专利名称：一类具有诱导癌细胞凋亡的有机胂化合物及其合成新工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类具有诱导癌细胞凋亡的有机胂化合物(2-胂酸基乙酸衍生物)及其合成新工艺。
砷广泛分布于环境中，砷在人体的代谢受其化学形式和物理性状影响，不同形态砷化合物对人体作用差别根大，以致在人体代谢过程中造成的影响也很不相同，有些表现为剧烈毒性损害，而有些则对人体健康几乎无影响。砷是国际癌研究协会1971年就已确定的人类第一组致癌物。三氧化二砷(As2O3)是一种剧毒传统中药，一方面能导致染色体异位、诱导细胞癌变，另一方面在适当剂量范围内，又具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。以往的工作已经证实As2O3可明显地诱导肿瘤细胞凋亡，参见Chen GQ，Shi XG，Tang W，et al.Use of arsenic trioxide(As2O3)in the treatment ofacute promyel ocytic leukemia(APL)I.As2O3exerts dose-dependentdual effects on APL cells.Blood，1997；89(9)3345-3353(陈国强等，三氧化砷(As2O3)治疗急性早幼粒细胞性白血病(APL)研究，《血液》，1997；89(9)3345-3353)。但对于有机砷化合物，除美拉胂醇(melarsoprol)[参见Koshiuka K，Elstner E，Williamson E，et al.Novel therapeuticapproachorganic arsenical(melarsoprol)alone or withall-trans-retinoic acid markedly inhibit growth of human breast andprostate cancer cells in vitro and in vivo.Br J Cancer，2000；82(2)452-8(Koshiuka K等，新型治疗手段有机胂(美拉胂醇)单独或与全反应式维A酸共同抑制体内外人乳腺癌细胞和前列腺癌细胞生长，《英国癌症杂志》2000；82(2)452-8)有迹象显示其抑制作用在一定程度上要强于As2O3外，尚未见任何有关有机胂对肿瘤细胞是否有诱导凋亡作用的报道。美拉胂醇最先是二十世纪五十年代用于治疗非洲锥虫病的主要药剂，在一偶然的实验中，人们意外地发现美拉胂醇具有与bcl-2蛋白表达有关的细胞溶解活性高度相关，而且可诱导细胞凋亡，但美拉胂醇因其毒性太大而使其一直未能用于临床治疗。
除无机砷外，其它非砷有机物对癌细胞分化诱导作用的研究主要集中在性激素类、维生素甲类、丁酸钠和乙酸苯酯等物质上。
随着分子生物学技术的发展，人们已认识到通过对药物的分子结构修饰来选择性诱导肿瘤细胞凋亡有可能改善肿瘤的预后，而且凋亡细胞不会引起炎症反应，参见Muller M.Drug-induced apoptosis in hepatoma cellsis mediated by the CD95(APO-1/Fas)receptor/ligand system andinvolves activation of wild-type p53.J Clin Invest，1997，99403-413，[Muller M.药物Muller M.诱导肝癌细胞凋亡的CD95受体/配体系统传递和野生型P53基因激活，《临床研究杂志》1997，99403-413]。本发明所合成的一类具有诱导癌细胞凋亡的有机胂化合物就是基于此目的的分子结构修饰药物。
