人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白、其制法及其药物组合物的制作方法

专利名称：人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白、其制法及其药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及一种亲和力和表达量有所提高的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白。另外，本发明还涉及该突变蛋白的制备方法以及含有该突变蛋白的药物组合物。
背景技术：
目前临床上对肿瘤患者的治疗仍大多采用手术切除联合化学疗法和放射疗法，这一传统疗法虽然能去除瘤体并杀死部分癌细胞，但由于其非特异性杀伤作用，使得患者的大量正常组织细胞被杀死，导致患者的机体健康受到重大损伤，同时也无法防治肿瘤的复发和转移。
当前兴起的生物治疗和基因治疗为彻底根治肿瘤带来了曙光，近期研究发现了一种能特异性杀伤肿瘤细胞的蛋白-TRAIL(TNF related apoptosis inducing ligand，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)，由于其独特的抗癌作用而为世人瞩目。
人TRAIL基因位于染色体3q26，由美国科学家Wiley等人首先发现并于1995年克隆、命名。TRAIL属于肿瘤坏死因子家族成员，为典型的II型跨膜蛋白，整个分子由281个氨基酸组成，C端细胞外区域形成同源三聚体的亚结构，而N端氨基酸为疏水区并形成跨膜结构，其受体分为五种，其中R1、R2为坏死受体(necrosisreceptor)，R3、R4为诱骗受体(seduction receptor)，R5为一种分泌性受体。TRAIL与死亡受体R1、R2结合将导致细胞凋亡，而与诱骗受体R3、R4结合，则可使细胞逃脱TRAIL诱导的细胞凋亡。
现在实验表明正常细胞可同时表达死亡受体与诱骗受体，而肿瘤及转化细胞仅能表达死亡受体或约高于正常细胞100倍的死亡受体和低于正常细胞10倍的诱骗受体。因此TRAIL能特异性地诱导多种肿瘤细胞死亡，而对正常组织细胞无影响。许多实验已证实纯化的人TRAIL能引起白血病9D细胞和EB病毒转化的人B细胞数量明显减少；在2小时内可诱导人急性白血病Jurkat细胞、9D细胞的DNA片段化而导致细胞死亡。同样TRAIL对Burkitt’s淋巴瘤B细胞系、急性人白血病T细胞系有相同的杀伤作用。同时TRAIL对人肿瘤细胞如Hela、U937、A549和ME180人宫颈癌细胞的杀伤作用比对照显著增强。在体内，TRAIL能诱导突变的T淋巴细胞凋亡，如恶变的T细胞、HIV(爱滋病毒)感染的T细胞等。综上所述，由于TRAIL具有显著地特异性杀伤肿瘤细胞的功能，许多科学家预计，其社会效益及经济效益不可估量。
然而，目前的TRAIL仍然存在着亲和力不够高的问题。在生产过程中，其表达量也很低，只有5％(参见Wiley SR，等人，1995，“诱导凋亡的TNF家族新成员的鉴定和特性分析”，Immunity，3(6)673-682)。
因此，本领域中仍迫切需要提供一种亲和力以及表达量有所改善的TRAIL。

发明内容
为了满足上述发明目的，本发明的一个方面提供了一种分离的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白，该突变蛋白具有Ser52Asn和Trp82Gln突变。
在一个较佳的实例中，该突变蛋白具有如SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
本发明另一方面提供了一种编码本发明上述突变蛋白的DNA序列。在一个较佳的实例中，该DNA序列具有如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
本发明第三方面提供了含有本发明DNA序列的表达载体。
本发明第四方面提供了经上述表达载体转化的宿主细胞。在一个较佳的实例中，所述宿主细胞是大肠杆菌、枯草杆菌或酵母细胞。
本发明第五方面提供了一种药物组合物，该药物组合物含有药学上有效量的上述人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白以及药学上可接受的载体。
本发明第六方面提供了本发明的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白的制备方法，该方法包括a)提供一表达载体，该表达载体含有编码上述突变蛋白的DNA序列以及与该DNA序列操作性相连的表达调控序列；b)用步骤a)中的表达载体转化宿主细胞；c)在适合表达上述突变蛋白的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和d)分离纯化所表达出的突变蛋白。
本发明的优点在于上述人TRAIL突变蛋白的亲和力比天然的TRAIL蛋白更高，而且其在宿主细胞中的表达量也有所提高。本发明的其它目的和优点可通过下面的详细描述得知。
发明详述本发明提供了一种具有Ser52Asn和Trp82Gln突变的分离的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白。本文所用的术语“人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白(TRAIL)”可以是具有天然野生型序列的人TRAIL蛋白，也可以是具有突变序列的衍生型或重组人TRAIL蛋白，只要该突变序列中不包括Ser52Asn和Trp82Gln突变即可。天然的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白的氨基酸序列及其编码序列如SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示。
