专利名称：Bcl-2蛋白表达剂、细胞凋亡抑制剂和表皮细胞的紫外线dna损伤防止剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及皮肤等细胞中BCL-2蛋白表达剂、细胞凋亡抑制剂和表皮细胞的紫外 线DNA损伤防止剂。
背景技术：
甘草是众所周知的一种生药，其被用作药用或甜味剂原料，也可以作为化妆品等 皮肤外用剂的成分使用。而且，已知用水或醇水溶液等水性溶剂提取的甘草叶的提取物具 有促进皮肤的成纤维细胞的骨胶原产生的作用。
通过这种作用，甘草提取物促进真皮中产生纤维状骨胶原，保持皮肤张力，并通过 骨胶原维持水分保持机制，从而防止皮肤的老化(专利文献1)。
此外，还已知，甘草提取物抑制皮肤中由于紫外线损伤而生成的黑色素，促进黑色 素的排泄，作为这种甘草提取物，已知有用水提取过滤甘草的根和根茎，将分取的水中不溶 的水提取残渣作为原料，以该乙醇提取物作为有效成分使用的皮肤化妆品(专利文献2)。
此外，作为本申请的发明者的现有技术，已知有，通过纯化提高甘草中所含美白成 分的纯度，尤其是精选甘草甙以外的美白成分，即通过酪氨酸酶抑制活性以外的作用提高 美白效果的美白性皮肤外用剂(专利文献3)。
可是，皮肤的其它的细胞死亡的细胞凋亡，如也被称为程序性细胞死亡一样，与坏 死不同，是各种疾病的成因，是使疾病的症状进展的生命现象。因此，迫切期望用于调整伴 随疾病的细胞凋亡的技术，还要开发药物。
例如，众所周知的是，在癌症疾病的治疗等中，在对皮肤照射放射线时，或在含紫 外线强的太阳光线日常性照射皮肤时，在正常细胞中的也诱导出细胞凋亡。
由于考虑到如果可以抑制这种正常细胞和疾病组织的细胞的细胞凋亡，不仅对于 治疗效果而且对于日常的防紫外线对策都有利，因此人们进行了对细胞凋亡抑制剂的开 发。
作为抑制细胞凋亡的基因，可以列举BCL-xL、BCL_2、BCL-w、IAP等。
这其中，BCL-2基因位于染色体18q21. 3，由于最初发现于滤泡性淋巴瘤(Bcell lymphoma/leukemia)，因此命名为“BCL”，该基因编码的约^kD的蛋白被称为“BCL-2蛋白”。
BCL-2蛋白被表达于细胞质(包括核膜周围)中，在正常细胞中，存在于线粒体 的外膜表面，起细胞凋亡抑制因子的作用，尤其是存在肿瘤细胞等异常时，甚至在正常细胞 中，在神经系统、肠粘膜、表皮基底层等中都被发现有该蛋白。
此外，已知的是BCL-2基因是色素干细胞的维持所必需的基因，其缺损导致毛发 变白。即，毛囊的色素干细胞，与生成黑色素的已成熟的色素细胞一起成长，然而根据BCL-2 缺损小鼠的实验结果，经过发育，局部存在于微环境中的成黑色素细胞在作为色素干细胞 进入到休眠状态的瞬间，BCL-2基因对于生存是必需的。
而且，还已知，在BCL-2基因缺损小鼠中，还发现以黑色素细胞的细胞凋亡引起的 体毛的白色化为代表，在神经系统、淋巴细胞、小肠等各种组织中的细胞凋亡的亢进，肾功 能衰竭等症状，人们了解了 BCL-2的功能对于这些组织和细胞的维持十分重要(专利文献 4)。
此外，BCL-2在身体的许多组织中被正常表达，因此起着维持长命细胞生存的 生理学功能。已知，在生存被BCL-2调节的细胞的类型中，有在免疫化期间形成的“记忆 (memory)”、成为淋巴细胞、控制脑内和肌肉和器官功能的末梢神经内的多种类型的神经 元、骨髓细胞、存在于皮肤、胃肠管内侧的吸收细胞的干细胞(专利文献5)。
专利文献1 特开2000-191498号公报(权利要求1)
专利文献2 特开平10-194959号公报(段落0005、段落0014)
专利文献3 特开2006-(^8157号公报(段落0016)
专利文献4 特开2002-080382号公报
专利文献5 特开2003-176236号公报发明内容