本发明所涉及的是一类具有诱导癌细胞凋亡的有机胂化合物即2-胂酸基乙酸衍生物，属脂肪族胂酸类衍生物，目前涉及有机胂化合物的合成大多以芳香族胂酸衍生物为主，有关脂肪族胂酸类衍生物的合成报道较少，据文献报道(段行信《实用精细有机合成手册》北京化学工业出版社，2000.407～409)，脂肪族胂酸类衍生物的合成方法主要是将卤代烃特别是碘代烃在乙醇或水溶剂中，室温下与亚砷酸钠混合搅拌，几小时后除去未作用的原料无机砷，并通过不同阳离子脂肪族胂酸盐的转化，最终得脂肪族胂酸钠盐。
本发明提供了-类具有诱导癌细胞凋亡的有机胂化合物(2-胂酸基乙酸衍生物)的合成新工艺。其一般方法为1.将一定量三氧化二砷溶于相当于三氧化二砷6～8倍摩尔量的金属氢氧化物如氢氧化钠或氢氧化钾的热水溶液中，搅匀溶解后，加入少量催化剂季铵盐如氯(或溴)化三甲基苄基铵或氯(或溴)化三乙基苄基铵，在5～50℃温度范围内分批加入一定量2-卤代乙酸或它们的酯。
2.加毕后继续反应1-4小时，加入相当于三氧化二砷2～6倍摩尔量的有机酸一乙酸以中和并沉淀未作用的无机胂，充分静置，过滤、冷水洗涤。
3.滤液用沉淀剂可溶性钡盐如氯化钡或硝酸钡沉淀有机胂化合物，充分静置后收集并冷水反复冲洗沉淀。
4.将沉淀悬浮于热水中，搅拌下加入含有一定量助溶盐即可溶性硫酸盐如硫酸钠或硫酸钾的热水溶液中，使有机胂沉淀物完全转化为可溶性有机胂化合物，过滤，滤液经732型或Amberlite IR-120型氢型阳离子交换树脂洗淋后，浓缩洗淋液，制得2-胂酸基衍生物。
本发明合成有机胂化合物(2-胂酸基乙酸衍生物)的总体收率达79～88％。
采用本工艺可合成的化合物的名称与结构式为(I)2-胂酸基乙酸、2-Arsono-acetic acid
(II)2-胂酸基乙酸甲酯、2-Arsono-acetic acid methyl ester(III)2-胂酸基乙酸乙酯、2-Arsono-acetic acid ethyl esterH2O3AsCH2COOR(I)R＝H(II)R＝CH3(III)R＝C2H5其中化合物(I)、(III)属文献已报道的化合物，但无结构表征，(II)为新化合物。
以下是对采用本方法合成的有机胂化合物(以2-胂酸基乙酸，ASAC，为例)和三氧化二砷(As2O3)进行的检测结果对比1采用MTT法检测药物对肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用。结果表明As2O3和ASAC都对SMMC-7721有抑制作用，且抑制作用都具有剂量和时间依赖性，ASAC的抑制效果明显优于As2O3。当二者浓度为为10-6、10-7mol.1-1时，对正常血管内皮细胞几乎无毒副作用。药物作用48h，10-6mol.1-1As2O3和10-7mol.1-1ASAC相比，细胞活力降低后者明显优于前者(存在极显著差异)。当然MTT检测只是说明细胞生长受到抑制，比较药物对肝癌细胞SMMC-7721和对正常细胞VEC活力的影响，上述结果可初步判断其抑制效果是通过凋亡引起的。
2形态学观察，尤其透射电镜可定性地说明其抑制效果是否由凋亡引起。相差显微镜观察As2O3和ASAC都可诱导肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡，且具有时间和剂量依赖特性。高浓度时出现坏死，浓度较低时随着作用时间的延长也有坏死现象出现。当As2O3浓度为10-6mol.1-1和ASAC浓度为10-7mol.-1时，光学显微镜观察到只有凋亡现象。电镜观察10-6mol.1-1As2O3和10-7mol.1-1ASAC对SMMC-7721细胞作用48h后的形态，都出现典型的凋亡现象，且ASAC组还有少量坏死细胞出现，可适当降低ASAC的浓度。
