专利名称：：重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及生物制品的冷冻干燥领域，尤其涉及一种重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂及其制备方法
背景技术：
：由于冻干药品呈多孔状、能长时间稳定贮存、并易重新复水而恢复活性，因此冷冻干燥技术广泛应用于制备固体蛋白质药物、口服速溶药物及药物包埋剂脂质体等药品。冻干制剂可以^艮好的保护蛋白的活性，但是在冻干的过程中产生的多种应力，如低温应力、冻结应力、干燥应力可以使蛋白变性，为了保护蛋白活性，在冻干前需要加入保护剂来保护蛋白的活性。据文献报道，常用的冻干保护剂主要包括多羟基化合物、糖、氨基酸和蛋白质类。目前国内外常用于蛋白药物冻干保护剂常用的为甘露醇、白蛋白、海藻糖、蔗糖、乳糖、甘氨酸、聚乙二醇(PEG)。白蛋白潜在的血源性病原体污染的问题，目前的生物制品都趋向于不使用，乳糖是还原性糖，有可能于蛋白质上暴露的某些氨基酸随机发生迈拉德反应，使制品变黄和蛋白质活性降低等问题。月中瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligand,TRAIL)亦称凋亡素-2(Apo-2ligand,Apo-2L)，是1995年Wiley发现的肿瘤坏死因子家族成员，是继TNFa、FasL之后新发现的具有介导细胞凋亡能力、存在于细胞表面的细胞因子配体。TRAIL可以在体内选择性的介导细胞凋亡，能够迅速诱导体内多种肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞无毒害作用。因此，TRAIL的选择性杀伤肿瘤细胞的特性，使其成为胂瘤治疗药物开发的热点。为了更好的保持TRAIL蛋白冻干制剂的活性，有必要对其冻干保护剂做进一步研究，开发出适合TRAIL蛋白冻干处理的方法。
发明内容为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种重组人可溶性肺瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(rhTRAIL)冻干保护剂。本发明的另一个目的在于提供一种重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂制备方法。为达到上述目的，本发明的技术方案为重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂，其特征在于由下列成分组成磷酸盐、氯化钠、甘露醇、糖和水。所述磷酸盐的终浓度为5mmol/L至100隨ol/L，氯化钠的终浓度为20隱ol/L至100mmol/L，甘露醇质量与溶液体积的比例为0.5%-6%，糖质量与溶液体积的比例为0.5%-3%，溶剂为水。优选地磷酸盐的终浓度为5-20mmol/L，氯化钠的终浓度为20-50mmol/L，甘露醇质量与溶液体积的比例为3-5%,糖质量与溶液体积的比例为0.5-2%，溶剂为水。所述糖为蔗糖。所述糖为海藻糖。重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂制备方法，包括以下步骤1)称取磷酸盐，加入适量的水溶解；2)加入氯化钠，使其完全溶解；3)加入糖和甘露醇，使其完全溶解，用水定容至一定体积。所述磷酸盐为磷酸钠，其中磷酸根离子的总浓度为5mmol/L至100mmol/L,氯化钠的终浓度为20mmol/L至100mmol/L,甘露醇质量与溶液体积的比例为0.5°/。-6%,糖质量与溶液体积的比例为0.5%-3%。优选地磷酸根离子的总浓度为5-20mmol/L,氯化钠的终浓度为20-50mmol/L,甘露醇质量与溶液体积的比例为3-5°/。，糖质量与溶液体积的比例为0.5-2%。所述糖为海藻糖。所述糖为蔗糖。本发明所述重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂具有如下优点1)甘露醇是常用的保护剂，不仅可以作为优良的骨架剂，而且是很好的蛋白冻干保护剂。2)蔗糖和海藻糖都属于糖类冻干保护剂，是蛋白质的非特异性稳定剂，在冻干的各个阶段:预冻、冻融、升华、干燥等，均能对蛋白质药物起到一定的保护作用。蔗糖化学性质稳定，多呈无定形结构，对阻止蛋白质二级结构改变，冻干处理过程中与储存期内蛋白质的伸展和聚集起显著作用。海藻糖具有更高的玻璃化温度、更低的引湿性，更不具有还原性，是一个很有前景的冻干保护剂。具体实施例方式实施例1一种重组人可溶性肺瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂，其成分为每1000ml重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂中含有Na2HP040.866g、NaH2P040.538g、甘露醇40g、蔗糖10g、NaCl2.93g，其余为水，即磷酸根离子的总浓度为10mmol/L,氯化钠的终浓度为50mmol/L，甘露醇质量与溶液体积的比例为4%，蔗糖质量与溶液体积的比例为1%。实施例2一种重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂，其成分为每1000ml重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂中含有Na2HP048.66g、NaH2P045.38g、甘露醇5g、海藻糖5g、NaCl5.86g，即磷酸根离子的总浓度为100mmol/L，氯化钠的终浓度为100mmol/L，甘露醇质量与溶液体积的比例为0.5%,海藻糖质量与溶液体积的比例为0.5%。