用于促进癌细胞凋亡的化合物、其医药组合物及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明关于一种新颖化合物，尤其是，该化合物用于抑制癌细胞生长并可促进癌 细胞凋亡。
【背景技术】
[0002] 肺癌是现今高发病率与高致死率的癌症之一，而根据统计，肺癌是台湾最常见的 癌症死因。肺癌主要可区分成小细胞肺癌（small cell lung carcinoma,简称SCLC)及 非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinoma，简称NSCLC)，其中NSCLC约占肺癌病例 的80%，SCLC则占20%。绝大数的NSCLC的病患观察到有上皮生长因子受体（印idermal growth factor receptor,简称EGFR)的大量表现，突变且异常增升的EGFR为新兴药物标 靶蛋白之一。
[0003] 艾瑞莎（亦称为吉非替尼（Gefitinib)或ZD1839),现已应用于在治疗非小细胞癌 病人的临床用药，其会与ATP竞争EGFR的细胞内酪氨酸激酶（tyrosine kinase)区的受质 结合位置，进而抑制酪氨酸激酶的自身磷酸化反应，进而抑制下游的讯息传导途径，是一种 小分子的酪氨酸激酶抑制剂。
[0004] 艾瑞莎的疗效与EGFR本身的突变有关，如在表现子19基因缺失（ex〇nl9)和第 858氨基酸位点由原本的亮氨酸突变成精氨酸（L858R)时，会增加肿瘤对艾瑞莎的敏感性， 治疗效果较原始未突变的EGFR更佳。目前的研究发现，艾瑞莎的抗药性与EGFR的第二个 位点突变有关，临床上的数据指出50%对艾瑞莎产生抗性的非小细胞肺癌病人在EGFR的 第790氨基酸产生突变，由原本的苏氨酸变异成蛋氨酸（T790M)，T790M突变点位于EGFR 与ATP结合位置上，其阻挡EGFR与其抑制子结合，甚至提高EGFR与ATP的结合能力而增强 EGFR的活性。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一种式（I)化合物或其盐，
[0006]
[0007] 其中，m为2至7的整数，以及R独立选自由氢及Ci-Q。烷基所组成组的至少一者。
[0008] 于本发明的一具体实施例中，m为2, R为Q-Cu烷基。
[0009] 于本发明的一具体实施例中，m为2, R为C12烷基。
[0010] 于本发明的一具体实施例中，本发明的化合物用于促进癌细胞的细胞凋亡，用以 抑制癌细胞的生长。优选地，该癌细胞选自由肺癌细胞、直肠癌细胞及膀胱癌细胞所组成组 的至少一者。 toon] 于本发明的一具体实施例中，本发明的式（I)化合物用以抑制表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor,以下简称EGFR)蛋白激酶的活性，以促进癌细胞凋 亡。
[0012] 本发明进一步提供一种医药组合物，其包含如上述式（I)的化合物或其盐以及医 药上可接受的载剂。
[0013] 本发明再进一步提供一种包含本发明的医药组合物的用途，其用于制造治疗癌症 的药物，其中，该癌症选自肺癌、直肠癌及膀胱癌所组成组的至少一者。
【附图说明】
[0014] 图1显示不同浓度的艾瑞莎类似物（简称类似物）1、类似物2及艾瑞莎分别处 理不同癌症细胞株24小时后的细胞存活率结果，（A)为RK0人类直肠癌细胞株，（B)为 BFTC905人类膀胱癌细胞株；
[0015] 图2显示类似物18相较于艾瑞莎对于促进不同人类肺癌细胞的细胞死亡更有效 率；将不同人类肺癌细胞株以〇至40 μ Μ的艾瑞莎或类似物18处理24小时，之后以MTT试 验进行细胞存活率分析。（Α)为Α549人类肺腺癌细胞株（以下简称Α549)，（Β)为Η1299人 类非小细胞肺癌细胞株（以下简称Η1299)，（C) CL3人类肺癌细胞株（（以下简称CL3)，其 中（A)、（Β)及（C)结果得自3个实验且该横杠表示平均值土 S. Ε.，##ρ〈0. 01表示以艾瑞莎 处理样品与以类似物18处理样品间的显著性差异；(D)为HFL1人类肺纤维母细胞株（以 下简称HFL1)，该结果得自6个实验且该横杠表示平均值土 S. Ε.;
[0016] 图3显示EGFR及磷酸化EGFR在不同人类肺癌细胞中的蛋白质表现；萃取自Α549 细胞株、Η1299细胞株、CL3细胞株及Α431人类表皮样癌（过分表现EGFR，其做为正控制 组）的总体蛋白质，利用抗EGFR、抗磷酸化EGFR及抗肌动蛋白的抗体进行西方墨点法分析， 并以肌动蛋白作为蛋白质充填控制组，该结果取自3个类似实验结果其中之1 ;