3流式细胞仪检测细胞周期可定量了解细胞凋亡情况，10-7mol.1-1ASAC和10-6mol.1-1As2O3作用SMMC-7721，分别于作用后24h，48h检测，都有Sub-G1峰(凋亡峰)，在各自浓度下ASAC凋亡的能力稍胜出As2O3。细胞周期分析发现As2O3组G0/G1期细胞所占的百分比从53.7％降为41.43％，ASAC从38.59％降为34.39％。本实验研究表明，As2O3和ASAC与SMMC-7721共同孵育24h，48h可降低G0/G1期细胞所占的百分比，同时，此期细胞凋亡率均较对照组有显著升高。
4细胞DNA电泳出现梯度是细胞凋亡的最重要生化改变特征。10-7mol.1-1ASAC和10-6mol.1-1AS2O3对SMMC-7721细胞48h后DNA电泳出现典型的“梯度”图谱又进一步证实了两种药物作用的结果主要是使SMMC-7721细胞凋亡。
总之，经四甲基偶氮唑蓝颜色反应、透射电镜检测、流式细胞仪检测、核酸凝胶电泳观察和DNA断端标记法等细胞生物学实验表明这类有机胂化合物具有明显抑制癌细胞增殖的功能，抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性；它们都可诱导癌细胞如肝实质瘤细胞SMMC-7721等凋亡；在一定浓度范围内，凋亡率与有机胂化合物的作用时间呈依赖关系，且诱导凋亡的能力均强于三氧化二砷。此结果提示我们这类有机胂化合物可能会成为一种新的治疗肝癌和辅助治疗肝癌的药物，有可能利用当前的某些治疗手段将这类有机胂化合物导入人体，如可作为肝动脉插管的治疗药物之一，诱导细胞凋亡，为手术创造机会；或可腹内注射药物，以减少腹水等。
下面是本发明的具体实施例。
实施例1准确称取12克氢氧化钠溶于50ml水溶液中，趁热加入10克三氧化二砷，搅匀溶解后，加入少量催化剂氯化三甲基苄基铵；用冰水冷却至20℃以下，搅拌下分批加入5克2-氯代乙酸；加毕后20℃下继续反应2.5小时。加入冰醋酸以中和并沉淀未作用的无机胂，有白色沉淀产生，冷却、充分静置，过滤、冷水洗涤；洗液与滤液合并并用20克沉淀剂氯化钡沉淀有机胂化合物，充分静置过夜，收集并冷水反复冲洗沉淀；将沉淀悬浮于热水中，搅拌下加入含有10克助溶盐硫酸钠的热水溶液中，使有机胂沉淀物完全转化为可溶性有机胂化合物，过滤，滤液经氢型阳离子交换树脂732洗淋后，浓缩洗淋液，制得2-胂酸基乙酸。收率88％，m.p.148-150℃，文献值148-150℃，参见ГамаюроваВС.КОНСТАНТЫИОНИЗАЦИИАЛКИЛ-，АРИЛАРСОЦОВЫХ И АРСИНОВЫХ КИСЛОТВЛИМЕТИЛФОРМАМИДЕ.Журнал общей химии，1976，46(9)2073～2077.[ГамаюроваВС等。烷基及芳基胂酸和亚胂酸在二甲基甲酰胺中的电离常数，普通化学杂志，1976，46(9)2073～2077.]元素分析C2H5O5As计算值 C13.04，H2.72，实测值C13.31，H2.56。IR(cm-1)3300-3100(VO-H)、2925(VC-H)、1703(VRCOOH)、1120(VAs＝0)；HNMR(ppm)δ2.25(2H，s，CH2)。MS(EAB)，184(M+，15.6)。
实施例2准确称取12克氢氧化钠溶于50ml水溶液中，趁热加入10克三氧化二砷，搅匀溶解后，加入少量催化剂氯化三甲基苄基铵；用冰水冷却至20℃以下，搅拌下分批加入5.7克2-氯代乙酸甲酯；加毕后20℃下继续反应2小时。按实施例1类似方法精制处理，制得2-胂酸基乙酸甲酯。收率81％，m.p.111-112℃。元素分析C3H7O5As计算值C18.18，H3.54，实测值；C18.01，H3.39。IR(cm-1)3310-3150(VO-H)、2915(VC-H)1740(VRCOOR)、1118(VAs＝O)；HNMR(ppm)δ2.27(2H，s，CH2)、3.81(3H，s，CH3)。MS(EAB)，198(M+，19.2)。
