专利名称：一种抗癌物质的应用及其生产方法
技术领域：
本发明涉及医药卫生领域，即一种具有抗癌作用的物质在癌症治疗中的应用及其生产方法，即本发明是关于一组具有显著抗癌活性的物质—特异支链脂肪酸在癌症治疗中的应用及其用特异菌株经工业化生产含特异支链脂肪酸的方法。
癌症是威胁人类健康与长寿的最严重的疾病。目前人类对癌症的治疗主要采取手术疗法，化学疗法(以下称化疗)与放射性疗法(以下称放疗)。但化疗和放疗在抑制癌细胞生长或杀死癌细胞的同时，对人体都有一定的毒副作用。因此，人们正在广泛研究，以便找到一种毒副作用小而有效的抗癌物。
1987年本发明人在培养K562白血病细胞时，偶然发现有一个培养瓶中污染上细菌，48小时后K562白血病细胞全部消失。于是将这污染的细菌分离纯化后，以大豆为主要原料的培养基，加上适当的无机盐进行培养。用其培养液(又称发酵液)进行动物试验，发现它果然能有效地抑制肿瘤生长，而且对正常细胞没有毒副作用。十年来经大量的癌症病人，其中有白血病病人、舌癌病人、直肠癌病人、乳腺癌病人、前列腺癌病人、肺癌病人、黑色瘤病人、肾癌病人、食道癌病人、胰腺癌病人、胃癌病人和肝癌病人等服用这种发酵液后病情得以缓解，或肿瘤缩小，以致消失，不少病人至今还健康地活在人世间。到底发酵液中是哪个活性物质在起抗癌作用？本发明人对发酵液进行各方面的研究，从中分离出许多单物质。最后证实了，除来自大豆的染料木素(Genisten)、大豆黄酮(Daidzen)、大豆皂甙(Saponin)有一点抗癌活性外，主要是来自发酵物中的十三甲基十四烷酸和十二甲基十四烷酸起关键作用。进而又发现，除了十三甲基十四烷酸和十二甲基十四烷酸外，一组特异支链脂肪酸均有抑癌作用，特别是碳元素超过11的那些支链脂肪酸，都具有很明显的抗癌作用；同时也发现，利用富含特异支链脂肪酸的菌种进行发酵或培养出的产物也同样具有抗癌活性。
到目前为止尚未有人将支链脂肪酸作为抗癌物质进行过任何研究，也没有人提出过利用富含特异支链脂肪酸的菌种进行工业化发酵生产的产品，可用于治疗癌症。
本发明的目的是为了揭示这一组特异支链脂肪酸所具有的显著抗癌活性，并用一系列的生物化学和形态学的实验材料，以证实这组特异支链脂肪酸能引起癌细胞程序性自行死亡的抑制肿瘤生长机理更重要的是为证实这组特异支链脂肪酸不会杀伤正常细胞，对人与动物均无毒性，从而用于人或动物癌症患者的治疗和康复。
本发明揭示了一组对人和动物具有显著抗癌活性的特异支链脂肪酸及其生产方法。该组支链脂肪酸对各种癌细胞的作用机理是引起癌细胞程序性自行死亡(apoptosis)，对正常的人体细胞、动物和人均无毒副作用。本发明所涉及的这类支链脂肪酸的生产方法包括用化学合成或生物合成生产特异支链脂肪酸的方法，所述的生物合成是指采用富含特异支链脂肪酸的特异菌种发酵的方法。本发明所涉及的含特异支链脂肪酸的发酵产物，不仅对人和动物有明显抗癌作用，而且还具有提高免疫力，保护肝、肾等功能。本发明中特异支链脂肪酸的定义本发明所指的特异支链脂肪酸，系指具有抗癌活性的一组饱和的和不饱和的支链脂肪酸。
饱和的特异支链脂肪酸的化学结构为
式中n和m为独立的整数，(n+m)值为0～46，特别是m为0或1，n为7～16。又可表示为iso-C171 ω9c。本发明还包括所说的饱和的和不饱和的支链脂肪酸的药用盐，它可通过与无机碱，如如氢氧化纳反应获得，具有抑制癌细胞生长的作用。
本发明的不饱和的支链脂肪酸若用上式表达，其中m或n至少为2，而且(CH2)m或(CH2)n中至少有一个(CH2-CH2)基团改为(CH＝CH)基团。
本发明中用“iso-Cx”表示含有X个碳的饱和支链脂肪酸，且上式中的n＝X-4，m＝0。用“anteiso-CX”用于简称含X个碳，并且n＝X-5，m＝1。例如，13甲基十四烷酸可用iso-C15，分子式为
12甲基十四烷酸可用anteiso-C15来简称，它的结构式如下
15甲基十六碳烯是不饱和的支链脂肪酸的例子，其分子式为
又可表示为iso-C17∶1 ω9c本发明还包括所说的饱和的和不饱和的支链脂肪酸的药用盐，它可通过与无机碱，如如氢氧化纳反应获得，具有抑制癌细胞生长的作用。
本发明还揭示了饱和以及不饱和特异支链脂肪酸的药用的脂蛋白，它可以通过与蛋白质，包括多肽和寡肽结合而获得，具有抑制癌细胞生长的作用。这种脂蛋白结合是一般的技术。
本发明所指的特异支链脂肪酸可以，但不限于，从特异菌株的发酵物或培养物中分离获得，或通过化学合成，或从自然界生物体中提取。特异支链脂肪酸引起癌细胞程序性自行死亡的验证实验特异支链脂肪酸引起癌细胞程序性自行死亡(apoptosis)由三种方法测定1)用光学显微镜观察代表程序性自行死亡的形态学变化；2)用流式细胞计量仪(flowcytometry)识别正在程序性自行死亡的细胞；3)用原位细胞死亡检测试剂盒POD(insitu cell death detection kit，POD)，在单细胞水平上，监测程序性自行死亡引起的DNA断裂。1.形态学实验癌细胞程序性自行死亡的形态特点是细胞皱缩，染色质缩合成致密的块状物质，细胞核也会分裂成片段，细胞膜起泡，大量形成凋亡小体。
图1表示光学显微镜下正在自行死亡的癌细胞的形态改变。用iso-C15(60μg/ml)处理人肝癌细胞SNU-423 24小时试验组(图1B)，与未处理的对照组(图1A)相比，可看出细胞整体发生皱缩。用anteiso-C15(60μg/ml)处理人胃癌细胞SNU-18小时后，用HE染色来观察细胞的形态(图2B)，与未处理的对照组(图2C)相比，可以发现染色质凝聚成块状。人的前列腺癌细胞DU-145用iso-C15(60μug/ml)处理8小时后，用HE染色观察细胞形态(图3B)，与未处理的对照组(图3A)相比，可看到细胞膜上起泡。2.流式细胞计量仪实验本实验采用流式细胞计FACScan和分析软件Consort 30，(Becton Dickinson，SanJose，CA)，并用自行死亡试剂盒(apoptosis detection kit，R & D Systems)定量测定正在自行死亡的细胞数，因为正在自行死亡的细胞能与Annexin V相结合而排斥PI。实验的细胞用冷却的PBS洗两遍后再悬浮在结合缓冲液中，然后将经过荧光标记的annexinV和PI加到细胞中。自行死亡后期的细胞和坏死细胞的细胞膜已破坏，因而细胞DNA将与PI结合。加染料的细胞立即送流式细胞计量仪分析，细胞计量仪发出488nm的单束激光，由信号检测器FL1和FL2分别接受染料annexiaV和PI所发出的信号。于是在FL1/FL2图上将会出现三类细胞活细胞，两种染料均染不上(3区)；坏死细胞及自行死亡后期细胞，两种染料均染上(2区)，正在自行死亡的细胞，只染上annexinV(4区)。