本发明者通过研究发现，通过将该蛋白质氨基酸序列的52位丝氨酸(Ser)和82位色氨酸(Trp)分别突变成天冬酰胺(Asp)和谷酰胺(Gln)，可使突变后的蛋白的亲和力及其在宿主中的表达量均大大提高。本文中所用的术语“Ser52Asn”和“Trp82Gln”即表示52位氨基酸由Ser变为Asn，82位氨基酸由Trp变为Gln。不希望受理论的束缚，认为上述两处氨基酸很可能构成了该蛋白质的活性中心，因此，将这两处氨基酸突变成疏水性强的氨基酸导致了该蛋白的亲和力提高。另外，还发现上述突变蛋白在宿主细胞中的表达量也得到大大提高。在本发明的一个较佳实例中，本发明的突变蛋白具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
本文所用的术语“分离的”在用于核酸或蛋白质时，表示核酸或蛋白质基本上不含其它在天然状态下相关的细胞成分，其最好呈均质状态，但也可以是干的或水溶液。纯度和均一性通常可用分析化学方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定。
本发明还提供了一种编码本发明上述肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白的DNA序列。在一个较佳的实例中，所述DNA序列具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，其中核苷酸序列中第154-156位碱基TCT和第244-246位碱基TGG分别替代了编码天然TRAIL蛋白的DNA序列中的碱基AAT和GAT。当然，本领域技术人员也可利用本领域中熟知的遗传密码的简并性获得编码上述氨基酸序列的所有其它核酸序列。
本发明的突变蛋白可通过以下方法来进行制备。首先，提供含有编码本发明突变蛋白的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。
本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。
上述编码突变型TRAIL蛋白的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段来获得，例如，根据已经公开的人TRAIL蛋白的DNA序列来合成引物进行PCR法扩增，或用诸如定点诱变、盒式诱变和聚合酶链反应(PCR)诱变等方法进行诱变。
在获得了具有定点突变后的DNA序列后，就可通过本领域熟知的各种方法将其连入合适的表达载体中。本发明中所用的表达载体是本领域技术人员已知的各种市售的表达载体，例如购自Qiagen和Promega公司的表达载体。
然后，用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是大肠杆菌、枯草杆菌或酵母细胞。
最后，在适合本发明突变蛋白表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后用离子交换层析、疏水层析和分子筛层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的新的突变蛋白。
本发明还提供了一种药物组合物，该组合物含有药学上有效量的本发明突变蛋白以及药学上可接受的载体。本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的突变蛋白相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。
下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明。
实施例1可溶性片段编码基因的人工合成将如SEQ ID NO2所示的序列及其互补链拆分成26个长度约为83～88碱基长度的寡核苷酸片段，然后人工合成。然后，利用PCR方法获得TRAIL可溶性基因片段，具体操作如下(1)反应体系在0.2毫升PCR管中加入以下各物质。
10×PCR缓冲液5微升寡核苷酸片段(100毫微克/微升) (每种)各1微升50×dNTP混合物 1微升50×TaqDNA聚合物 1微升PCP-级水 至40微升反应体积为 50微升(2)反应条件预变性94℃2分钟；主循环95℃ 1分钟，60℃ 40秒，72℃ 1分钟，循环35次；后延伸72℃ 10分钟。
观察电泳结果，并凝胶回收TRAIL全长基因片段。将回收得到的基因片段克隆于质粒pGEM-T Easy(Promega公司，Madison，WI)上并用美国ABI自动测序仪测定进行基因测序。根据测序结果鉴定出一个序列完全正确的克隆，记作TRAIL/N。
另外设计合成下列突变引物5’-TGCAGGACAAATACTCTAAAAACGGTATCGCTTGCTTCCTGAAAGAAGACGACTCTTACTGGGACCCGAACGACGAAGAATCTATGAACTCTCCGTGCTGGCAGGTTAAACAGCAGCTGCGTCAGCTGGTTCG-3’(SEQ ID NO5)突变方法采用常规T7 DNA聚合膜/Dpn I突变方案，详细操作方法见《分子克隆实验室手册》或Promega公司的使用说明。突变过程采用Promega公司的基因定点突变试剂盒进行。经测序鉴定，获得正确的突变克隆，记作TRAIL/M。
