一种抗癌活性蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物药物领域，具体涉及一种抗癌活性蛋白及其应用。
【背景技术】
[0002] 癌症是人类健康的大敌，世界范围内每年有数以千万计的病人遭受癌症的折磨。 癌细胞的重要特点就是丧失凋亡能力，增殖加速、失控。在发展中国家，宫颈癌发病率排在 妇科肿瘤的首位，估计世界上每年约有50万妇女罹患宫颈癌。开发和利用高疗效低副作用 的药物治疗这种疾病是肿瘤学和妇科学研究工作者面临的重大挑战。近几十年来，许多相 关研究工作者一直在竭力探究癌基因影响细胞生理生化过程的机制，寻找能够诱导癌细胞 凋亡，抑制其异常增殖的试剂或方法。由于有毒动物(如蛇、蝎、蟾蜍和蜘蛛等)来源的天然 毒素中富含具有细胞毒性和抗癌活性的成分，从而成为受人关注的筛选抗癌药物前体分子 的宝贵资源。
[0003] 目前普遍认为，抗癌药物的抗肿瘤效应主要是基于其诱导细胞凋亡、阻断细胞DNA 合成、导致细胞DNA损伤和阻断细胞有丝分裂等的作用。有鉴于此，半个多世纪以来，许多研 究都集中在利用细胞毒性试剂用于治疗癌症的可能性。很多动物的毒液被证明对来自人宫 颈癌细胞系的HeLa细胞具有毒性，提示其中含有抗宫颈癌的活性成分，可以用来作为筛选 抗宫颈癌药物的前体分子。
[0004] 文献调研表明，蛇毒抗癌活性的研究最为广泛。多种蛇的毒液或其蛋白质活性成 分被证明对包括HeLa细胞在内的癌细胞具有抑制作用。蝎毒对He La细胞的作用则因蝎毒的 来源不同而呈现一定的差异。蟾蜍毒液也被实验证明含有较强细胞毒性和抗癌活性的成 分。相对而言，蜘蛛毒腺毒液抗癌活性成分研究的报道较少。但如发明专利申请 200510120779.1提供了一种蜘蛛毒注射液，它含有活性蜘蛛毒素和注射用溶液。制备时包 括以下步骤:1)取活性蜘蛛冻干粉加入适量注射用溶液，轻轻振摇溶解，然后加入注射用溶 液稀释至〇. 5mg~5mg/100ml; 2)分装于灭菌过的容器中，1~6°C的低温保存备用。该发明提 供的蜘蛛毒注射液主要用于治疗风湿和类风湿、三叉神经痛和坐骨神经痛等神经疼痛，还 可用于各种原因引起的机体免疫机能减退及多种癌症。其中，蜘蛛毒取自成年蜘蛛的毒腺， 具体可以从虎纹捕鸟蛛、敬钊缨毛蛛、智利蜘蛛、黑寡妇蜘蛛、美国漏斗网蛛、漏斗网蛛、黑 腹栉足蛛或狼蛛的毒腺中获取。
[0005] 另外，黄新、王勤等人发表的《蜘蛛毒素的细胞毒作用研究进展》中也公开蜘蛛毒 腺毒素用于抑制癌细胞的研究，如有将雷氏大尤蛛毒素应用于人子宫颈HeLa细胞，蜘蛛毒 素在10~40mg/L的浓度里能有效地抑制细胞的增殖，并且有良好的量效和时效关系，形态 学上可见细胞凋亡和坏死，而细胞凋亡是caspase-3的上调引起的。
[0006] 但在抗癌尤其是抑制HeLa细胞的增殖方面，本领域还可以做出进一步的努力，以 使得抗癌药的来源更为广泛和多样，或使得药物的抗癌效果更优。
【发明内容】
[0007] 本发明从黑寡妇蜘蛛幼蛛提取物中分离纯化出一种具有抗癌活性的蛋白质。该活 性蛋白的分子量约为23kDa，已测定出其编码基因的核苷酸序列和蛋白质的全部氨基酸序 列。该活性蛋白能诱发HeLa细胞凋亡，抑制HeLa细胞增殖，可用于抗癌药物的开发。
[0008] 具体地，本发明提供一种抗癌活性蛋白，所述蛋白是从黑寡妇蜘蛛的幼蛛中提取 得到的分子大小为20~25KDa的蛋白质。