每次试验至少分析104个细胞。未处理的人白血病K562的FL1/FL2细胞计数图(图4A)表明，这些活细胞分布在3区。而当细胞用iso-C15(30μg/ml)处理24小时后，大量的细胞在处于自行死亡中(图4B，4区，annexinV阳性和PI阴性)。图5A、5B、5C显示anteiso-C15作用于人乳腺癌细胞MCF-7，0、4、24小时的动态特性，当anteiso-C15(60μg/ml)处理4小时后，大量细胞处于自行死亡(图5B，4区)，而处理24小时后，绝大部分细胞都已死亡(自行死亡的后期，图5C，2区)。流式细胞计对未处理的正常人PBL分析结果(图6A)及对用iso-C15(60μg/ml)处理24小时的正常人的PBL分析结果(图6B)表明，它们的FL1/FL2图几乎相同(3区，活细胞，未自行死亡)，它说明iso-C15对正常人的淋巴细胞没有影响。3.在单个细胞水平上检测细胞程序性自行死亡的实验本实验用原位细胞死亡检测试剂盒POD(ENZO Diagnostics，Inc.Cot No.1684817)，其测试原理是基于细胞在程序性自行死亡时，基因组DNA的切割可以得到双键小分子量的DNA片段(即单核小体和寡核小体)以及单键断裂(“切口”)大分子量的DNA，利用DNA聚合酶和未端脱氧核苷酸转移酶(TdT)，可以使标记的核苷酸和断裂的DNA键在原位结合起来，称作TUNEL技术(TdT介导的dUTP切口端部标记)。TUNEL技术标记自性死亡细胞比标记坏死细胞敏感得多，因而可以区别自行死亡与坏死细胞。本实验步骤按试剂盒出示的操作流程图进行。实验样品有K562、SNU-1、MCF7、H1688、PBL，样品统一用iso-C15(60μg/ml)处理。其中SNU-1胃癌细胞加TUNEL反应混合物37℃下培养60分钟，样品经BPS洗三遍后直接用荧光显微镜进行分析。图7B是处理8小时的SNU-1人胃癌细胞，与对照组图7A比较，可观察到数点自行死亡细胞发出的荧光点。H1688、K562、DU145癌细胞以及人的正常外周血淋巴细胞PBL加POD酶抗体(抗荧光素抗体)在37℃下再培养30分钟，PBS洗3遍，用AEC作为底物显色10分钟，然后水洗，封片，即可在光学显微镜下观察到呈现红色的自行死亡细胞。图8B是处理2小时的K562人白血病癌细胞，与对照组图8A比较可见到已有小部分的细胞开始凋亡(呈红色的细胞)。图8C是处理4小时的K562细胞与图8B比较凋亡的细胞数量明显增多。图9B是处理8小时的H1688人肺癌细胞与对照组图9A比较，可见到相当多的呈瑰红色的细胞，表明这些细胞正在凋亡。图10B是处理8小时的DU145人前列腺癌细胞，与对照组图10A比较可见到有部分的细胞在自行死亡。图11B是处理8小时的PBL人的外周血淋巴细胞，与未处理的对照组图11A比较几乎一样，说明iso-C15对正常的人体细胞不作用。
以上例子只是为了便于说明，本发明所揭示的特异支链脂肪酸及其同类物的种类不限于上述几种，对有作用的癌细胞种类不限于上述几种细胞系。ID50、ID75和ID90的测定样品十三甲基十四烷酸(iso-C15)系用特异菌株嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotropbomonasmaltophilia)Q-Can菌种及本专利方法生产的发酵液中，用高压液相层析(HPLC)提取的，样品是用NaOH溶液和0.5％吐温-80溶解，pH＝7.5。
细胞系K562人白血病细胞；MCF人乳腺癌细胞；SNU-1人胃癌细胞；DU145人前列腺癌细胞；SNU-423人肝癌细胞；HCT116人直肠癌细胞；H1688人肺癌细胞；PBL人的外周血正常淋巴细胞。所有七种癌细胞均由美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)购得；PBL人的正常细胞是从健康人的全血中分离出来。
癌细胞按ATCC要求进行培养K562人白血病细胞和SNU-1人胃癌细胞悬浮培养在添加10％热灭活胎牛血清的RPMI1640培养基中。
MCF人乳腺癌细胞和DU145人前列腺癌细胞贴壁培养在添加10％热灭活胎牛血清的MEM培养基中。
SNU-423人肝癌细和H1688人肺癌细胞贴壁培养在添加10％热灭活胎牛血清RPMI1640培养基中。
HCT116人直肠癌细胞贴壁培养在添加10％热灭活胎牛血清的McCoy’s 5a培养基中。
人的PBL细胞保存在添加同一个人的10％血浆的RPMI1640培养基中。
方法上述细胞除PBL以105/孔密度外，其余均为5×104/孔的密度加入到96孔培养板上，实验药品(用培养基稀释母液)加入使终浓度为0～60μg/ml七个台阶(0、0.15μg/ml、3μg/ml、6μg/ml、15μg/ml、30μg/ml、60μg/ml)，对照组是一组未处理，一组加溶剂处理。贴壁细胞(SNU-423、H1688、MCF、DU145和HCT116)在37℃培养48小时后，先除去上清液，将单层细胞用EDTA-胰蛋白酶消化成均匀的细胞悬浮液，然后用4％台盼兰排除法测定存活率。悬浮生长的细胞(K562、SNU-1和PBL)在37℃培养48小时后可直接从孔中取出细胞计算存活率。
每一种细胞的ID50、ID75和ID90是通过每一组实验重复两次求得，每一次实验要在相同条件下重复三次，ID50、ID75和ID90定义为杀死50％、75％和90％细胞所需要的剂量(与未处理的对照组细胞对比)，用根据周氏父子(Dr.T.C.Chou)中效定理编制的专用软件CalcuSyn(Biosoft，Cambridge，UK)进行计算，结果如下
表1.iso-C15对人的癌细胞和正常细胞体外杀伤剂量细胞 种类 杀伤剂量ID50(μg/ml) ID75(μg/ml) ID90(g/ml)MCF 人乳腺癌10.03±0.9715.99±1.2825.49±1.68K562人白血病癌 11.45±1.8222.27±4.6043.57±6.71DU145人前列腺癌 13.98±2.1540.43±5.7281.87±8.85H1688人肺癌细胞 15.08±1.9235.03±3.5961.37±8.06HCT116 人直肠癌18.49±6.2367.96±8.25108.65±13.35SNU-1人胃癌 20.77±2.4747.43±4.9580.49±10.03SNU423 人肝癌 24.26±3.9870.46±9.36120.77±15.83PBL 人正常淋巴细胞＞400从表1中可看出iso-C15对各种肿瘤细胞均有活性，其中对人的乳腺癌MCF细胞和对人的白血病K562细胞作用最强，而对人肝癌细胞SNU423和人的直肠癌细胞HCT116作用较弱些，。但是在远远超过癌细胞致死的剂量下仍对人的正常淋巴细胞没有毒性。
以上例子只是为了便于说明，本发明所揭示的特异支链脂肪酸及其同类物的种类不限于iso-C15，对有作用的癌细胞种类不限于上述几种细胞系。特异支链脂肪酸的生产方法本发明提出了具有抗癌活性的特异支链脂肪酸的生产方法。
本发明的特异支链脂肪酸可以从天然资源中提取，包括但不限于含特异支链脂肪酸的有机体，如动物脂肪或绿色植物的叶绿醇。
本发明的特异支链脂肪酸还可以用化学或生物方法合成。支链脂肪酸的科尔比(kolbe)电解合成技术是众所周知的，下面以iso-C15的电解合成为例说明。本发明的特异支链脂肪酸生物合成方法，是利用细胞脂肪中富含特异支链脂肪酸的特异菌株发酵或培养。1.13-甲基十四烧酸的电解合成的方法13-甲基十四烷酸可根据科尔比电解反应原理，用异戊酸和十二烷酸单甲酯，在甲醇溶液中通过电解合成的。