实施例2 表达载体的构建将上述TRAIL/N和TRAIL/M的DNA序列经BamHI及HindIII酶切后分别连接于原核表达载体pET32a(Qiagen公司)上。
首先，用BamHI及HindIII酶切表达质粒pET32a。在微量离心管中加入以下各物质pET32a质粒(3微克)、10×限制性酶缓冲液(3微升)、BamHI和HindIII各15单位、1毫克/毫升乙酰化BSA(3微升)，然后加入无核酸酶的水至40微升。37℃孵育4小时，以DNA标记物作为对照进行电泳，凝胶回收酶切的质粒pET32a，置于-20℃保存待用。
然后，用BamHI及HindIII酶切携带目的基因的质粒pGEM-TEasy，切下目的基因并用凝胶回收，方法同上。
随后，连接酶切表达质粒pET32a及目的基因片段。在0.2毫升PCR管中加入以下各物10×连接酶缓冲液(2微升)、100mM DTT(2微升)、10mM ATP(1微升)、50毫微克/微升上述制得的pET32a载体(2微升)、T4连接酶(0.2-0.4 Weise单位/微升，1微升)、上述制得的目的基因(0.2pmol)和无核酸酶的水，反应总体积为20微升。4℃下连接过夜。
随后，将连接构建好的质粒pET32a分别转化入大肠杆菌BL21(DE3)和AD494(DE3)(Promega公司)中。
如下方式酶切鉴定转化质粒。挑取氨苄青霉素培养皿上单个表达工程菌菌落进行扩增培养。抽提质粒，用BamHI及HindIII酶切鉴定，方法同上。酶切产物在1％琼脂糖电泳上进行鉴定，初步确定TRAIL/N有11个克隆、TRAIL/M有8个克隆带有目的插入序列。每种基因选取其中2个正确克隆进行测序，根据测序结果确认两种基因各有1个克隆的插入序列是完全正确的，分别记作pTRAIL/N和pTRAIL/M。
实施例3诱导目的基因表达及其生物活性检测a)目的基因的表达取正确克隆pTrail/N和pTRAIL/M的菌液100微升分别接种到5毫升含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB液体培养基中，37℃、300rpm振荡培养至OD值达0.4-1.0。加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度1毫摩尔/升。37℃培养3小时，从每种培养物中取出1毫升转移到离心管中，离心去上清；裂解菌体，进行SDS蛋白电泳，用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酰胺进行染色，检测目的蛋白的表达。
b)目的蛋白纯化按照上述方法在LB培养基中诱导该基因表达并经过离子交换层析、疏水层析和分子筛层析纯化，经过常规方法复性，获得纯度在92％以上的重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白。
c)表达量的鉴定如下所示，利用ELISA法鉴定表达量。在96孔板上每孔中加入50微克纯化的TRAIL蛋白按照常规方法包被，然后加入0.1毫升鼠抗TRAIL单克隆抗体(购自晶美公司)(预先稀释至1∶100)，室温下处理30分钟后，用PBS洗涤5次，然后加入1微升辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠抗体(1∶5000稀释)，37℃温育30分钟。加入DAB显色液200微升，室温下处理45分钟后在酶标仪上读取495nm处的光吸收，据此计算表达量。
结果发现其表达量高达菌体可溶性蛋白的30％以上，比Wiley SR，等人，1995，“诱导凋亡的TNF家族新成员的鉴定和特性分析”，Immunity，3(6)673-682中报道的表达量(5％)高出至少6倍。
d)活性检测在本实施例中，所用的TRAIL测活细胞株为具有自我增殖能力的对TRAIL敏感的Jarket细胞。在96孔板上每孔加入1×106细胞，培养基为FCS RPMI-1640。每孔中加入上述重组人TRAIL蛋白至200毫微克/毫升，然后在第2、4、6、8、10和12小时取样进行如下检测1)细胞计数。从上述样品中取出0.2毫升进行细胞计数，结果以存活细胞百分数表示，结果列在下表1中。
表1

从表1结果可以看出，TRAIL具有明显的杀伤Jarket细胞的作用，而突变的TRAIL比天然产物具有更强的杀伤力。这说明突变明显导致了产物亲和力的提高。
2)DNA片段检测。取出0.5毫升样品抽提DNA，并加入10％(体积)浓度为5毫克/毫升的MTT，在2％的琼脂糖凝胶电泳上进行检测。结果发现其DNA发生明显片段化，经天然型TRAIL处理的样品中大部分DNA分子集中在3～5kb大小范围，而经突变型处理的样品中大部分DNA分子集中在2～4.5kb的范围内。与未经TRAIL处理的对照(DNA分子主要集中在20～22kb)相比，两种处理均导致了DNA分子量的明显降低。上述结果说明，经过TRAIL处理后，Jarket细胞可以发生明显的DNA片段化。突变型TRAIL处理所得的DNA分子量范围比天然型处理所得的DNA分子量范围更低，说明突变型的作用更为强烈。
3)MTT检测。取经过天然型TRAIL和突变型TRAIL处理的细胞0.2毫升，加入1/10体积的浓度为5毫克/毫升的MTT溶液，37℃培养30分钟后在酶标仪上读取570nm处的光吸收。结果发现，经过TRAIL处理的细胞的光吸收明显低于未经处理的对照的光吸收。8小时后，经天然型TRAIL处理过的读数只有对照的30.6％；而经突变型TRAIL处理的比经天然型TRAIL处理的更低，8小时后的读数只有对照的11.1％。这说明本发明的TRAIL突变蛋白的亲和力有大大提高，从而使光学上读数更低。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