但是，就上述的BCL-2蛋白的表达性或细胞凋亡的抑制性而言，并没有关于前述 甘草提取物的相关认识，专利文献1 3中所认识到的美白作用和老化防止作用与由于 BCL-2蛋白的表达(以下，有时也简称BCL-2的表达、或BCL-2表达)而引起的抗细胞凋亡 性作用不同，是由于对活细胞的骨胶原产生的促进和抑制黑色素产生的作用而引起的。
作为这种甘草的水性溶剂提取物的利用技术，存在以下问题，即还没有技术上确 立被紫外线等损伤的表皮细胞的BCL-2蛋白的表达性和异常细胞凋亡的抑制。
因此，本发明的课题在于，解决上述问题，制成使细胞的BCL-2蛋白的表达增强， 并抑制具有被紫外线等直接或间接损伤的DNA的细胞的细胞凋亡，还可以提高细胞的组织 修复性在各种药剂中添加，并可以期待有广泛应用的BCL-2蛋白表达剂，制成细胞凋亡抑 制剂和表皮细胞的紫外线DNA损伤防止剂。
本发明的BCL-2蛋白表达剂和细胞凋亡抑制剂是通过如下完成的，S卩，本申请的 发明人分别发现了表皮细胞的增殖性(PCNA)、BCL-2的表达、表皮细胞的细胞凋亡抑制性， 并基于后述实验方法和结果发现如下性质其减轻表皮细胞由于暴露于紫外线而产生的 DNA损伤，而对正常皮肤细胞不产生异常或坏的影响。
即，本发明中，通过制成含有水和乙醇可溶性的甘草提取物作为有效成分的BCL-2 蛋白表达剂、细胞凋亡抑制剂或表皮细胞的紫外线DNA损伤防止剂，解决了前述问题。
本发明中作为有效成分而被采用的甘草提取物对正常表皮细胞既安全又无害， 即，在正常表皮细胞中，不会给细胞增殖能力和细胞凋亡带来显著变化，即使添加在化妆品 等中，对正常表皮细胞，不会达到抑制细胞凋亡这样显著的作用。
即，在以往的化妆品的使用方法中，没有积极地作为BCL-2蛋白表达剂、细胞凋亡 抑制剂或表皮细胞的紫外线DNA损伤防止剂来使用，其作用没有确实地实现。
然而，本发明的BCL-2蛋白表达剂、细胞凋亡抑制剂或紫外线DNA损伤防止剂，对 于由于紫外线照射而引起了对DNA等的损伤的细胞，显著地使其表皮细胞增殖，并修复组 织，使作为细胞凋亡抑制因子的BCL-2表达，抑制损伤DNA的胸腺嘧啶二聚体的形成。
如后述表3所示，T-T 二聚体阳性细胞出现比无处理组显著降低，由此也清楚了表 皮细胞的DNA损伤的阻止性。
这种BCL-2蛋白表达剂、细胞凋亡抑制剂或DNA损伤防止剂对表皮细胞有效，防止 表皮细胞的DNA损伤，使BCL-2蛋白表达，抑制细胞凋亡。
我们认为通过这种针对色素干细胞的皮肤用BCL-2蛋白表达剂，起到使得BCL-2 基因在色素干细胞生存必需的时期进行供应的作用，结果发现由于表皮细胞中色素干细胞 得到维持而生成黑色素、可以防止随年龄增长的生理性的毛发的变白。
而且，本发明的BCL-2蛋白表达剂可以应用于由于人、动物的各种组织、细胞中 BCL-2基因引起的蛋白的表达而得到改善的各种处方中，具有可以应用于例如通过器官治 疗、包括干细胞的各种细胞的长寿化而产生的各种症状的改善或健康维持、皮肤或毛发等 美容的改善等其他各种处方中的通用性。
本发明由于制成含有水和乙醇可溶性的甘草提取物作为有效成分的BCL-2蛋白 表达剂或细胞凋亡抑制剂，因此具有如下优点，即形成可以抑制具有被紫外线直接或间接 地损伤了的DNA的细胞的细胞凋亡，并提高细胞组织修复性而添加到各种药物中预期有广 泛应用的BCL-2蛋白表达剂、细胞凋亡抑制剂或表皮细胞的紫外线DNA损伤防止剂。
此外，本发明的BCL-2蛋白表达剂还有以下优点，即对皮肤细胞以外的体细胞也 具有使其长寿的效果，根据这种细胞的位置，有改善健康的效果。
具体实施方式
本发明中使用的甘草是西班牙、西伯利亚、中国等地所产的豆科的药用植物，一种 通过干燥甘草提高了保存性的生药，其是学名被称为Glycyrrhiza urarelensis Fischer 或Glycyrrhiza glabra 1 var. glandulifera REG. Et HERD 的植物或其近缘种。该植物可 以优选以根或根茎(也称为葡萄茎或匍匐枝)带皮的状态、或除了栓皮层后被粉碎或磨碎 成粉末状，用水或乙醇或其它水性溶剂提取它们，将其用作有效成分的提取材料。一般的甘 草提取物对皮肤的安全性是公知的。
