专利名称：花生2s-4b蛋白在诱导细胞凋亡中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及花生融合蛋白在诱导细胞凋亡中的应用。
背景技术：
癌症是目前严重威胁人类健康与生命的“三大杀手”之一，其发生率逐年增高，在 2008年，全世界有2500，0000癌症病人，估计有1200，0000癌症新增病例，700，0000人万死于癌症。预计在2030年将有2700，0000癌症病人，1700，0000人死于癌症(World cancer report 2008)。其中超过一半的癌症病例和60%的癌症死亡病例发生在中等达国家。而在所有的癌症中，肺癌的发病率和死亡率都是最高的。非小细胞肺癌(NSCLC)为肺癌的主要类型，占肺癌的75% 80%。手术为其首选的治疗方法。但由于当前肺癌的早期诊断水平有限，70% 80%的患者确诊时已属晚期，总的治愈率不足10%。肺腺癌是肿瘤临床中非小细胞肺癌(NSCLC)常见的类型之一，具有易侵袭、易转移和易产生耐药等特点，因此还亟待寻找更有效的治疗肺腺癌药物(Collins，2005 ；Kopper，2004)。胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor, Tl)泛指具有胰蛋白酶抑制活性的多肽或蛋白质，广泛存在于动、植物和微生物中，能与相应的蛋白水解酶形成一定的动态平衡， 具有多种生物活性，调节生物体内许多重要的生命活动，而且很多已被开发为新药，是一种重要的生化药物和生化试剂(Maya，1997)。因此，人们对肿瘤相关的胰蛋白酶抑制剂 (tumor-associated trypsininhibitor，TATI)在医学上的应用越来越感兴趣。国内外众多的研究表明植物胰蛋白酶抑制剂具有抗肿瘤的功能。可能是一种新的抗肿瘤药物。花生蛋白抗肿瘤的作用是近几年才受到人们的关注，相关研究不多，并没有深入研究它对肿瘤的影响及其作用机理。本实验室段小华(2004)从花生种子中纯化分离出一个具有胰蛋白酶抑制活性的 2s清蛋白。经PAGE、HPLC分离，纯化的2s清蛋白含有两条多肽，而经SDS-PAGE分析，此 &清蛋白由5种低分子量的亚基组成。温韵洁(2008)发现k蛋白各组分对胰蛋白酶均有一定的抑制作用。花生^蛋白对胰蛋白酶具有抑制作用，此外，还对淀粉酶有一定的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶和胃蛋白酶无抑制作用。对该蛋白进行氨基酸分析发现它富含 Cys，属于Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂类(BBI) (Tixier，1968 ；杨晓泉等，1998)。黄叶可 (2010)利用双向电泳发现每种亚基并不是由单一蛋白组成。植智聪(2010)对花生种子k 清白中的2s-4b进行基因克隆、原核表达。有研究表明，花生仁、花生油、花生壳、花生种皮、茎、叶、芽等均有药用价值(周萍等，2008)。但是对花生中的^清蛋白的药用价值研究较少。
发明内容
本发明的目的是基于实验室研究的基础上，对花生种子2s清蛋白中的融合蛋白诱导表达，纯化和复性，以及对融合蛋白进行肠激酶酶切制备单体蛋白，并对其蛋白酶抑制剂活性进行测定。研究蛋白对肺腺癌A549细胞增殖抑制、凋亡和细胞周期的影响。另外对蛋白的抑癌机理进行初步探究。为从花生中挖掘抗肿瘤新药提供一些实验和理论基础。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
本发明公开了一种新型抗肿瘤蛋白花生蛋白，运用生物信息学手段对办-办编码蛋白的结构特点、性质与功能进行分析和预测，得知其开放阅读框(ORF)共含519 bp, 包括起始密码子ATG和终止密码子TAA，编码172个氨基酸，分子量为20. 1 kDa，等电点为 5.96。办编码蛋白的N端含有一个长约20个氨基酸的信号肽，具有AAI结构域；其二级结构主要由α-螺旋组成。上述花生蛋白，由2s_4b融合蛋白酶切后得到，不含有载体蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。本发明还公开了上述融合蛋白的原核表达载体pET-32a-_&-办。本发明还公开了 2s_4b蛋白的制备方法包括如下步骤 1. 2s-4b cDNA 的克隆
