《中国药典(2000年版)》二部附录方法，取本品三批，每批11支，分别加灭菌用水制成每1ml中含0.5ug的溶液，依法检查，结果表明本品无菌检查符合国家制剂标准的相关规定；热原取本品三批，分别加无菌用水制成每1ml中含0.2ug的溶液，照《中国药典(2000年版)》二部附录试验，剂量为家兔每公斤体重缓缓注射2ml(相当于每1kg体重0.4ug)，结果表明本品热原检查符合国家制剂标准的相关规定；制剂的含量测定取本品适量，精确称定，用水制成每1ml约含精氨酸酯酶1mg的溶液，参照《中国药典(2000年版)》二部附录高效液相色谱法试验，采用凝胶色谱柱(如Biosep S2000，7.8mm×300mm，5μm)以0.2mol/L磷酸钠缓冲液(pH6.8)为流动相，流速1ml/min，检测于280nm波长处测定吸收值，另取精氨酸酯酶对照品适量，同法测定，按外标法以吸收度计算样品标示量，结果表明本品的含量均在90.0-110.0％之间。
对实例“注射用精氨酸酯酶”制剂质量研究试验结论参照国家有关药品制剂的规定、《中国药典(2000年版)》及有关部颁标准，根据本发明所制备的“注射用精氨酸酯酶”制剂的符合国家制剂质量标准的相关规定。
3、注射制剂的稳定性试验高温试验将除去外包装的“注射用精氨酸酯酶”分别放置在40℃、60℃的干燥箱里，各于5、10天取样检测，与0天检测结果比较，结果表明本品在高温下不稳定。高湿试验将除去外包装的“注射用精氨酸酯酶”放置于RH92.5％环境中放置，于5、10天取样检测，与0天检测结果比较，结果表明本品在高湿条件下较稳定。光照试验将除去外包装的“注射用精氨酸酯酶”暴露于4500±500Lx的强光下(以照度计定位)照射，分别于5、10天取样检测，与0天检测结果比较，结果表明本品在光照条件下较稳定。加速试验将本品模拟上市包装，置40℃、RH75％条件下放置分别于1、2、3、6个月取样检测，与0月检测结果比较，加速试验结果表明，本品在40℃、RH75％条件下放置6个月，除外观颜色略变深及含量略有下降外其它指标均无明显变化。长期试验将本品模拟上市包装，置室温条件(25±2℃、RH60±10％)下长期自然放置，分别于0、3、6、9、12、18、24、36个月取样检测，与0月检测结果比较，结果标明，本品室温长期留样考察12个月结果稳定，各项检测指标均合格。
对制剂稳定性研究的总结，参照国家有关药品制剂的规定、《中国药典(2000年版)》及有关部颁标准，根据本发明所制备的“注射用精氨酸酯酶”制剂的符合国家制剂质量标准的相关规定。根据上述各试验结果，并结合本品蛋白酶的特性，确定本品应遮光、密闭，置于低温、阴凉干燥处保存为宜。
4、注射制剂体外溶栓试验采用本实施例所制备的“注射用精氨酸酯酶”注射制剂，按照国家《国家药品标准-降纤酶》(WS1-XG-031-2000)所标明方法进行测定。取本品加水制成每ml含有1mg的溶液作为供试品溶液，取人-枸橼酸血浆0.3ml，加400IU/ml肝素钠溶液0.05ml，混匀，加入供试品溶液0.05ml，37度保温，1分钟内血浆凝固，加入1％氯醋酸溶液1ml，振荡，凝块全部溶解，呈澄清透明溶液。
实施例6含天然精氨酸酯酶的喷雾剂含天然精氨酸酯酶的喷雾剂I含天然精氨酸酯酶的喷雾剂I每瓶按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.000083％、去氧胆酸钠99.999917％。
含天然精氨酸酯酶的喷雾剂I的制备方法为称取去氧胆酸钠12kg用注射用水10L溶解，称取天然精氨酸酯酶精制品10mg用注射用水10ml溶解，混合均匀，调节pH值为5.0～6.0，测定pH值、澄明度及含量合格后，补加注射用水，至150L，分装于定量喷雾器(15ml体积，每喷0.14ml，共用100喷)，得到含天然精氨酸酯酶的喷雾剂10000瓶。
含天然精氨酸酯酶的喷雾剂II含天然精氨酸酯酶的喷雾剂II每瓶按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.0005％、月桂醇硫酸钠99.9995％。
含天然精氨酸酯酶的喷雾剂II的制备方法为称取月桂醇硫酸钠10kg用注射用水10L溶解，称取天然精氨酸酯酶精制品50mg用注射用水10ml溶解，混合均匀，调节pH值为5.0～6.0；测定pH值、澄明度及含量合格后，补加注射用水，至150L，分装于定量喷雾器(15ml体积，每喷0.14ml，共用100喷)，得到含天然精氨酸酯酶的喷雾剂10000瓶。