本发明中用于提取有效成分的溶剂，是水(可以是中性、弱酸或弱碱性)或以水作 为主要成分，适当添加了其它溶剂(可以是有机溶剂)的水性的提取溶剂，还可以采用含醇 的水溶液等。作为醇，可以列举甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇等公知的醇溶剂。而且，被这些 溶剂提取的有效成分在水和乙醇(=ethyl alcohol)中都是可溶性的。
通过这种水性溶剂进行的提取操优选在用于提高提取效率的温水或热水的状态 下进行。尤其是，如果在10(TC以上、优选在100 130°c下进行提取操作，可有效提取对 BCL-2蛋白表达、细胞凋亡抑制或表皮细胞的紫外线DNA损伤防止有效的成分。
在提取工序中，优选用活性碳等吸附剂过滤提取液，或利用固体与液体的比重差、 重力或离心力产生的沉降速度差分离固液，除去悬浮物质。
作为吸附剂，可以是像活性碳等这样的提供使大量正吸附发生的界面的物质，在 对按上述方式获得的透明性液体浓缩并再用水或乙醇等稀释后，优选通过过滤等方式分离 除去浓缩产生的不溶物，进一步纯化使其更完善。作为吸附剂的具体例子，可以列举像活性 碳这种由多孔体构成的无机类吸附剂以及合成吸附剂(有机类吸附剂)。
作为无机类吸附剂，可以列举活性氧化铝、硅凝胶、氧化钛等金属氧化物、还原物、氢氧化物、膨润土、酸性粘土等粘土矿物、硅藻土、滑石等有解离性的含水硅酸盐矿物。
活性碳，其材质虽没有特别严格选择使用，但以木炭、竹子或椰子壳作为原料的活 性碳，其由微小粒子构成的悬浮物质的吸附效率好，因而优选。
合成吸附剂由一直到粒子内部都形成微细的连续孔的离子交换树脂制的粒子构 成，可以列举芳香族系的交联苯乙烯类多孔聚合物、使溴原子与芳香族聚合物的芳香核化 合的取代芳香族系的物质、或以甲基丙烯酸酯聚合物为骨架的作为亲水性吸附材的丙烯酸 性的物质。
作为这种除去悬浮物质的固液分离的其它操作，可以采取使提取液通过装满活性 碳颗粒的柱子等容器，或在提取液中加入活性碳粉末(根据需要加入滑石等过滤辅助剂) 后进行搅拌，用滤纸或滤布等捕捉前述活性碳的粉末粒子的过滤装置过滤该混合物的方 法，此外还可以采用通过离心分离或沉降速度差进行的公知的固液分离手段。
对水性溶剂提取物的浓缩操作可以采用减压操作或加热浓缩等公知的浓缩手段。 浓缩比例为2 100倍左右，尤为优选在5 50倍左右，通常优选10倍左右的浓缩。
优选再用前述水性溶剂提取液或与其相当的水性溶剂再稀释所获得的浓缩物。稀 释率不需要特别限定，例如我们认为优选恢复到浓缩前的容积程度的稀释率，例如2 100 倍左右。然后，以前述浓缩和稀释的操作作为1个工序，优选重复进行2个工序以上。
为了进一步纯化这样获得的液体，浓缩后，优选使用乙醇浓度99. 5 %以上的无水 乙醇作为提取溶剂。
为了将通过固液分离获得的乙醇可溶性成分作为皮肤外用剂进行调制，可以制备 成如果与具有适当的亲水性 亲油性，皮肤付着性好的皮肤外用剂用基剂混合，或者将提取 液与乳膏、软膏、乳液等基材混合，就可以在皮肤上涂布的这样的制剂形态。
作为本发明的BCL-2蛋白表达剂、细胞凋亡抑制剂和表皮细胞的紫外线DNA损伤 防止剂的制剂形态，没有特别限定，例如，作为外用剂，可以制成公知的形态，优选制成像水 溶性液、乳液、乳膏、软膏、粉剂等这样容易涂抹于皮肤的制剂形态。
此外，作为上述化妆品的其它使用，本发明的BCL-2蛋白表达剂还可以制成例如 注射剂、吸入剂、口服剂、栓剂、软膏等药品、医药外用品的制剂形态，还可以与各制剂中可 通常使用的公知成分混合后使用。