提取花生总RNA并对RNA的含量和质量进行测定，从花生总RNA合成第一链cDNA与 3’-cDNA。根据本实验室获得的k蛋白，设计的简并引物。进行PCR，回收目的条带进行亚克隆和测序，获得基因简并引物片段。根据简并引物所得的测序结果，设计 2s-4b 3’-RACE上游引物进行3’-RACE的PCR扩增。根据简并引物所得的测序结果，设计 2s~4b 5，-RACE下游引物采用TaKafci公司5，-Full RACE Kit试剂盒，从花生cDNA中扩增目的基因5’端片段。将3’和5’ -RACE测序获得的3’和5’ -cDNA末端在DNAMAN6. 0上进行序列拼接，获得一条cDNA全长序列。比对该序列与MS结果上的氨基酸位点，确定其为 2s-4b基因。2. pET-32a-2s-4b原核表达载体的构建
取含有ρΕΤ-3^ι空质粒的DH5a菌进行培养，提取质粒。将办-劝基因纯化产物和 pET-32a质粒进行双酶切，回收纯化酶切产物。然后将2s-4b基因与pET_3h质粒进行连接，构建成功pET-32a-_&-办重组质粒。将构建好的重组质粒转化到ZfoMi菌株的感受态细胞中。3. 2s-4b融合蛋白的诱导表达、纯化及酶切
将含有表达质粒pET-32a-_&-办的Rosetta-gami菌进行培养，加入IPTG进行诱导。 经SDS-PAGE检测，得到一条分子量40 kDa的目的条带。然后离心收集菌体，用破碎缓冲液进行破碎，离心去上清。将上清稀释后上样至His · Bind Resin Ni-charged亲和层析柱， 然后将目的蛋白洗脱。洗脱后的目的蛋白稀释后在复兴缓冲液中进行复性，将复性后的的目的蛋白进行胰蛋白酶抑制剂活性测定。将复性后的融合蛋白浓缩用肠激酶进行酶切，酶切产物上样至His · Bind Resin Ni-charged亲和层析柱纯化，洗脱回收不含载体蛋白的蛋白。经SDS-PAGE检测，2s-4b蛋白分子量为20 kDa左右，与软件预测值一致。 最后对回收的2s-4b蛋白进行浓缩和胰蛋白酶抑制剂活性测定，期胰蛋白酶抑制剂活性略高于融合蛋白。通过检测，证明所获得的蛋白为具有胰蛋白酶抑制剂活性2s-4b蛋白。本发明还公开了 2s_4b蛋白的抗肿瘤用途。以肺腺癌A549细胞为靶细胞，以不同浓度的蛋白体外处理细胞后，采用MTT检测、形态学观察、流式细胞检测等方法测定 2s-4b蛋白体外诱导肺腺癌A549细胞的凋亡作用。研究结果表明，2s-4b蛋白对肺腺癌 A549细胞的抑制率可达到90 %，早期凋亡率最高可达到37. 4%，对肺腺癌A549细胞的抑制效果明显。本发明还公开了 2s_4b蛋白诱导肺腺癌A549细胞的凋亡机制。通过人类全基因芯片对蛋白处理后的和未经蛋白处理的肺腺癌A549细胞的基因进行分析。 人类全基因芯片提供的基因列表共232 个基因共检测到9940个基因，差异表达基因共 499个。经过筛选后得出，AM9细胞在蛋白处理前后共有18个与凋亡和细胞周期相关的基因表达发生改变。2s-4b蛋白处理AM9细胞后与凋亡相关的差异表达基因有 Apaf-I> Caspase3> Caspase7> Caspase8> Caspase6>IAP> Trai Ir> TRADD> Endog 等 9 个。与细胞周期调控通路相关的差异表达基因有P21cipl、P57kip2、Skp2、P19ink4d、P18ink4c、 CycE、Gadd45、CDK7、GSK3 β 等 9 条。本发明所用的办-办简并引物扩增序列如SEQ ID NO: 2所示；所用的办-办 3，RACE序列如SEQ ID NO: 3所示；所用的办-办5，RACE序列如SEQ ID NO: 4所示;办-办拼接全长序列如SEQ ID N0:5所示。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明中基因克隆采用的是RACE (Rapid Amplication of cDNA Ends，cDNA末端快速扩增)技术，该技术由已知的部分cDNA序列扩增出完整的cDNA的5’末端和3’末端，是一种简单可靠和有效的方法。