十二烷二酸二甲酯是通过含5％(w/v)浓硫酸的5倍量(v/w)甲醇，将十二烷二酸酯化来制备的。将此二甲酯在真空蒸馏提纯后，用理论等量的氢氧化钾在无水甲醇中转化成单酯。十二烷酸单甲酯通过真空蒸馏提纯。
电解偶合反应，是用单酯与2倍分子量的异戊酸，在含甲醇钠的无水甲醇中，通过两个连接到可调直流电源上的10cm2铂电极，维持适当电压进行电解反应。当溶液呈现碱性时，说明反应完成。
反应完成后，将反应混合物冷却至室温，过滤除去沉淀的副产物十二烷二酸二甲酯。滤出液用乙酸酸化，减压蒸除甲醇并通过真空分馏提纯13-甲基十四烷酸甲酯。
最后，在过量的10％NaOH水溶液和甲醇中，通过回流使13-甲基十四烷酸甲酯水解。得到的白色固体由真空蒸馏提纯，在丙酮中重结晶，真空干燥，得到13-甲基十四烷酸白色晶体，熔点51～52℃。
本例是为说明问题，本发明的合成方法涉及的特异支链脂肪酸种类及化学合成方法不限于此。2.含特异支链脂肪酸的发酵液的生产方法本发明所说的富含特异支链脂肪酸的发酵液的生产方法包括下述步骤。
现以嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotorphomonas maltophilia)Q-can菌株作为生产菌株来叙述富含特异支链脂肪酸的发酵液的生产方法。
这个生产菌株，即嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)Q-can菌株，现已保存在美国典型培养物保藏中心(ATCC10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209)保藏号为ATCC 202105。ATCC对该菌种特性鉴定如下细胞形态为游动、无芽孢、革兰氏阴性、需氧杆菌。菌落形态如下在ATCC#3培养基(营养琼脂上培养24小时，菌落为I型，-90％圆形(直径约1mm，边缘整齐，隆起，表面粗糙，半透明，浅黄米色；II型为小圆形(直径＜1mm)，边缘整齐，隆起，半透明光滑，颜色较I型菌落深。菌落在ATCC#18(T--大豆琼脂)#44(BHI琼脂)、及#260(绵羊血琼脂)培养基上显示出相同特性。两种菌落性质相同。
嗜麦芽寡养单胞菌Q-can菌株的细胞脂肪酸组成如下脂肪酸(占总脂肪酸％)直链脂肪酸*支链脂肪酸**10∶00.48i11∶03.2114∶03.14i13∶00.5015∶00.33i15∶039.3416∶05.52a15∶07.4416∶1ω9c3.37i15∶11.0216∶1ω7c12.58 i16∶00.88羟基酸 i17∶03.6830H-10∶00.12i19∶00.3330H-i11∶0 1.51i17∶1ω9c5.2730H-i12∶0 2.6830H-i13∶0 3.5720H-13∶00.29*冒号左侧为碳原子个数，右侧为双键个数。
**i＝异脂肪酸，a＝前异脂肪酸因为细菌的脂肪酸组成受生物合成条件影响(温度和pH等)，所以以上数据只是一组典型数据。
首先，在斜面琼脂培养基上培养种子24小时，然后接种到烧瓶中的液体培养基中，在摇床上培养24小时。接着将烧瓶中的培养液接种到种子罐中，接种比例为0.1～0.5％(w/w)。经过种子罐发酵24小时后，将培养液移到生产罐中发酵48小时，并通入无菌空气。一般来说，从种子罐到生产罐的放大比约为10。培养条件为通气量1∶0.6～1.2(质量∶空气)v/v，min，搅拌速度的180～260转/分，温度为28～38℃。培养结束后，将培养液在100℃下高压消毒30分钟，然后将液体收集、装瓶，在120℃下高压消毒。这样得到的产品是供人饮用的普通口服液。
用不同的方法还可得到另外的产品，如培养结束后，在培养液中加入一定量的盐酸，使pH降到3～4，在100℃高压消毒30分钟，冷却后离心。得到的上清液中主要成分是大豆皂苷(saponin)，可调成各种口味的营养饮料。在沉淀中加入相同体积的95％乙醇和相同体积的2N NaOH，搅拌并加热至100℃，冷却离心后，将上清液收集待用，在余下的沉淀中加入相同体积的IN HCl，并加热80℃ 5分钟。冷却离心后，收集上清液。将两次收集的上清液合在一起，将pH调到9.0，它就是浓缩的口服液。产品含有特异支链脂肪酸尤其是iso-C15(以钠盐形式存在)，另外还有Saponin、daidzin、genistein，及其它抗癌物质。我们还可采用另外方法。或在培养结束后，直接将培养液喷雾干燥，形成粉未产品，然后将粉未装成胶囊或压成片剂。或用乙醇、乙醚之类有机溶剂及普通的提取脂肪酸的方法从发酵液中分离出特异支链脂肪酸，制成主要成分为支链脂肪酸钠盐的针剂。或用各种提取柱，如离子交接柱或树脂柱，直接从发酵液提取有效成分，然后再制成供癌症病人用的针剂、粉未或口服药。
每500ml Q-can口服液中脂肪酸的典型含量如下直链脂肪酸*支链脂肪酸**10∶0 2.0-2.7mgi11∶0 11.2-15.4mg12∶0 2.9-4.0mgi15∶0 106.0-145.8mg14∶0 13.0-17.7mg i16∶0 3.1-4.3mg15∶0 2.8-3.8mgi17∶0 12.4-17.0mg16∶0 251.7-346.1mgi19∶0 2.2-3.0mg17∶0 2.9-4.0mga15∶0 23.4-32.1mg18∶0 75.6-104.0mg i17∶1ω9c 4.1-5.7mg20∶0 5.5-7.6mg12∶1ω8c 4.3-5.9mg羟基酸16∶1ω7c 21.0-28.9mg 30H-i11∶0 6.3-8.6mg18∶1ω9c 488.8-672.0mg30H-12∶0 12.0-16.5mg18∶2ω6c 825.9-1135.6mg 30H-i13∶0 13.2-18.1mg在上述方法中，采用以下生产培养基。按重量比给出成分，其余为水。除了所说的营养成分外，还加入适量的人体所需的微量元素。
大豆培养基大豆5～10％酵母膏 0.02～0.5％或酵母粉0.02～0.5％
或蛋白胨、牛肉膏 0.02～0.3％CaCO30.05～0.25％K2HPO40.02～0.10％MgSO40.01～0.05％NaCl 0.01～0.04％Na2MO45.0～30ppmZnSO42.5～15ppmCoCl25.0～20ppm除了已被识别的富含支链脂肪酸的细菌，如寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，黄单胞杆菌属(Xanthomonas)，产黄菌属(Flavobacterium)，二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga)，互生单胞菌属(Altermonas)，嗜细胞菌属(Cytophage)，芽胞杆菌属(Bacillus)，金黄杆菌属(Chryseobacterium)，稳杆菌属(Empdobacter)，金杆菌属(Aurebacterium)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，以及假单胞菌属(Pseudomonas)外，本发明所说的特异菌株还包括其他天然存在，但目前尚未识别的富含特异支链脂肪酸的菌株。用富含特异支链脂肪酸的菌株，以及本发明的培养基与生产方法所生产的口服液、胶囊、片剂或针剂，均具有抗癌功能及对人和动物的营养和保护作用。