含天然精氨酸酯酶的喷雾剂III含天然精氨酸酯酶的喷雾剂III每瓶按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.0012％、苄泽799.9988％。
含天然精氨酸酯酶的喷雾剂III的制备方法为称取苄泽7(Bri j78)8kg用注射用水10L溶解，称取天然精氨酸酯酶精制品100mg用注射用水10ml溶解，混合均匀，调节pH值为5.0～6.0；测定pH值、澄明度及含量合格后，补加注射用水，至150L，分装于定量喷雾器(15ml体积，每喷0.14ml，共用100喷)，得到含天然精氨酸酯酶的喷雾剂10000瓶。
实施例7含天然精氨酸酯酶的贴片制剂含天然精氨酸酯酶的贴片制剂I含天然精氨酸酯酶的贴片制剂I每平方厘米贴片按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.0011％，去氧胆酸钠88.8879％，羟丙基甲基纤维素3.3333％，聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K30)5.5555％，聚乙二醇(PEG-6000)2.2222％。
含天然精氨酸酯酶的贴片制剂I的制备方法为称取去氧胆酸钠80g用注射用水400ml溶解，称取天然精氨酸酯酶精制品1mg用注射用水4ml溶解，混合均匀。加3g羟丙基甲基纤维素，5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K30)，2g聚乙二醇(PEG-6000)，混合均匀，放置去泡后倒入模具中，真空脱溶剂成型，得到含所述天然精氨酸酯酶的贴片10000cm2。
含天然精氨酸酯酶的贴片制剂II含天然精氨酸酯酶的贴片制剂II每平方厘米贴片按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.011％，去氧胆酸钠88.879％，羟丙基甲基纤维素3.333％，聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K30)5.555％，聚乙二醇(PEG-6000)2.222％。
含天然精氨酸酯酶的贴片制剂II的制备方法为称取去氧胆酸钠80g用注射用水400ml溶解，称取天然精氨酸酯酶精制品10mg用注射用水4ml溶解，混合均匀，加3g羟丙基甲基纤维素、5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K30)、2g聚乙二醇(PEG-6000)混合均匀，放置去泡后倒入模具中，真空脱溶剂成型，得到含所述天然精氨酸酯酶的贴片10000cm2。
含天然精氨酸酯酶的贴片制剂III含天然精氨酸酯酶的贴片制剂III每平方厘米贴片按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.11％，去氧胆酸钠88.79％，羟丙基甲基纤维3.33％，聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K30)5.55％，聚乙二醇(PEG-6000)2.22％。
含天然精氨酸酯酶的贴片制剂III的制备方法为称取去氧胆酸钠80g用注射用水400ml溶解，称取天然精氨酸酯酶精制品100mg用注射用水4ml溶解，混合均匀，然后加3g羟丙基甲基纤维素、5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K30)、2g聚乙二醇(PEG-6000)混合均匀，放置去泡后倒入模具中，真空脱溶剂成型，得含天然精氨酸酯酶的贴片10000cm2。
本发明涉及的序列及记号分列如下SEQ ID NO.1的信息<110>上海交通大学<110>上海拟生生物科技有限公司<120>天然精氨酸酯酶的制备方法及其药物组合物<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>15<212>PRT<213>尖吻蝮蛇(Guenther)<400>1Val Ile Gly Gly Val Glu Cys Asp Ile Asn Glu Hi s Arg Phe Leu1 5 10 1权利要求