[0017] 图4显示类似物18及艾瑞莎均抑制EGFR蛋白激酶的活性，（A) ATP转换至ADP的 标准曲线，其与ADP的量具有正相关；(B)利用IVIS系统定量荧光强度的结果；(C)利用（A) 的标准曲线计算蛋白激酶特定活性的结果；(D)以最大酶活性的％表现EGFR蛋白激酶活 性，其中，以类似物18或艾瑞莎不存在时的蛋白激酶特定活性作为100% ;上述结果得自3 个实验且该横杠表示平均值土 S. Ε.，*p〈0. 05、**p〈0. 01表示控制组（不含任何化合物者） 与经类似物18或艾瑞莎处理样品间的显著性差异；
[0018] 图5显示类似物18较艾瑞莎于人类肺癌细胞中引发细胞凋亡更具效率，A549细胞 株以0至40 μ Μ的㈧类似物18或⑶艾瑞莎处理24小时后，利用膜联蛋白V-碘化丙啶 (Annexin V-PI(propidium iodise,简称ΡΙ))染色及使用流式细胞仪分析测定被引发的细 胞凋亡含量，该细胞群以Annexin V+/PI (右下图）及Annexin V+/PI+表示者（右上图）， 分别表示细胞凋亡的早期及晚期，该结果取自3个类似实验的其中之一；
[0019] 图6显示以CellQuest软体定量（Α)早期细胞凋亡、（Β)晚期细胞凋亡及（C)全 部细胞凋亡的百分比，该横杠表示平均值土S. Ε.，*p〈0. 05、**p〈0. 01表示以控制组（不含 任何化合物者）与以类似物18处理样品间的显著性差异，#p〈0. 05及##p〈0. 01表示以艾 瑞莎处理样品与以类似物18处理样品间的显著性差异；
[0020] 图7显示类似物18较艾瑞莎对于人类肺癌细胞的生长及细胞周期抑制更有效率， 将A549细胞株以1 X 106细胞/p60培养皿的密度接种于60mm培养皿中培养18小时，再以 30 μ Μ的类似物18或艾瑞莎处理24小时，待以药物处理完后，该细胞继续培养2天至6天， 最后以血球计（hemocytometer)计算其细胞数，该结果得自3个实验且该横杠表示平均值 土S. E.，*p〈0. 05表示以控制组（不含任何化合物者）与以艾瑞莎处理样品间的显著性差 异，##p〈0. 01表示以控制组（不含任何化合物者）与以类似物18处理样品间的显著性差 异；
[0021] 图8显示将A549细胞株以0至40 μ Μ的⑶类似物18或⑷艾瑞莎处理24小 时后，以流式细胞仪进行分析，该结果取自3个类似实验其中之一；
[0022] 图9显示利用ModFit LT软体定量（A) G0/G1期、（B) S期、（C) G2/M期及⑶次-G1 期的百分比，该结果得自3个实验且该横杠表示平均值土S. E.，*p〈0. 05、**p〈0. 01表示以 控制组（不含任何化合物者）与以类似物18或艾瑞莎处理样品间的显著性差异，##p〈0.01 表示以类似物18处理样品与以艾瑞莎处理样品间的显著性差异；
[0023] 图10显示类似物18较艾瑞莎于人类肺癌细胞中诱发凋亡蛋白酶3 (caspase 3) 及多聚ADP核糖聚合酶（poly ADP ribose polymerase,以下简称PARP)的蛋白质表现更 有效率，（A)将A549细胞株以0至40 μ Μ的类似物18或艾瑞莎处理24小时后，进行蛋白 质萃取并使用抗凋亡蛋白3、抗PARP及抗肌动蛋白的特定抗体进行西方墨点法分析，将肌 动蛋白用于作为蛋白质充填控制组，该结果取自3个类似实验结果的其中之一；(Β)及（C) 以半量化法（semi-quantification)得出活化态凋亡蛋白3及切割态PARP的相对蛋白质强 度，该结果得自3个实验且该横杠表示平均值土S. E.，*p〈0. 05表示以控制组（不含任何化 合物者）与以类似物18处理样品间的显著性差异；
[0024] 图11显示类似物18较艾瑞莎对于抑制人类肺癌细胞中的生存素（survivin)的 基因及蛋白质表现更有效率，（A)将A549细胞株以0至40 μ Μ的类似物18或艾瑞莎处理24 小时后，根据使用者手册萃取出细胞的总RNA，以半定量逆转录聚合酶连锁反应（reverse transcription polymerase chain reaction，以下简称 RT-PCR)分析 mRNA 的表现，以 GAPDH作为内部控制组，该结果取自3个相似实验结果的其中之一；(B)该横杠表示平均值 土S. E.，#p〈0. 05表示以类似物18处理样品与以艾瑞莎处理样品间的显著性差异；（C)将 A549细胞株以0至40 μ Μ的类似物18或艾瑞莎处理24小时后，使用抗生存素及抗肌动蛋 白的特定抗体进行西方墨点法以分析总蛋白萃取物，该结果取自3个相似实验结果的其中 之一；(D)以半定量化法自西方墨点法得出生存素的相对蛋白质强度，该结果得自3个实验 且该横杠表示平均值土 S. Ε.，*ρ〈0. 05表示以控制组（不含任何化合物者）与以类似物18 或艾瑞莎处理样品间的显著性差异，#Ρ〈〇. 05表示以类似物18处理样品与以艾瑞莎处理样 品间的显著性差异；