如后所述，水和乙醇可溶性的甘草提取物的作为BCL-2蛋白表达剂、细胞凋亡抑 制剂和表皮细胞的紫外线DNA损伤防止剂的有效成分，优选被配合成以最终浓缩物的干燥 物(干燥固体物质)的配合重量％计对皮肤为0. 1 10重量％这样的浓度进行配方。
实施例
[甘草提取液(T)实际生产的制造方法]
1)[在200kg东北甘草丝中加入2000升(以下，用L表示升)水，于95°C提取2. 5 小时，用振动筛(300目、不锈钢制)过滤提取液。将获得的提取滤液浓缩(液温60°C以下、 减压)，喷雾干燥浓缩液(喷雾干燥原液)，获得了干燥提取物。将该提取物过筛(60目、不 锈钢制)，获得了产量为20kg的甘草干燥提取物(T原)。
2)在1)中获得的20kg东北甘草干燥提取物(T原)中加入100L药典乙醇，搅拌 6小时，用2号滤纸过滤。
3)在滤液中加入药典乙醇，使得终体积达到100L，加入4. ^g的活性碳(粒状白鷺KL)，搅拌3小时，用2号滤纸过滤。重复进行3次这样的工序。
4)在幻获得的滤液中加入药典乙醇，使得终体积达到100L，将其浓缩至10L(50°C 以下、减压)。进而加入400g活性碳(粒状白鷺KL)，搅拌2小时，用2号滤纸过滤。重复 进行6次这样的工序。
5)在4)获得的滤液中加入药典乙醇，使得终体积为10L，浓缩至2L。在其中加入 IL药典乙醇和IOOg活性碳(粒状白鷺KL)，搅拌3小时，用2号滤纸过滤。
6)在5)获得的滤液中加入药典乙醇，使得终体积为2L，加入IOOg活性碳(粒状 白鷺KL)，搅拌3小时，用2号滤纸过滤。
7)在6)获得的滤液中加入药典乙醇，使得终体积为2L，用5号滤纸过滤。
8)对7)获得的滤液进行浓缩(40°C以下、减压)干燥后，加入300mL水，提取(振 荡、室温)，用5号滤纸过滤。进行3次这样的工序。
9)使8)获得的滤液达到1L。
将250mL的9)获得的滤液通过水浴加热到95 100°C，在获得的浓缩物(37. Ig) 中加入IL的99. 5%无水乙醇(Konishi公司)，取出乙醇可溶性级分，加热到95 100°C， 获得浓缩物5g)。在其中加入50mL的纯净水和50g的活性碳(和光纯药社制活性碳 粉末)，进行搅拌的同时，加入75g的滑石(丸石制药社制)，再进行搅拌后，用滤纸过滤。在 将获得的滤液加热到95 100°C而获得的浓缩物(14. 7g)中加入400ml的99. 5%无水乙 醇(Konishi公司)，取出乙醇可溶性级分，在经加热到95 100°C而获得的浓缩物(11. 7g) 中加入50mL纯净水和30g活性碳(和光纯药社制活性碳粉末)，在进行搅拌的同时，加入 50g的滑石(丸石制药社制)，再搅拌。然后，用滤纸过滤，在加热得到的滤液到95 100°C 而获得的浓缩物(8. 6g)中加入400ml的99. 5%无水乙醇(Konishi公司)，取出乙醇可溶 性级分，得到经加热到95 100°C而获得的浓缩物(5. 2g)。在2. Og的该浓缩物中加入纯 净水，得到60g的产物，将其作为试样。
甘草提取物的有效成分，如果换算为上述最终浓缩物(5.2g)干燥物的配合重 量％，我们认为使其与皮肤在0.1 10重量％这样的浓度范围下接触，对于为了获得本发 明效果而言是有效的。
[评价实验(1)方法]
1)将4周龄的C56BL6雄性小鼠(日本SLC)驯化1周后，剃毛后分组。实验组为 第1组至第5组这五组，各组为15只小鼠。
第1组(比较例) 第2组(实施例) 第3组(实施例) 第4组(实施例) 第5组(比较例)紫外线照射前后PBS涂布 紫外线照射前试样涂布 紫外线照射后试样涂布 紫外线照射前后试样涂布 只剃毛2)试样于4°C保存，涂布前恢复到室温。
3)在紫外线照射中，照射全波长紫外线(UV-A、-B、-C)，使得对皮肤产生急性紫外 线损伤，而此时，在紫外线照射试样前M小时或照射后立刻涂布于小鼠皮肤上，研究急性 紫外线损伤的变化。
4)剃毛部位是有肋骨胸椎下缘与脊椎的交点为中心的2cm见方剃毛面积为km2。7剃毛用电动理发推子(National)进行，不使用剃刀。