[0009 ]与文献报道的抗癌活性成分都来自动物的毒腺不同，本发明分离纯化的抗癌活性 成分来自黑寡妇蜘蛛的幼蛛，本领域技术人员可知蜘蛛幼蛛中并不存在能产生毒素的毒 腺，但发明人发现在目前世界上已知毒性最强的蜘蛛之一黑寡妇蜘蛛的幼蛛中能提取出抗 癌活性蛋白。且提取得到的该抗癌活性蛋白与黑寡妇成蛛毒腺中分泌的毒素具有完全不同 的结构和性质。具体地，通过分析SDS-PAGE图谱可知，该蛋白不存在于黑寡妇蜘蛛的成蛛体 内，包括不存在于成蛛的毒腺中，即幼蛛长大后该蛋白将消失。且该蛋白不存在于其它品种 的蜘蛛幼蛛中，而仅在黑寡妇蜘蛛的幼蛛中发现并分离纯化得到。
[0010]在一种具体的实施方式中，所述蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1所示。
[0011]在另一种具体的实施方式中，所述蛋白为在SEQ ID NO: 1所不氣基酸序列的基础 上进行修饰或改造而得到的蛋白质突变体。
[0012] 在另一种具体的实施方式中，所述蛋白为与SEQ ID NO: 1氨基酸序列相似度在 80%以上且与SEQ ID NO: 1表示的蛋白质具有相同功能的蛋白质。所述与SEQ ID NO: 1氨基 酸序列相似度在80%以上的蛋白例如为由数据库中搜索或常规突变方法得到。所述数据库 为基因数据库或蛋白质数据库。具体例如通过采用常规方法对非关键氨基酸进行等同替换 或去除，得到一种功能与SEQ ID N0:1所示蛋白具有同等功能(对HeLa癌细胞具有相同或相 近的抑制活性)的蛋白质突变体。
[0013] 在一种具体的实施方式中，所述抗癌活性蛋白为自天然材料中提取或以分子生物 学表达得到。
[0014]本发明还提供一种如上所述蛋白在制备抑制HeLa癌细胞的药物中的应用。
[0015] 本发明还提供一种核苷酸序列，所述序列为如下序列a)~c)之一：
[0016] a)所述核苷酸序列为如SEQ ID N0:2所示的序列；
[0017] b)与SEQ ID NO: 2具有90%以上同源性且与其编码相同功能蛋白质的核苷酸序 列；
[0018] c)能与序列a)或序列b)杂交的核苷酸序列。
[0019] 本发明提供的活性蛋白能通过阻滞细胞周期、激活细胞凋亡关键酶等机制抑制 HeLa细胞增殖，诱发HeLa细胞凋亡。由于本发明相应提供了它的编码基因序列，为大规模的 基因异源表达和样品制备提供了方便，为该蛋白用于抗癌药物的开发提供了前提条件。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明提供的抗癌活性蛋白PP23对HeLa细胞增殖的影响，
[0021]图2为本发明提供的抗癌活性蛋白PP23对细胞凋亡关键酶caspase 3活性的影响。
【具体实施方式】
[0022]本发明采用分子筛层析、离子交换和反相HPLC相结合的技术从黑寡妇蜘蛛幼蛛的 提取物中分离纯化出一种活性蛋白，将其命名为PP23。
[0023]该蛋白可以从天然材料提取和分子生物学表达两种途径获取，但由于天然材料的 来源有限，我们已克隆该基因并异源表达成功。
[0024] 实施例1
[0025]实施例1描述本发明所述蛋白质PP23的制备方法。
[0026] -、该蛋白来自于天然材料的提取步骤：
[0027] 1)剥开黑寡妇蜘蛛卵囊获取幼蛛，在50mmol/L PBS缓冲液中研磨后4°C下1000 Og 离心10min，取上清。重复三次，合并上清得到幼蛛提取液。
[0028] 2)用截留分子量10000的超滤管超滤，取分子量>10000的部分。
[0029] 3)利用分子筛层析将蛋白质混合物进行分级分离，得到几个不同的级分。
[0030] 4)SDS-PAGE检测目标蛋白质所在的级分。
[0031] 5)取