图1是光学显微镜下观察到程序性自行死亡的人肝癌细胞SNU-423的型态变化。A为对照组，B为经iso-C15(60μg/ml)处理24小时。
图2是光学显微镜下观察到程序性自行死亡的人胃癌细胞SNU-1用HE染色显示的型态变化。A为对照组，B为经iso-C15(60μg/ml)处理8小时。
图3是光学显微镜下观察到程序性自行死亡的人前列腺癌细胞DU-145的型态变化。A为对照组，B为经iso-C15(60μg/ml)处理8小时。
图4是人白血病细胞K562的流式细胞计分析图。A为对照组，B为经iso-C15(30μg/ml)处理24小时。
图5是人乳腺癌细胞MCF-7的流式细胞计分析图。A为对照组，B为经anteiso-C15(60μg/ml)处理4小时，C为处理24小时。
图6是正常人的周血淋巴细胞的流式细胞计分析图。A为对照组，B为经iso-C15(30μg/ml)处理24小时。
图7是荧光显微镜下观察到人胃癌细胞SNU-1加TUNEL反应物后呈现的程序性自行死亡。A为对照组，B为经iso-C15(60μg/ml)处理24小时。
图8是光学显微镜下观察到人白血病细胞K562人加POD反应物和底物后呈现的程序性自行死亡。A为对照组，B为经iso-C15(60μg/ml)处理2小时，C为处理4小时。
图9是光学显微镜下观察到人肺癌细胞H1688加POD反应物和底物后呈现的程序性自行死亡。A为对照组，B为经iso-C15(60μg/ml)处理8小时。
图10是光学显微镜下观察到人前列腺癌细胞DU145加POD反应物和底物后呈现的程序性自行死亡。A为对照组，B为经iso-C15(60μg/ml)处理8小时。
图11是光学显微镜下观察到人外周血淋巴细胞PBL加POD反应物和底物后呈现的程序性自行死亡。A为对照组，B为经iso-C15(60μg/ml)处理8小时。实施例及实验实施例一以下实施例是为了更具体地介绍本发明，但本发明并不限于实施例一。
以Q-can菌种生产菌株，用1吨的发酵罐为种子罐，进料量为0.4吨，其培养基各种物质量大豆40kg磨成浆(去渣)，磷酸氢二钾200g，碳酸钙200g，酵母膏160g，硫酸镁80g，氯化钠80g，钼酸钠10ppm，硫酸锌10ppm，氯化钴5ppm，亚硒酸钠2ppm，豆油4kg(作为消泡剂)，加水至400kg，通入蒸气120℃消毒30分钟，然后冷却至30℃接入3kgQ-can培养液(该培养液在30℃下摇床振荡24小时培养所得)。种子罐温度保持30℃，搅拌速度200转/分，通气量1∶1(v/v min)。发酵24小时后统检有否染菌，确定无染菌后再转入10吨的发酵罐开始正式生产。10吨发酵罐培养基成分与种子罐培养基成分一样，数量是种子罐的10倍，生产罐的培养基消毒，发酵温度、搅拌速度、通气量均与种子罐一样，连续发酵48小时、统检无染菌，发酵成功。然后升温至100℃灭菌30分钟，待冷却后开始装瓶，装好瓶的Q-can I发酵液还要再一次118℃ 45分钟的消毒成为半成品，经过质量检验合格后，包装即成Q-can口服液产品。实验一体外抗癌活性实验样品提取的13-甲基十四烷酸(iso-C15)是从本发明所述的用嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)Q-can菌种及本发明方法所生产的发酵液，用高压液相仪(HPLC)分离出来的。
化学合成的iso-C15，由Sigma Chemical公司(St.Louis，MO，USA)购得。
其他的特异支链脂肪酸包括10-甲基十一烷酸(iso-C12)11-甲基十二烷酸(iso-C13)12-甲基十三烷酸(iso-C14)11-甲基十三烷酸(anteiso-C14)12-甲基十四烷酸(anteiso-C15)14-甲基十五烷酸(iso-C16)13-甲基十五烷酸(anteiso-C16)15-甲基十六烷酸(iso-C17)16-甲基十七烷酸(iso-C18)15-甲基十七烷酸(anteiso-C18)17-甲基十八烷酸(iso-C19)18-甲基十九烷酸(iso-C20)以上样品均由Sigma Chemical公司(St.Louis，MO，USA)购得。
细胞系人白血病细胞系K562和人胃腺癌细胞系SGC-7901。
方法以MTT试验检测细胞毒活性。K562和SGC7901细胞培养于添加15％加热灭活的胎牛血清的RPMI1640培养液，选用指数生长期细胞。96孔微量培养板每孔加入细胞的密度为2×104/100μl，在每一实验孔加入含不同浓度样品的培养基，使加13甲基十四烷酸(包括人工合成和天然提取的样品)实验孔的终浓度为五个梯度，其它样品的终浓度为30μg/ml，6个对照孔加不含样品的培养基。培养板置二氧化碳培养箱37℃、5％CO2、饱和湿度培养24小时。用快翻法除去上清液，在每个孔中加20μl 50mg/ml的MTT，再培养4小时，加DMSO100μg/ml，振荡培养板10分钟，于酶联免疫检测仪(BioTek EL 311S型)570nm测吸光度A570抑制率(％)＝1-(实验孔平均A570值/对照孔平均A570值)结果表2.人工合成的iso-C15*对癌细胞生长的抑制率(％)细胞 90μg/ml60μg/ml30μg/ml15μg/ml 7.5μg/mlK56285.383.171.650.1 26.2SGC7901 68.463.150.527.5 -*样品用10％乙醇溶解表3.天然提取的iso-C15*对癌细胞生长的抑制率(％)细胞 90μg/ml 60μg/ml 30μg/ml 15μg/ml7.5μg/mlK56287.283.7 72.251.2 27.1SGC790168.862.1 51.228.1 -*样品用10％乙醇溶解表4.几种特异支链脂肪酸*对Kmm细胞生长抑制率样品 iso-C12iso-C13iso-C14iso-C16iso-C17iso-C18抑制率70.69 71.03 72.15 71.58 70.79 68.39样品 Iso-C19iso-C20anteiso- anteiso- anteiso- anteiso-C15C14C16C18抑制率69.15 62.58 73.10 72.59 70.68 71.73*特异支链脂肪酸的浓度为30μg/ml，用NaOH溶解，终溶液pH＝7.5以上例子是为了便于说明，本发明所揭示的特异支链脂肪酸及其同类物的种类，以及有效的癌细胞种类不限于此。实验二对小鼠LD50的测定材料13-甲基十四烷酸(化学合成)与NaOH反应形成钠盐后溶解于0.35％吐温-80，PH＝7.5；ICR小鼠，体重20.5～22.5g雌雄各半。
方法剂量从10～800mg/kg，每个剂量水平2只小鼠，另设溶剂对照组，具体剂量组为10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg、160mg/kg、800mg/kg，逐次按上述剂量组，每只小鼠每天腹腔注射三次，观察7日。