[0025] 图12显示在肺癌细胞中以GFP-生存素表现载体转染的生存素过度表现，可抑制 类似物18所引发的细胞死亡，（Α)将总蛋白萃取物进行西方墨点法分析；(Β)在转染及以类 似物18处理后，以ΜΤΤ试验进行细胞存活率分析，该结果得自3个实验且该横杠表示平均 值土S. Ε.，**ρ〈0. 01表示控制组的转染与生存素组的转染或以类似物18处理的生存素组 转染样品间的显著性差异，##Ρ〈〇. 01表示以类似物18处理的样品及控制组间的显著性差 异；
[0026] 图13显示类似物18可在异体移植人类肺癌细胞的裸鼠中抑制肿瘤大小及生存素 蛋白质的表现，（A)每4天测量一次肿瘤的体积，该结果得自8只裸鼠且该横杠表示平均值 土S. E.，*#p〈0. 001表示控制组（不含任何化合物者）与以类似物18处理样品间的显著 性差异；(B)在以药物处理后的第16天牺牲裸鼠并取出肿瘤；(C)将得自各组的异体肿瘤 组织均质化并使用抗生存素及抗肌动蛋白的特定抗体进行西方墨点法以分析总裂解物，该 结果得自3个相似实验结果的其中之一，以半定量化法自西方墨点法得出生存素的相对蛋 白质强度，该结果得自3个实验。
【具体实施方式】
[0027] 以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，该领域技术人员可由本说明 书所揭示的内容轻易地了解本发明的优点及功效。本发明也可通过其它不同的实施方式加 以施行或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用，在不悖离本发明所揭示 的精神下赋予不同的修饰与变更。
[0028] 本发明提供一种式（I)化合物或其盐，
[0029]
[0030] 其中，m为2至7的整数，以及R独立选自由氢及Ci-Q。烷基所组成组的至少一者。
[0031] 于本发明的一具体实施例中，优选地，m为2, R为Q-C；；。烷基。最佳者，m为2, R为 C12烷基。
[0032] 于本发明的一具体实施例中，本发明的化合物为4-(4-(3-(4-(3-氯-4-氟苯胺 基）-7-甲氧喹唑啉-6-氧基）丙基）哌嗪-1-基）-4-氧代丁酸十二酯（类似物18)。
[0033] 于本发明的一具体实施例中，本发明的化合物用于促进癌细胞的细胞凋亡，用以 抑制癌细胞的生长。较佳者，该癌细胞选自由肺癌细胞、直肠癌细胞及膀胱癌细胞所组成组 的至少一者。
[0034] 于本发明的一具体实施例中，本发明的式（I)化合物用以抑制EGFR(epidermal growth factor receptor)蛋白激酶的活性，以促进癌细胞凋亡。
[0035] 于本发明的一具体实施例中，本发明的化合物用以促进癌细胞中凋亡蛋白酶 3 (caspase 3)的活化及多聚ADP核糖聚合酶（poly ADP ribose polymerase)的切割，并抑 制生存素（survivin)的蛋白质及基因表现，以促进癌细胞凋亡。
[0036] 本发明进一步提供一种医药组合物，其包含本发明的式（I)的化合物或其盐以及 医药上可接受的载剂。
[0037] 本发明化合物具有低毒性及可通过与药理上可接受的载剂等混合而呈医药组合 物用于哺乳动物（例如：人类、小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、马、猪、猴）。
[0038] 作为药药上可接受的载剂，可使用传统上用作为配方材料的各种有机或无机载剂 物质。该等被合并作为用于固体配方的赋形剂、润滑剂、结合剂及崩解剂，用于液体配方的 溶剂、溶解剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲液、舒缓剂，及其类似者，以及如需要时可添加的配方添 加剂（例如：防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、及其类似物）。
[0039] 该医药组合物的剂型的实例包括口服制剂（例如：锭剂（包括糖衣锭、膜衣锭、舌 下含锭、口服崩解锭）、胶囊（包括软胶囊、微胶囊）、颗粒、粉末、片剂、糖浆、乳液、悬浮液、 薄膜（例如：口服可崩解薄膜）及其类似物；以及肠外试剂（例如：注射液（例如：皮下注 射液、静脉注射液、肌肉注射液、腹腔注射液、点滴注射液）、丸剂、鼻制剂、肺制剂（吸入剂） 及其类似物。
[0040] 本发明再进一步提供一种包含如上述式（I)的化合物或其盐的用途，用于制造治 疗癌症的药物，其中，该癌症选自由肺癌、直肠癌及膀胱癌所组成组的至少一者。
[0041] 用于本发明的说明书中，术语「艾瑞莎（Iresa)」指治疗肺癌药物的商品名，其学 名为吉非替尼（Gefitinib)，其为表皮细胞生长因子受体的抑制剂。
[0042] 用于本发明的说明书中，术语「艾瑞莎类似物（analogues)」指一系列吉非替尼的 哌嗪类似物，其中，在吉非替尼的吗啉基经多种的哌嗪基所取代。
[0043] 实施例
[004