利用原核表达体系，通过IPTG诱导实现^-仙融合蛋白在大肠杆菌中的简单、快速、高效的表达。本发明公开的融合蛋白在大肠杆菌中的表达量占全菌蛋白含量的58%。结合简单的分离纯化步骤易得到纯度85%的^-仙融合蛋白。采用透析的方法通过逐渐降低外透液浓度缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构。通过肠激酶酶切可切掉融合蛋白中的载体蛋白，经再次纯化得到蛋白片段，排除载体蛋白带来的影响。采用本发明的蛋白序列和表达体系容易制备大量该蛋白，利于产业化生产。本发明还对该蛋白对肺腺癌A549细胞的抑制作用进行了评价。该蛋白能抑制肺腺癌A549细胞的生长，其IC50为150 Pg/mL左右。经形态学观察，发现蛋白作用 A549细胞后可清楚观察到细胞凋亡现象，并且呈现显著量效、时效的依赖关系。经流式细胞仪分析，蛋白作用A549细胞后细胞被特异性的阻滞在Gl期，细胞最高早期凋亡率达到37. 4%。该蛋白对肺腺癌A549细胞具有较好的抑制效果，可能具有更好的临床应用效果。
图1为花生总RNA的质量分析；
图2、是简并引物扩增片段、3’序列及5’序列的获得，其中，k为2s-4b简并引物PCR电泳图，B为2s-4b 3，RACE PCR电泳图，C为2s_4b 5，RACE PCR电泳图； 图5为2s-4b拼接含酶切位点cDNA PCR电泳图 6 为 pET-32a-2s-4b 重组质粒双酶切，其中，Ml :DL2000 DNA Marker ；M2 :250 bp DNA Ladder Marker ；1 :pET-32a-2s_4b 重组质粒，2 :pET-32a-2s_4b 重组质粒双酶切；3 pET-32a-2s-4b 重组质粒单酶切，4 :ρΕΤ_3^ι 质粒；5 :ρΕΤ_3^ι 质粒双酶切，6 :ρΕΤ_3^ι 质粒单酶切；
图7为2S粗蛋白的2D-SDS-PAGE电泳；
图8为融合蛋诱导表达，其中，M:低分子量蛋白标准，1、2、3 :IPTG诱导融合蛋白表达；
图9为包涵体的复性，其中，M 低分子量蛋白标准，1、2、3:复性后的2s-4b融合蛋
白；
图10为2s-4b融合蛋白复性后蛋白酶抑制剂活性测定； 图11为2s-4b融合蛋白酶切，其中，M低分子量蛋白标准，框中为目的条带； 图12为2s-4b融合蛋白酶切纯化效果检测，其中，M 低分子量蛋白标准，1 :2s-4b蛋白，2 :2s-4b融合蛋白；
图13为蛋白对肺腺癌细胞的抑制率； 图14为荧光显微镜观察蛋白诱导肺腺癌A549细胞； 图15为流式细胞检测蛋白处理A549细胞。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。实施例1 2s_4b cDNA的克隆
1.采用本领域常规的Trizol法提取花生总RNA。2. RT-PCR 检测
3.从花生总RNA合成第一链cDNA与3’ -cDNA
使用 TaKaRa PrimeScrioptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 进行反转录合成 cDNA第一链。反应体系和反应条件参考相关试剂盒说明即可(图1)。4. 2s-4b基因简并引物片段的获得
根据本实验室获得的2s蛋白MS-MS结果，设计2s-4b的简并上下游引物如SEQ ID NO:6 7 所示。其中 R = A/G，Y = C/T，M = A/C，K = G/T，S = C/G，W = A/T，H = A/C/T，B =C/G/T, = A/C/G，D = A/G/T，N=A/C/G/T。在一个 200 μ L Eppendorf 薄壁管中配制 60 μ L PCR反应体系。5. 2s-4b cDNA 3’ 端的获得
根据简并引物所得的测序结果，设计2s-4b 3，- RACE上游引物如SEQ ID N0:8 9所
7J\ ο采用办-办3-1、办-办3-2与试剂盒提供的通用引物AUAP (如SEQ ID NO: 10所示)组合进行3’ -RACE的PCR扩增。6. 2s-4b 的 5，RACE 片段的获得