结论13-甲基十四烷酸以800mg/kg高剂量下仍无小鼠死亡，测不出半数致死量LD50。实验三对人乳腺癌MCF7祼小鼠移植瘤治疗作用的实验材料13-甲基十四烷酸(人工合成)与NaOH反应形成钠盐后溶解在0.35％的吐温-80中，pH为7.5；SPF级Babl/c裸小鼠，体重18～22g雌性鼠方法MCF7瘤皮下移植在，无菌条件下手术，取生长旺盛的MCF7瘤组织数个，剪碎混合后用套管针在裸小鼠右乳房脂垫处移植瘤组织块(约为0.18×0.18×0.2mm左右)，移植瘤接种七天后，选择瘤已长至约的14mm3大小的裸鼠，随机分组，每组6只，分对照组与治疗组，第一、二天每天腹腔注射60mg/kg 13-甲基十四烷酸一次，从第四天开始隔天注射一次，每次仍为60mg/kg，共14次，而对照组每次腹腔注射同样剂量的生理盐水。停药一天后解剖称瘤重和小鼠体重，并按下列公式计算肿瘤生长抑制率。
并进行t检验试验条件SPF级，温度25±2℃，湿度50±10％对照组瘤重结论如表5所示，13-甲基十四烷酸间隔腹腔注射14次，对人乳腺癌有较明显的抑制作用。
表5.13-甲基十四烷酸对人乳腺癌MCF-Babl/c裸小鼠移植瘤治疗作用级别剂量 给药方动物数 体重瘤重 抑制率 P值式 开始/最后 开始/最后对照ip6/6 20.1/17.7 1.09±0.28 -试验60mg/kg ip6/6 20.4/19.6 0.19±0.13 82.2＜0.05以上实验例证只是为了便于说明，本发明所揭示的特异支链脂肪酸及其同类物的种类不限于上述几种，对有作用的癌细胞种类不限于上述几种细胞系。含特异支链脂肪酸的发酵液的抗癌和保健作用含特异支链脂肪酸的发酵液本发明所说的发酵液，是采用特异菌株及本发明设计的培养基和生产方法，生产而成的。这种发酵液含具有显著抗癌活性的各种特异支链脂肪酸，以及来自大豆培养基与细菌代谢产物的丰富营养。为了充分论证发酵液的抗癌和保健功能，，特介绍以下实验及其结果。作为例子，在下面介绍的实验采用的发酵液是“Q-can口服液”。这种口服液是用嗜麦芽寡养单胞(Stenotrphomonas maltophilia)Q-can菌株作为生产菌株，并采用上述大豆培养基及本发明设计的生产方法所生产的。类似的动物实验与临床试验也对胶囊形式产品进行过，其结果和Q-can口服液产品的结果一致。
每500ml Q-can口服液中脂肪酸的典型含量如下直链脂肪酸*支链脂肪酸**10∶02.0-2.7mg i11∶0 11.2-15.4mg12∶02.9-4.0mg i15∶0 106.0-145.8mg14∶013.0-17.7mg i16∶0 3.1-4.3mg15∶02.8-3.8mg i17∶0 12.4-17.0mg16∶0251.7-346.1mg i19∶0 2.2-3.0mg17∶0 2.9-4.0mg a15∶023.4-32.1mg18∶0 75.6-104.0mg i17∶1ω9c4.1-5.7mg20∶0 5.5-7.6mg12∶1ω8c 4.3-5.9mg 羟基酸16∶1ω7c 21.0-28.9mg 30H-i11∶06.3-8.6mg18∶1ω9c 488.8-672.0mg 30H-12∶0 12.0-16.5mg18∶2ω6c 825.9-1135.6mg30H-i13∶013.2-18.1mgQ-can口服液的急性毒性实验材料Q-can口服液；ICR小鼠，体重20.5--22.5g方法与结果取空腹体重20.5--22.5g ICR小鼠20只(雌雄合半)由于预实验无法测定LD50，以最大可承受的Q-can口服液量即3倍浓缩液，1ml/只灌胃，24小时内共灌四次(1000a.m.、400p.m.、1000p.m.及次日600a.m.)。结果观察到所有受试小鼠在每次灌胃5分钟后活动减少，大约在1小时后才恢复，有3只小鼠在药后1～2天出现腹泻，但连续7天日无一受试小鼠死亡。疗程结束后将受试鼠处死活杀解剖，肉眼观察未见脏器异常。上述限度试验表明，Q-can口服液即使在急性大剂量给药时仍无毒性反应。按体表面积换算，该剂量相当于体重70kg成人每天服用Q-can口服液4,652ml。Q-can口服液亚急性毒性实验材料Q-can口服液，昆明小鼠体重22～24g。
方法与结果24只小鼠(雌雄各半)随机分为对照组和实验组，分别灌服生理盐水和Q-can口服液，剂量为0.8ml/只，连续灌服21天。第22天由各组随机抽出2只小鼠活杀，取内脏作石蜡切片镜下检查。余下每组10只小鼠再连续观察七天。结果，肉眼观察和镜下检查均未发现内脏有任何病变，余下小鼠停药后观察七天无一死亡。上述实验结果说明，连续灌服21天Q-can口服液不会引起毒性反应，不会使小鼠出现病变。Q-can口服液长期毒性实验材料Q-can口服液；80只Spraque-Dawley大白鼠(雌雄各半)，体重60±0.75g。
方法与结果80只白鼠随机分成4组，大剂量组(20ml/kg Q-can口服液)、中剂量组(10ml/kgQ-can口服液)、小剂量组(5ml/kg Q-can口服液)和对照组(同体积的生理盐水)。灌胃给药，每日一次，连续三个月。在实验过程中，观察白鼠的动作，食欲，胃肠反应及体重变化，测量血常规、血小板、心电图、肝功能和肾功能。给药3个月后将实验鼠处死解剖，对主要脏器作肉眼观察及病理检查，包括心、肝、脾、肾、胃、空肠和脑。
总的来说，受试白鼠情况良好，无异常行为，无胃肠道反应，食欲良好。实验组的体重增长曲线与对照组基本相似(P＞0.05)，心电图检查正常，血液学(包括血常规和血小板)实验组和对照组无统计学上的差异(P＞0.05)。肝功能(包括ALT和TTT)及肾功能(包括BUN和Cr)无明显差异(P＞0.05)。虽然实验组的肌酐略为升高，但仍在正常值范围内。主要脏器病理切片检查表明，实验组的细胞结构和组织形态学与对照组比较无明显不同。总之，Q-can口服液连续给药不会出现毒性反应，所以可以安全服用。Q-can口服液的保肝功能材料Q-can口服液；60只ICR小鼠。
方法与结果将60只ICR小鼠随机分成六组，每组10只，包括3个实验组和3个对照组，禁食后8小时称体重。
第1，2，3组(实验组)分别以75％、50％和33％的Q-can口服液代替清水给小鼠饮用，并于第7天腹腔注射硫代乙酰胺(TAA)80mg/kg。
第4组(阳性对照组)在第5天和第6天，每天腹腔注射维丙胺80mg/kg各一次，并于第7天腹腔注射TAA 80mg/kg。
第5组(阴性对照组)于第7天腹腔注射TAA 80mg/kg。
第6组(空白对照组)于第7天腹腔注射生理盐水0.1mg/kg。
在TAA染毒后1.4小时将小鼠摘眼球取血，分离血清并以721分光光度计的OD值检测各组小鼠的血清转氨酶水平。最后，将受试鼠脱颈椎处死，分离并摘除肝脏，求出肝占体重的百分比，结果进行方差分析表6.Q-can口服液对TAA诱发小鼠血清SGPT升高和肝肿大的影响组别药物 鼠 OD值LW/BWP*数 (X±SD)(％，X±SD)1 75％Q-can+TAA 10 0.705±0.107 5.825±0.590 ＜0.0012 50％Q-can+TAA 10 0.764±0.078 6.181±0.710 ＜0.0013 33％Q-can+TAA 10 0.847±0.073 6.323±0.942 ＜0.0014 维丙胺+TAA 10 0.728±0.091 6.180±.0.514＜0.0015 TAA 10 0.935±0.032 7.380±0.3386 生理盐水10 0.318±0.014 6.234±0.358 ＜0.001*与第5组比较。LW＝肝重 BW＝体重以上结果表明Q-can口服液对TAA诱发的血清转氨酶升高和肝肿大均有比较显著的抑制作用，其强度与ip维丙胺(80mg/kg)相似，甚至更为强些。增强化疗药物作用材料Q-can口服液，小鼠肝癌HAC瘤株，雄性昆明种小鼠，体重20-25g，注射用环磷酰胺(CP)。