实施例3准确称取12克氢氧化钠溶于50ml水溶液中，趁热加入10克三氧化二砷，搅匀溶解后，加入少量催化剂氯化三甲基苄基铵；用冰水冷却至20℃以下，搅拌下分批加入8.5克2-溴代乙酸乙酯；加毕后20℃下继续反应3小时。按实施例1类似方法精制处理，制得2-胂酸基乙酸乙酯。收率79％，m.p.124-125℃，文献值124-126℃，参见Гамаюрова ВС.КОНСТАНТЫ ИОНИЗАЦИИ АЛКИЛ—，АРИЛАРСОНОВЫХ И АРСИНОВЫХКИСЛОТ В ДИМЕТИЛФОРМАМИДЕ.Журналобщей химии，1976，46(9)2073～2077.[ГамаюроваВС等。烷基及芳基胂酸和亚胂酸在二甲基甲酰胺中的电离常数。普通化学杂志，1976，46(9)2073～2077.]。元素分析C4H9O5As计算值C22.64，H4.24，实测值C22.15，H4.47。IR(cm-1)3320-3120(VO-H)、2935(VC-H)、1745(VRCOOR)、1117(VAs＝O)；HNMR(ppm)δ2.25(2H，s，CH2)、4.05(2H，q，J＝7Hz，CH2)、1.25(3H，t，J＝7Hz，CH3)。MS(FAB)，212(M+，10.9)。
权利要求
1.一类具有诱导癌细胞凋亡的有机胂化合物(2-申酸基乙酸衍生物)的合成新工艺，包括如下步骤(1)三氧化二砷溶于含碱的热水溶液中，搅匀溶解后，加入少量催化剂，在一定温度范围内分批加入2-卤代乙酸或它们的酯；(2)加毕后继续反应几小时，加入一定范围量的有机酸以中和并沉淀未作用的无机胂，充分静置，过滤、冷水洗涤；(3)滤液用沉淀剂沉淀有机胂化合物，充分静置后收集并冷水反复冲洗沉淀；(4)将沉淀悬浮于热水中，搅拌下加入含有一定量助溶盐的热水溶液中，使有机胂沉淀物完全转化为可溶性有机胂化合物，过滤，滤液经氢型阳离子交换树脂洗淋后，浓缩洗淋液，制得2-胂酸基乙酸衍生物。
2.如要求1所述的合成新工艺，其特征在于三氧化二砷和碱的摩尔比为1∶6～8，其中碱是指碱金属氢氧化物。
3.如权利要求1所述的合成新工艺，其特征在于催化剂为季铵盐，季铵盐为氯/溴化三甲基苄基铵或氯/溴化三乙基苄基铵。
4.如权利要求1所述的合成新工艺，其特征在于步骤(1)的加料温度范围为5～50℃，步骤(2)的继续反应时间为1～4小时。
5.如权利要求1所述的合成新工艺，其特征在于步骤(2)的中和用有机酸为乙酸，其添加摩尔量为三氧化二砷的2～6倍。
6.如权利要求1所述的合成新工艺，其特征在于步骤(3)用的沉淀剂为可溶性钡盐，可溶性钡盐为氯化钡或硝酸钡。
7.如权利要求1所述的合成新工艺，其特征在于助溶盐为可溶性硫酸盐。
8.如权利要求9所述的合成新工艺，其特征在于可溶性硫酸盐为硫酸钠或硫酸钾。
9.如权利要求1所述的合成新工艺，其特征在于其中氢型阳离子交换树脂是指磺化交链聚苯乙烯类型如732、Amberlite IR-120。
10利用权利要求1所述的工艺合成的一类具有诱导癌细胞凋亡的有机胂化合物，其名称和化学结构式分别为(I)2-胂酸基乙酸、2-Arsono-acetic acid(II)2-胂酸基乙酸甲酯、2-Arsono-acetic acid methyl ester(III)2-胂酸基乙酸乙酯、2-Arsono-acetic acid ethyl esterH2O3AsCH2COOR(I)R＝H (II)R＝CH3(III)R＝C2H
全文摘要
本发明涉及一类具有诱导癌细胞凋亡的有机胂化合物(2-胂酸基乙酸衍生物)及其合成新工艺。这类衍生物为2-胂酸基乙酸、2-胂酸基乙酸甲酯、2-胂酸基乙酸乙酯等。细胞生物学实验表明:这类有机胂化合物都可诱导癌细胞如肝实质瘤细胞SMMC－7721等凋亡,且诱导凋亡的能力强于三氧化二砷,有望成为一种新的治疗癌症的新型药物。
文档编号C07F9/72GK1337400SQ01108750
公开日2002年2月27日 申请日期2001年8月17日 优先权日2001年8月17日
发明者王建华, 王远亮 申请人:重庆大学