5)紫外线照射用紫外线发生装置(XX-15BLB，UVPCo, Tokyo, Japan)，以紫外线强 度llmW/cm2 (照射距离5cm)，照射1. 5分钟。此时的紫外线照射量为1. OJ/cm2。
6)照射时，用戊巴比妥钠(nembutal) (mg/小鼠皮下注射)对小鼠实施麻醉，然后 用带子固定四肢，保持照射中体位的安静。
7)用棉棒将200 μ 1的试样全量于剃毛部边干燥边涂抹。
8)在紫外线照射后M小时后，通过颈椎脱臼屠宰小鼠，从包含其周围非剃毛部位 的筋膜上剥离剃毛部位皮肤，在橡胶板上展开，用10%福尔马林固定M小时。
9)从标本中央部位切出宽度为4mm的皮肤切片组织，制成石蜡包埋块，再制成 3μπι厚的薄切标本。
10)用薄切标本，进行苏木精核染色(以下，也简称为HE染色)和免疫染色。
11)免疫染色采用以下抗体，如表所示，进行抗原活化、稀释。抗体稀释、清洗时采 用 Optimax Wash Buffer (Biogenex)。
抗体名克隆处理浓度
PCNA (DAKO) PClO 柠檬酸-MW 1/50
BCL-2 (DAKO)胃蛋白酶1/100
ss-DNA(IBL)胃蛋白酶1/200
T-T 二聚体(供给) 胃蛋白酶 1/200
12)免疫染色的步骤如下。
1 脱石蜡、加水
2 抗原活化
3 0. 3% H202-甲醇处理
4 一次抗体处理
5 洗净
6: 二次抗体处理
7 洗净
8 =DAB 显色
9 苏木精核染色
10 封入
13)在通过HE染色进行的组织病理评价中，获得了毒性病理认定医生的确认。
14)免疫染色的判定
(1)对于PCNA、ssDNA和D-D 二聚体，在显微镜下观察包括表皮细胞全层的500个 细胞，在核中观察到阳性的细胞为阳性。
另外，PCNA(增殖细胞核抗原)由于在呈现出细胞增殖能力的整个细胞周期都比 较稳定，在非增殖细胞中以非常低的水平而稳定，而一旦进入细胞分裂周期就激增，因此其 成为能够检测由非增殖细胞群向增殖细胞群移行的标记。
(2)就BCL-2而言，与标本内的非剃毛部位皮肤(=非紫外线照射部)中的BCL-2 表达相比，免疫反应更强的为阳性。染色强度低于非照射部位表皮时，则为阴性，为相同程 度的2倍以下的为阳性、2倍以上的则为强阳性。
[实验结果]
通过上述的实验方法，所获得的形态学变化的结果示于表1。即，就形态变化研究 试样对于小鼠皮肤紫外线照射中的表皮细胞变化的影响。
[表1]
权利要求
1.一种BCL-2蛋白表达剂，其特征在于，含有水和乙醇可溶性的甘草提取物作为有效 成分。
2.一种皮肤用BCL-2蛋白表达剂，其特征在于，在权利要求1所述的BCL-2蛋白表达剂 中，BCL-2蛋白的表达为表皮细胞中的BCL-2蛋白的表达。
3.根据权利要求2所述的皮肤用BCL-2蛋白表达剂，其中，所述表皮细胞为色素干细胞。
4.一种细胞凋亡抑制剂，其特征在于，含有权利要求1或2所述的BCL-2蛋白表达剂作 为有效成分。
5.一种表皮细胞的紫外线DNA损伤防止剂，其特征在于，含有权利要求1所述的甘草提 取物作为有效成分。
全文摘要
一种细胞凋亡抑制剂，其抑制具有被紫外线等直接或间接地损伤了的DNA的细胞的细胞凋亡，且可以加入到提高细胞的组织修复性的各种药剂中，且可期待有广泛应用。其是含有水和乙醇可溶性的甘草提取物作为有效成分的表皮细胞等的细胞凋亡抑制剂。细胞凋亡抑制剂具有由于BCL-2蛋白质的表达而产生的抗细胞凋亡因子，具有对紫外线导致的DNA损伤的防止性。其减轻由于表皮细胞暴露于紫外线而导致的DNA损伤，而且对正常的皮肤细胞没有异常或坏的影响。
文档编号A61Q19/06GK102036674SQ200880129399
公开日2011年4月27日 申请日期2008年5月23日 优先权日2008年5月23日
发明者田北雅夫 申请人:有限会社西原