方法和结果取小鼠40只随机分为5组。三个实验组分别喂36％、60％和100％的Q-can口服液，而对照组和阳性对照组喂饮用水。于实验第8天，在无菌操作下给全部小鼠腹腔注射癌细胞HAC悬液(107/ml)。在接种HAC细胞后1，3，5日，三个实验组和阳性对照组小鼠各腹腔注射环磷酰胺50mg/kg一次。从接种HAC后第9天起，恢复实验前正常饮食。观察并记录各鼠的死亡时间，计算平均存活期和生命延长率。其生命延长率(ILS％)定义为
ILS％＝(实验组存活期-对照组存活期)/对照组存活期表7.Q-can口服液对CP治疗肝癌的增效作用组别药物 存活期 ≥17天 延长天数 ILS(％) P*鼠数1 10.63±1.03 02 36％Q-can+CP12.38±2.39 1 1.75±2.05 16.46 ＜0.103 60％Q-can+CP14.44±3.54 2 3.94±2.98 35.84 ＜0.024 100％Q-can+CP 16.56±3.96 6 5.94±2.96 55.75 ＜0.015CP13.06±3.03 1 2.44±2.58 22.86 ＜0.05*与第1组(对照组)比较。
以上结果表明，化疗药物CP和Q-can口服液合并应用，其抗癌作用得到增强。无药阴性对照组荷瘤鼠的存活期仅10.63±1.03天，单纯环磷酰胺阳性对照组为13.06±3.03天，生命延长率22.86％。而合并应用CP和Q-can口服液(剂量60％和100％)，无论以平均生命延长率或以存活期延长60％(17天)的鼠数计算，均超过单纯CP的抗癌作用。所以，合并使用60％和100％Q-can口服液，分别将CP产生的生命延长率再提高56.78％和143.86％，其差异有统计学显著意义。Q-can口服液对小鼠Lewis肺癌作用的试验报告材料Q-can口服液(浓缩)每毫升含特异支链脂肪酸3.6mg；F1小鼠(C57/B1与DBA/2杂交第一代小鼠)体重18～22g，雌性；Lawis肺癌瘤种。
方法与结果治疗组10只小鼠先口服Q-can口服液10天，每天摄入的特异支链脂肪酸剂量是36mg/kg，然后接种Lewis肺癌再继续口服给药18天，与其它组同时解剖，阳性对照组10只小鼠接种Lewis肺癌后第二天就开始给药，腹腔注射CTX，剂量30mg/kg连续8天，对照组12只小鼠也是腹腔注射生理盐水8天。
试验结果来看，虽然Q-can组比阳性对照组抑瘤率低21％，但是从小鼠的存活率来看，Q-can组100％存活，而阳性对照组只有70％。阳性对照组是用腹腔注射法，剂量是30mg/kg，而Q-can试验组只是每天口服一次Q-can口服液，而口服量中所含的特异支链脂肪酸剂量仅有36mg/kg。如果口服剂量加大，有可能提高抑瘤率。
表8.Q-can服液对小鼠Lewis肺癌的治疗作用组别剂量 给药动物数体重瘤重抑瘤率 P值方式 开始/最后开始/最后X±SD(g) ％生理盐水 - ip 12/11 21.2/22.51.90±0.96 -CTX 30mg/kg ip 10/7 21.2/20.30.71±0.3662.2 ＜0.01Q-can 36mg/kg po 10/10 20.9/21.91.11±0.4641.6 ＜0.05Q-can口服液对人胃癌SGC-7901裸小鼠移植瘤治疗作用材料雌性Balb/c裸小鼠，6周龄，体重18-22g，整个实验期间喂养在无特殊病原体(SPF)条件下。浓缩Q-can口服液每毫升中含特异支链脂肪酸3.6mg。丝裂霉素C(MMC)购买。
方法与结果建立人胃癌SGC～7901移植瘤，实验时剪切成直径2mm左右的碎片，接种于裸小鼠右腋窝皮下。在接种后第5天随机分成5组。正常对照组和阳性对照组每天一次分别腹腔注射生理盐水和丝裂霉素(20mg/kg)，实验组于同一天开始每天口服给药一次连续14天，分18mg/kg、36mg/kg和72mg/kg(特异支链脂肪酸含量)三种剂量。接种后20天停止实验，将小鼠断颈处死。取出肿瘤并对此实验组与对照组的瘤重，计算抑制率，实验重复两次。
两次实验(实验I和实验II)的结果如下表9.Q-can口服液对人胃癌SGC-7901裸小鼠腋下移植瘤的治疗作用实验I组剂量 给药 给药小鼠数 体重 瘤重 抑制率 P别 方式 时间 开始/最后 开始/最后 X±SDgNS -ipQdx1412/12 21.9/23.30.17±0.45 -MMC 20mg/kgipQdx14 6/6 22.4/22.00.33±0.24 71.49 ＜0.01
Q-can 18mg/kg PoQdx14 6/6 22.0/22.5 0.80±0.42 31.19 ＞0.05Q-can 36mg/kg PoQdx14 6/6 21.9/22.0 0.60±0.45 48.23 ＜0.05Q-can 72mg/kg poQdx14 6/6 21.6/21.7 0.57±0.35 51.28 ＜0.05实验II组别 剂量 给药 给药小鼠数 体重 瘤重 抑制率P方式 时间 开始/最后 开始/最后 X±SDgNS ipQdx1412/1221.6/23.5 1.15±0.30MMC20mg/kg ipQdx14 6/6 21.1/21.1 0.30±0.33 73.51 ＜0.01Q-can 18mg/kg poQdx14 6/6 21.9/22.3 0.90±0.59 21.58 ＞0.05Q-can 36mg/kg poQdx14 6/6 22.0/21.6 0.66±0.49 42.47 ＜0.05Q-can 72mg/kg poQdx14 6/6 22.3/20.3 0.51±0.37 55.45 ＜0.01上述结果说明，在肿瘤接种后，以18mg/kg、36mg/kg和72mg/kg(特异支链脂肪酸含量)三种剂量每天口服Q-can口服液一次，连续14天可对人胃癌SGC-7901移植瘤产生抑制作用，而且随口服剂量增大，抑瘤率提高。Q-can口服液辅助治疗癌症170例疗效观察该临床试验是在中国五家医院进行的，化疗并用本品治疗癌症130例与单纯化疗131例比较，具有统计学意义的是，提高生活质量，增进食欲，消除乏力增加体重；提高免疫功能；减轻化疗引起的血象降低的程序，并对治前白细胞和血红蛋白低于正常者有一定的治疗作用，还具有一定的保肝、肾作用。放疗并用本品34例与单纯放疗32例比较，提高1gA的水平有统计学意义。分组各种癌症随机分层分组，分为两大组，其中化疗组并用本品(治疗组)136，单纯化疗(对照组)131例；放疗并用本品(治疗组)34例，单纯放疗(对照组)32例。病种化疗组以胃、肝、食管、大肠、肺、乳腺癌等为主，放疗组以鼻咽癌、喉癌为主。