根据简并引物所得的测序结果，设计2s-4b 5'-RACE下游引物如SEQ ID N0:1广14所
7J\ ο采用TaKafei公司5，_Full RACE Kit试剂盒，从花生cDNA中扩增目的基因5， 端片段。
7. 2s-4b cDNA编码区序列的获得
将3’和5’-RACE测序获得的3’和5’-cDNA末端在DNAMAN6. 0上进行序列拼接， 获得一条cDNA全长序列。比对该序列与MS结果上的氨基酸位点，确定其为目的基因。通过分析已经得到的办-办的cDNA序列与pET32a载体的酶切位点，选择Nco I与Not I这两个限制性内切酶，设计引物HNcoF (如SEQ ID NO: 15所示)和办-办-NotR (如 SEQ ID NO: 16 所示)。表1为MS分析结果；表2为MS分析所得的氨基酸片段。 表 1
ProteinNameAccessionNo.ProteinMWProteinPIProteinScoreProt einS coreC. I.%allergenll[Arachishypogaea]Gi.1541870518155.75. 67237100seedstorageprotein[Arachishypogaea]Gi. 2891276819309.25. 68235100CongIutin-7precursor (SeedstorageproteinSSPl)(SeedstorageproteinSSP2)(2Sprote in1)Gi. 14763915420101.65. 96234100
表2
起始位点终止位点氨基酸序列3339CQSQLER4052ANLRPCEQHLMQK93102GAGSSQHQER103115CCNELNEFENNQR116131CMCEALQQIMENQSDR136143QQEQQFKR147155NLPQQCGLR
实施例2 m~^-2s-4b原核表达载体的构建与鉴定 \.2s~4b基因PCR产物的纯化
使用 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit 对 2s_4b 的 PCR 产物进行纯化。2. 2s_4b基因纯化产物和pET_3h质粒的双酶切 3.酶切产物胶回收纯化
2s~4b基因酶切产物的纯化使用TaKaRa DNA片段纯化试剂盒进行。4. 2s~4b基因与pET_3h质粒的连接使用TaKafci公司的jM DNA Ligase进行连接。5.大肠杆菌感受态细胞的制备
6.重组质粒-办的转化
7.重组质粒的检测
通过PCR鉴定抗性板上的大肠杆菌中pET-3h质粒是否连接了 2s-4b全长cDNA 片段。-办重组质粒的双酶切鉴定。实施例同源基因《^切仍反义消减载体和正向过表 1. 2s-4b融合蛋白的诱导表达
(1)将pET-3^i-2s-4b重组质粒分别转入大肠杆菌Rosetta-gami中。(2)挑单菌落接种于2 ml含有四抗的LB液体培养基中，37 °C，200 rpm培养 12 h。(3)取200 μ 初摇菌液于20 ml含有四抗的LB液体培养基中，37 °C，200 rpm 培养4 5 h (测定菌液0D590=0. 5 1.9)。(4)当菌液0D590到达0. 5 1. 9时，取出1 ml菌液，10，000 X g，室温离心1
7min，弃培养液，加入100 μ 灭菌的PBS重悬菌体，-20 °C保存。(5)向剩余的培养菌液中加入IPTG使终浓度达到0.1 mM和1 mM，在37 °C, 200 rpm培养，诱导目的基因的表达。(6)诱导1 h、2 h、3 h和4 h的时候分别取出2 ml菌液(1 ml/管)一管用于测定菌液浓度(0D590)，另一管10，000 X g，室温离心1 min，弃培养液，加入100 μ 灭菌的PBS重悬菌体，-20 °C保存。(7)按PBS重悬样品液灭菌双蒸水2XSDS电泳裂解液=1 4 5配制电泳样品液，沸水浴5min后，13，000 X g，室温离心5 min，取上清进行12.5 %的SDS-PAGE电泳，电泳后胶板进行考马斯亮蓝R-250染色，12 %甲醇-8 %乙酸脱色。2. 2s-4b融合蛋白包涵体变性溶解