1.一种天然精氨酸酯酶的制备方法，其特征在于，具体步骤包括(1)用装有三氮嗪固定的L-精氨酸分离材料的亲和层析柱在pH 6.0的缓冲液条件下吸附粗蛇毒原料中的天然精氨酸酯酶，再用pH 10.3的缓冲液洗脱，收集洗脱组分得到天然精氨酸酯酶粗品；(2)用弱阴离子离子交换层析对上述天然精氨酸酯酶粗品进行精制，在pH7.0缓冲液条件下上样，用NaCl 0-0.3M的浓度梯度洗脱进行精制，得到天然精氨酸酯酶精制品。
2.根据权利要求1所述的天然精氨酸酯酶的制备方法，其特征是，所述的天然精氨酸酯酶精制品，其纯度高于98％。
3.根据权利要求1所述的天然精氨酸酯酶的制备方法，其特征是，所述的天然精氨酸酯酶，其完整分子质量为34.07±0.20kDa、完全脱糖后的分子质量为28.01±0.20kDa、比活性大于每毫克蛋白10000降纤酶活力单位，N端氨基酸具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
4.一种含如权利要求1所述的天然精氨酸酯酶的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物，按质量百分比含有0.000083-0.129％天然精氨酸酯酶以及药物载体或辅料99.871-99.999917％。
5.根据权利要求4所述的含天然精氨酸酯酶的药物组合物，其特征是，所述的药物组合物为冻干注射剂，每剂量按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.01-0.07％，以及药物载体或辅料99.93-99.99％；所述的药物载体或辅料为低分子右旋糖苷、泊洛沙姆、卵磷脂、去氧胆酸钠、海藻多糖、聚乳酸中的一种或几种的组合。
6.根据权利要求4所述的含天然精氨酸酯酶的药物组合物，其特征是，所述的药物组合物为肠溶片，每剂量按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.013-0.129％、以及药物载体或辅料99.871-99.987％；所述的药物载体或辅料为去氧胆酸钠、羧甲基纤维素盐、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、明胶、醋酸纤维素邻苯二甲酸酯、微晶纤维素、淀粉、交联羧甲基纤维素钠、硬脂酸镁、微粉硅胶中的一种或几种的组合。
7.根据权利要求4所述的含天然精氨酸酯酶的药物组合物，其特征是，所述的药物组合物为喷雾剂，每剂量按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.000083-0.0012％以及药物载体或辅料99.9988-99.999917％；所述的药物载体或辅料为去氧胆酸钠、月桂醇硫酸钠、苄泽7中的一种或几种的组合。
8.根据权利要求4所述的含天然精氨酸酯酶的药物组合物，其特征是，所述的药物组合物为贴片制剂，每剂量按质量百分比含天然精氨酸酯酶0.0011-0.11％以及药物载体或辅料99.89-99.9989％；所述的药物载体或辅料为去氧胆酸钠、羟丙基甲基纤维、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇中的一种或几种的组合。
全文摘要
一种天然精氨酸酯酶的制备方法及其药物组合物，属于生物医药技术领域。本发明天然精氨酸酯酶的制备方法为首先用装有三氮嗪固定的L－精氨酸分离材料的亲和层析柱在中性缓冲液条件下吸附粗蛇毒原料中的天然精氨酸酯酶，再用碱性缓冲液洗脱，收集洗脱组分得到精氨酸酯酶粗品；然后用离子交换层析对上述精氨酸酯酶粗品进行精制，得到天然精氨酸酯酶精制品。本发明还提供了含天然精氨酸酯酶的药物组合物，其按质量百分比含有0.000083－0.129％天然精氨酸酯酶以及药物载体或辅料99.871－99.999917％。本发明能够快速、简便的制备天然精氨酸酯酶及含该天然精氨酸酯酶的药物组合物，用于治疗和预防多种血栓和栓塞性疾病。
文档编号A61K38/46GK101067128SQ20071003728
公开日2007年11月7日 申请日期2007年2月8日 优先权日2007年2月8日
发明者李荣秀, 辛瑜, 王霆 申请人:上海交通大学, 上海拟生生物科技有限公司