性别化疗治组男94例，女42例，对照组男84例，女47例，放疗治疗组男25例，女9例，对照组男26例，女6例，两组均具有可比性(P＞0.1)。年龄化疗治疗组17-83岁，平均53.1岁，对照组16-80岁，平均53.2岁；放疗治疗组30-73岁，平均49.7，对照组31-72岁，平均50.1岁，两组均具有可比性(P＞0.1)。治疗方法化疗治疗组。每日并用Q-can口服液2次每次80ml化疗对照组并用其它的“升白”药，疗程60天。
放疗治疗组中有9例每日服Q-can口服液160ml，25例每人只服100ml，疗程60天。
观察结果表10.Q-can口服液对化疗组生活质量的影响组别 例数治前 治后 P值(X±SD)分 (X±SD)分 自身组间治疗组136 76.3±14.69 83.90±15.36 ＜0.01对照组131 79.96±10.96 76.22±12.80 ＜0.01 ＜0.01表11.Q-can口服液对化疗组症状有改善作用症状组别 例数减轻例 稳定例 加重例 P值(％) (％)(％)食欲减退治疗组 7749(68.6) 18(25.00)5(6.94) ＜0.01对照组 8118(22.22)33(40.74)30(37.04)乏力治疗组 9056(62.22)28(31.11)6(16.67)＜0.01对照组 7013(18.57)20(41.43)28(40.00)失眠治疗组 1811(61.11)7(38.89)0＞0.05对照组 185(27.78) 12(66.67)1(5.55)表12.Q-can口服液对化疗组体重*影响组别 例数 增加例 稳定例 下降例 P值(％) (％) (％)治疗组 13663(46.32) 33(24.27)40(29.41)＜0.01对照组 1312(15.27) 35(26.72)76(58.0)*治后平均比治前≥0.5公斤者为增加，≤0.5公斤者为下降，介于两者之间者为稳定。
表13.Q-can口服液对化疗组有提高细胞免疫功能的作用指标 组别例数 治前 治后 P值(X±SD)％ (X±SD)％ 自身 组间LTT 治疗组6555.95±8.02 56.28±8.55 ＞0.05＜0.01对照组7555.85±8.87 49.41±12.21＜0.01
CD3治疗组3043.53±4.5543.47±5.10＞0.05＜0.01对照组3045.47±3.5638.57±4.50＜0.01CD2治疗组3044.07±4.6043.10±5.13＞0.05＜0.01对照组3042.60±5.2038.27±5.62＜0.01NK 治疗组309.60±5.11 12.00±4.23＜0.05＜0.01Cell对照组3012.96±4.3110.80±4.00＜0.05表14.Q-can口服液对化疗组有提高体液免疫功能的作用指标 组别例数 治前 治后 P值(X±SD)％ (X±SD)％ 自身 组间IgC 治疗组7110.90±4.6911.92±5.06＜0.05＜0.01对照组7511.90±4.3811.05±4.99＜0.05IgA 治疗组721.63±0.67 1.73±1.32 ＞0.05＜0.01对照组751.65±0.76 1.38±0.76 ＜0.01IgM 治疗组711.24±0.59 1.55±1.05 ＜0.05＜0.01对照组751.53±0.78 1.30±0.73 ＜0.01表15.Q-can口服液对放疗组有提高免疫功能(IgA)作用指标 组别例数 治前 治后 P值(X±SD)％ (X±SD)％ 自身 组间IgA 治疗组311.74±1.31 20.39±0.90＜0.05＜0.01g/L 对照组342.07±10.3 1.73±0.80 ＞0.05表16.Q-can口服液对化疗组有预防血常规与血小板下降的作用项目 组别 例数 治前治后 P值(X±SD)％ (X±SD)％ 自身 组间WBC 治疗组 304.743±1.215.451±0.86＜0.01＜0.01(X109/L)对照组 305.29±0.85 4.450±0.80＜0.01粒细胞 治疗组 303.20±0.82 3.66±0.69 ＜0.01＜0.01(X109) 对照组 303.72±0.58 3.09±0.45 ＜0.01血小板 治疗组 30140.30±4.88 160.03±4.36 ＜0.01＜0.01(X109) 对照组 30157.33±3.52 145.53±5.33 ＜0.01
Hb 治疗组30 94.63±18.0096.89±16.08 ＞0.05＜0.01(g/L)对照组30 103.67±13.24 99.20±11.63 ＜0.01表17.Q-can口服液对化疗组能降低SGDT和ALP值，有保护肝作用组别例数SGPT (mmol/L) P 值 例数ALP (U/L) P值治前 治后 自身组间 治前 治后自身 组间(X±SD)(X±SD)治疗组 89460.06± 330.11± ＞0.05 ＜0.05 8872.34± 70.42± ＞0.05753.4 245.0157.81 48.71 ＞0.05对照组 84261.47± 284.00± ＞0.05 8365.26± 77.64± ＜0.05191.23 217.3037.32 64.03表18.Q-can口服液对化疗组药物引起的肾功能损害有保护作用组别 血尿素 (mmol/L)P值 例数 血肌酐 (mmol/L) P值氮 治后 自身组间 治前 治后 自身 组间治前(X±SD) (X±SD) (X±SD)(X±SD)治疗组5.13± 4.95±＞0.05 ＜0.01110 97.15±97.99± ＞0.05＜0.012.951.33 30.6423.46对照组4.26± 5.04±＜0.019089.28±107.08±＜0.011.031.42 22.1341.27表19.Q-can口服液对化疗组血清总蛋白和白蛋白均有升高作用项目组别例数 治前 治后P值(X±SD)(X±SD) 自身组间总蛋白 治疗组 10165.31±10.0167.47±5.99＞0.05＜0.01(g/L) 对照组 10365.64±6.53 64.20±6.07＜0.05白蛋白 治疗组 10738.78±5.65 39.13±5.26＞0.05＜0.05(g/L) 对照组 10239.44±4.74 38.18±5.24＜0.05用本发明所指的Q-can菌种发酵液经喷雾干燥所制成的胶囊，在临床上对116例癌症病人观察的效果与Q-can口服液的效果基本一致。故不再重述。Q-can口服液治疗35例美国前列腺癌病人的临床观察在美国两家医院检测36个前列腺癌病患者(年龄从37-80岁，平均年龄为66岁)，服用Q-can浓缩口服液(每瓶250ml，含特异支链脂肪酸300mg)8周～18周(平均14周)。病人在治疗期间不接受放疗、化疗或激素治疗，每日服用250ml，Q-can浓缩口服液。35例患者都抽血测定PSA(Prostate Specific Antigen)指标的变化，其结果如下20.Q-can口服液对前列腺癌病人PSA指标的影响病例数 服用前(mg/ml)X±SD服用后(mg/ml)X±SDP值35 10.22±10.727.45±6.06＜0.01以上临床观察表明Q-can口服液对前列腺癌病人有降低其PSA的作用。