(1)收集28 0C 0. 5 mM IPTG诱导的培养菌液，4 °C 12000 X g离心10 min，收集沉淀的菌体。(2)取0. 1 g菌体加10 mL破碎缓冲液(IX结合缓冲液，8 M尿素，2 mM DTT, 5 mg/ml溶菌酶，pH 7. 9)混勻，在冰上放置30 min后，室温放置过夜。(3)破碎后的菌液用1 mL注射器吹打至不粘稠，12000 X g，4 V离心1 min，上清即为包涵体溶解液。3. 2s-4b融合蛋白包涵体的纯化
(1)取1 ml镍琼脂糖凝胶预装柱，加4倍柱体积的双蒸水洗柱。用6倍柱体积的IX 清洗缓冲液洗柱。用4倍柱体积的IX结合缓冲液(含8 M尿素)平衡柱子。(2)取包涵体溶解液1 ml以0. 5 ml/min上样，反复上样1 h。(3)用9倍柱体积的IX结合缓冲液(含8 M尿素)洗去未吸附的样品，流速 0. 5 ml/min, 2 ml/ 管收集。(4)用6倍柱体积的IX洗涤缓冲液(含8 M尿素)洗去杂质，流速0.5 ml/ min。用4倍柱体积的IX洗脱缓冲液(分别含20、50、100、250、500 mM咪唑，8 M尿素) 梯度洗脱目的蛋白，流速0.5 ml/min, 2 ml/管收集。收集的部分用12.5%的SDS-PAGE 电泳检测纯度，并用考玛斯亮蓝法测定纯化蛋白的浓度。4.包涵体的复性
参考Bovine Prethrombin等(1990)的方法，稍作修改后进行包涵体的复性。(1)纯化后的融合蛋白稀释至蛋白浓度为0. 025、. 1 mg/mL。(2)使用尿素梯度浓度透析复性复性液(100 mM Na2HPO4, 2 mM EDTA，0. 1 mM GSSG，0. 2 mM GSH，pH 7. 9)含尿素浓度分别为6 M、4 M、2 M，每个浓度在4 °C透析24 h。(3)最后在4 °C透析于PBS缓冲液M h，中间更换一次PBS缓冲液。(4)复性好的蛋白利用超滤管进行浓缩。(5)浓缩好的蛋白储存于-20 0C冰箱，用12.5% SDS-PAGE检测蛋白纯度，并用 Bradford法测定蛋白质的含量。5. 2s-4b融合蛋白蛋白酶切
将1 ml复性、浓缩后的2s-4b融合蛋白与10 μ 重组肠激酶混合，在25 °C下酶切过夜。酶切后的蛋白用His· Bind Resin Ni-charged亲和层析柱进行纯化，2s_4b片段上未连有His标签将不会与柱子结合，而切下的硫氧还蛋白片段上连有His标签会与柱子结合，那么用PBS洗脱下来就是2s-4b片段。6.目的蛋白胰蛋白酶抑制活性的测定
方法参照 Norika 等(1982)和 Raya-Duarte 等(1992)。(1)取出0. 1 ml复性后的2s_4b重组蛋白，加入0. 1 ml 2. 5 mg/ml的胰蛋白酶液，37 "C水浴20 30 min。(2)加入 1 ml 的 1 mM 的 BAPNA 溶液，37 °C水浴 10 min。(3)加入0.2 ml的30%醋酸终止酶反应。(4)4 "C 放置 30 min。(5)4 "C, 10, 000 X g离心5 min (保证溶液不混浊) (6)测上清液410 nm处光吸收值(Al)
以PBS缓冲液代替胰蛋白酶液作为空白对照；以PBS缓冲液代替蛋白样品作为无抑制剂对照，测定光密度值(A2)即 表权利要求
1.花生蛋白在诱导细胞凋亡中的应用，所述花生蛋白由2s_4b融合蛋白酶切后得到，不含有载体蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.根据权利要求1所述花生蛋白的应用，其特征在于所述细胞为A549细胞。
全文摘要
本发明公开了花生2s清蛋白组分中2s-4b蛋白在诱导癌细胞凋亡中的应用。本发明2s-4b蛋白蛋白能诱导肺腺癌A549细胞凋亡，并对其凋亡机制进行了研究。具有广阔的应用前景。
文档编号C07K14/81GK102533781SQ20111045365
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月30日 优先权日2011年12月30日
发明者宾金华, 张子明, 植智聪, 龙明慧 申请人:华南师范大学