序列表<110>上海兰生国健药业有限公司<120>人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白、其制法及其药物组合物<130>016016<160>5<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>281<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>1Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys1 5 10 15Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala20 25 30Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys35 40 45Tyr Ser Lys Asn Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr50 55 60Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val65 70 75 80Lys Gln Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser85 90 95Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro100 105 110Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly115 120 125Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu130 135 140Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly145 150 155 160His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile165 170 175His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr 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120gtcagctggt tcg 13权利要求
1.一种分离的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白，其特征在于，它含有Ser52Asn和Trp82Gln突变。
2.根据权利要求1所述的突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白具有SEQ IDNO1所示的氨基酸序列。
3.一种分离的DNA序列，其特征在于，它编码权利要求1所述的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白。
4.根据权利要求3所述的分离的DNA序列，其特征在于，它具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
5.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的DNA序列。
6.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求5所述的表达载体转化。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌、枯草杆菌或酵母细胞。
8.一种药物组合物，其特征在于，它含有药学上有效量的权利要求1所述的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白以及药学上可接受的载体。
9.一种制备权利要求1所述的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白的方法，其特征在于，该方法包括a)提供一表达载体，该表达载体含有编码权利要求1所述的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白的DNA序列以及与该DNA序列操作性相连的表达调控序列；b)用步骤a)中的表达载体转化宿主细胞；c)在适合表达所述突变蛋白的条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；和d)分离纯化获得所表达出的突变蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述DNA序列具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种新的具有Ser52Asn和Trp82Gln突变的人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体突变蛋白，编码该突变蛋白的DNA序列，含有该DNA序列的表达载体，用该表达载体转化的宿主细胞，含有该突变蛋白的药物组合物，以及该突变蛋白的制备方法。该突变蛋白的亲和力大大高于天然蛋白，而且其在宿主细胞中的表达量也有所提高。
文档编号C12N15/63GK1417229SQ01132158
公开日2003年5月14日 申请日期2001年11月9日 优先权日2001年11月9日
发明者胡辉, 刘庆法 申请人:上海中信国健药业有限公司