本发明申请所用缩写的全名HPLC＝High Peformance Ligqid Chromatography 高效液相色谱法LD50＝50％ lethal dose 半数致死量PBL＝peripherel blood lymphocytes 外周血液淋巴细胞TUNEL＝TdT-mediated dUTP nick end labeling TdT-间接dUTP切口末端标记POD＝peroxidase 过氧化物酶FBS＝fetal bovine serum 胎牛血清PBS＝phosphate-biffered saline 磷酸缓冲盐水CTX＝Cytoxin 细胞毒素CP＝cyclophosphamide 环磷酰胺
权利要求
1.一种应用于癌症治疗的具有抗癌作用的物质，其特征在于让病人服用有效量的一个以上饱和的及相对应的不饱和的支链脂肪酸，或它的药用盐，或它的药用脂蛋白。其中饱和的支链脂肪酸分子式为
式中n和m是独立的整数，n+m为0～46。不饱和支链脂肪酸的上述分子式中m或n至少为2，在(CH2)m或(CH2)n中至少有一个(CH2-CH2)基团改为(CH＝CH)基团。
2.根据权利要求1所述的具有抗癌作用的物质，其特征在于支链脂肪酸至少是13-甲基十四烷酸或12-甲基十四烷酸。
3.根据权利要求1所述的具有抗癌作用的物质，其特征在于支链脂肪酸是由用含支链脂肪酸的菌株发酵或培养的产物中分离而得到。
4.一种具有抗癌活性的特异支链脂肪酸的生产方法，其特征是生产菌株用富含支链脂肪酸的菌株，如寡养单胞菌属(Stenotrphomonas)，细菌黄单胞杆菌属(Xanthomonas)细菌，产黄菌属(Flavobacterium)细菌，二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga)细菌，互生单胞菌属(Altermonas)细菌，嗜细胞菌属(Cytophage)细菌，芽胞杆菌属(Bacillus)细菌，金黄杆菌属(Chryseobacterium)细菌，稳杆菌属(Empdobacter)细菌，金杆菌属(Aurebacterium)细菌，葡萄球菌属(Staphylococcus)细菌，假单胞菌属(Pseudomonas)细菌。
5.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于所使用的生产菌株为寡养单胞菌属(Stenotrphomonas)的细菌菌株。
6.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于所使用的生产菌株为嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrphomonas maltophilia)Q-can菌株，其编号为ATCC 202105。
7.根据权利要求1所述的具有抗癌作用的物质，其特征在于支链脂肪酸是用电化学合成方法获得。
8.根据权利要求1所述的具有抗癌作用的物质，其特征在于支链脂肪酸是由天然材料中提取所获得。
9.根据权利要求1所述的具有抗癌作用的物质，其特征在于支链脂肪酸是以下脂肪酸9-甲基十烷酸(iso-c11)、10-甲基十一烷酸(iso-c12)、11-甲基十二烷酸(iso-c13)、12-甲基十三烷酸(iso-c14)、11-甲基十三烷酸(anteiso-c14)、12-甲基十四烷酸(anteiso-c15)、13-甲基十四烷酸(iso-c15)、14-甲基十五烷酸(iso-c16)、13-甲基十五烷酸(anteiso-c16)、15-甲基十六烷酸(iso-c17)、16-甲基十七烷酸(iso-c18)、15-甲基十七烷酸(anteiso-c18)、17-甲基十八烷酸(iso-c19)、18-甲基十九烷酸(iso-c20)、以及15-甲基十六碳烯酸(iso 17∶1 ω9c)。
10.根据权利要求1所述的具有抗癌作用的物质，其特征在于是用于以下癌症白血病、舌癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、黑色癌、肾癌、食道癌、胰腺癌。
11.根据权利要求1所述的具有抗癌作用的物质，其特征是病人所服用的支链脂肪酸是作为发酵产物的一部分，另外还含培养基。
12.根据权利要求11所述的培养基，其特征在于是大豆培养基。
13.根据权利要求12所述的大豆培养基，其特征在于其配方是大豆培养基大豆5～10％酵母膏 0.02～0.5％或酵母粉0.02～0.5％或蛋白胨、牛肉膏 0.02～0.3％CaCO30.05～0.25％K2HPO40.02～0.10％MgSO40.01～0.05％NaCl0.01～0.04％Na2MO45.0～30ppmZnSO42.5～15ppmCoCl25.0～20ppm
14.根据权利要求12所述的大豆培养基，其特征在于是用于培养嗜麦芽寡养单胞菌ATCC 202105菌株。
15.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于发酵的最终产品可以制成口服液、胶囊、片剂、注射液。
16.一种增强癌症病人放疗、化疗效果的方法，其特征是根据需要让病人服用有效量的一个以上饱和的及相对应的不饱和的支链脂肪酸，或它的药用盐，或它的药用脂蛋白。其中饱和的支链脂肪酸分子式为
式中n和m是独立的整数，n+m为0～46。不饱和支链脂肪酸的上述分子式中m或n至少为2，在(CH2)m或(CH2)n中至少有一个(CH2-CH2)基团改为(CH＝CH)基团。
17.一种制造支链脂肪酸或其混合物的方法，其特征是饱和支链脂肪酸分子式为
式中n和m是独立的整数，n+m为0～46。不饱和支链脂肪酸的上述分子式中m或n至少为2，在(CH2)m或(CH2)n中至少有一个(CH2-CH2)基团改为(CH＝CH)基团。这种方法是在培养基中培养含所述支链脂肪酸的菌株，以便形成含支链脂肪酸的发酵液，然后再从这种发酵液中提取所述支链脂肪酸。
18.根据权利要求17所述的制造支链脂肪酸或其混合物的方法，其特征在于支链脂肪酸至少是13-甲基十四烷酸或12-甲基十四烷酸，或它们的盐或脂蛋白。
19.一种制造含一个以上支链脂肪酸发酵液的方法，其特征是饱和支链脂肪酸分子式为
式中n和m是独立的整数，n+m为0～46。不饱和支链脂肪酸的上述分子式中m或n至少为2，在(CH2)m或(CH2)n中至少有一个(CH2-CH2)基团改为(CH＝CH)基团。这种方法是在培养基中培养含支链脂肪酸的菌株形成含所述支链脂肪酸的发酵液。
20.根据权利要求18所述的制造支链脂肪酸发酵液的方法，其特征在于发酵液中支链脂肪酸至少是13-甲基十四烷酸或12-甲基十四烷酸，或它们的盐或脂蛋白。
全文摘要
本发明涉及一组对人和动物具有显著抗癌作用的特异支链脂肪酸;用化学合成或用含此组物质的细菌经发酵或培养而获得大量此组支链脂肪酸的生产方法,并用于癌症病人的治疗。
文档编号C07C69/90GK1251296SQ98120509
公开日2000年4月26日 申请日期1998年10月16日 优先权日1998年10月16日
发明者杨振华 申请人:杨振华