实施例3一种重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂，其成分为每1000ml重组人可溶性肺瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂中含有肘2肝040.433g、NaH2P040.269g、甘露醇60g、蔗糖30g、NaCl1.172g,即磷酸根离子的总浓度为5mmol/L,氯化钠的终浓度为20mmol/L,甘露醇质量与溶液体积的比例为6%，蔗糖质量与溶液体积的比例为3%。实施例4一种重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂，其成分为每1000ml重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻千保护剂中含有Na2HP041.732g、M2P041.076g、甘露醇30g、蔗糖20g、NaCl2.93g，即磷酸根离子的总浓度为20腦ol/L，氯化钠的终浓度为5Ommol/L,甘露醇质量与溶液体积的比例为3%，蔗糖质量与溶液体积的比例为2%。实施例5一种重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂，其成分为每1000ml重组人可溶性肺瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂中含有Na2HP046.062g、NaH2P043.766g、甘露醇50g、海藻糖20g、NaCl3.516g,即磷酸根离子的总浓度为70mmol/L,氯化钠的终浓度为60mmol/L,甘露醇质量与溶液体积的比例为5%，海藻糖质量与溶液体积的比例为2%。实施例6一种重组人可溶性胂瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂制备方法，包括以下步骤1)称取8.66gNa2HP04、5.38gNaH2P04，加入适量的水溶解；2)加入5.86gNaCl,使其完全溶解；3)加入60g甘露醇和30g蔗糖，使其完全溶解，定容至一定1L。实施例7緩沖液磷酸盐浓度筛选对磷酸盐浓度进行筛选，观察不同磷酸盐浓度对rhTRAIL蛋白冻干制剂水份的影响，结果发现，随着磷酸盐浓度的升高，制品水份也随着升高，见表l。表l不同磷酸盐浓度对冻干水份的影响注磷酸盐緩冲液的英文全称是PhosphateBufferSaline,缩写是PBS。本实施例中选用磷酸钠盐，在冻干过程中，磷酸二氢钠与磷酸氢二钠吸水形成结晶水和冻干速度有关。结合原液的稳定性试验，最终选取10mmol/L磷酸盐緩沖液作为基础的緩冲液。磷酸盐緩冲液浓度是指磷酸根离子总浓度。实施例8冻干保护剂的筛选目前常用的冻干保护剂主要包括多羟基化合物、糖、氨基酸和蛋白质类。目前国内外常用于蛋白药物冻干保护剂常用的为甘露醇、白蛋白、海藻糖、蔗糖、乳糖、甘氨酸、聚乙二醇(PEG)。考虑到本制品的特点，白蛋白潜在的血源性病原体污染的问题，目前的生物制品都趋向于不使用，乳糖是还原性糖，有可能于蛋白质上暴露的某些氨基酸随机发生迈拉德反应，使制品变黄和蛋白质活性降低等问题。根据不同冻干保护剂的特点和保护作用机制，筛选出海藻糖、蔗糖、甘露醇、甘氨酸、PEG6000作为筛选对象对不同保护剂的浓度和组合进行制剂配方研究。按照配方成分分为六组，六组的基础緩冲液都是10m磷酸盐+50mmol/LNaCl，水份蔗糖(1%)+甘露醇(4%)+5mmol/LPBS蔗糖(1%)+甘露醇(4%)+10imio1/LPBS蔗糖(1%)+甘露醇(4%)+20mniol/LPBS蔗糖(1%)+甘露醇(4%)+50mmol/LPBS蔗糖(1%)+甘露醇(4%)+100imnol/LPBS其它成分分别为第一组海藻糖+甘氨酸；第二组海藻糖+甘露醇；第三組海藻糖+PEG;第4组蔗糖+甘氨酸；第五组蔗糖+甘露醇；第六组蔗糖+PEG。具体配方如表2所示。表2rhTRAIL冻干保护剂筛选配方<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>4-6蔗糖(1%)+甘氨酸(5%)4-7蔗糖(3%)+甘氨酸(0.5%)4-8蔗糖(3%)+甘氨酸(3%)4-9蔗糖(3%)+甘氨酸(5%)5-1蔗糖(0.5%)+甘露醇(0.5%)5-2蔗糖(0.5%)+甘露醇(2%)5-3蔗糖(0.5%)+甘露醇(4%)5-4蔗糖(1%)+甘露醇(0.5%)5-5蔗糖(1%)+甘露醇(2%)5-6蔗糖(1%)+甘露醇(4%)5-7蔗糖(3%)+甘露醇(0.5%)5-8蔗糖(3%)+甘露醇(2%)5-9蔗糖(3%)+甘露醇(4%)6-1蔗糖(0.5%)+PEG(1%)6-2蔗糖(0.5%)+PEG(4%)6-3蔗糖(0.5%)+PEG(8%)6-4蔗糖(1%)+PEG(1%)6-5蔗糖(1%)+PEG(4%)6-6蔗糖(1%)+PEG(8%)6-7蔗糖(3%)+PEG(1%)6-8蔗糖(3%)+PEG(4%)6-9蔗糖(3%)+PEG(8%)从外观结果来看，糖+PEG组合，rhTRAIL冻干制剂基本都是都出现了严重的裂缝和龟裂的现象；其它配方出现最多的主要是萎缩，中间突起等现象，从外观表面现象进行了初步筛选，选了18种外观好的配方重新冻干rhTRAIL，估文进一步筛选和比较。初步筛选的18种配方及冻干结果如下(表3)表3初步筛选出的18种配方及冻干结果编号#r幻1-5海藻糖(1%)+甘氨酸(3%)2.42991-6海藻糖(1%)+甘氨酸(5%)1.91091-7海藻糖(3%)+甘氨酸(0.52.91791-91.53602-3海藻糖(3%)+甘氨酸(5%)2.45042-7海藻糖(0.5%)+甘露醇(42.91872-9%)2.01214-2海藻糖(3%)+甘露醇(0.55.36874-5%)1.87754-6海藻糖(3%)+甘露醇(4%)1.54114-7蔗糖(1%)+甘氨酸(3%)2.82594-9蔗糖(1%)+甘氨酸(3%)2.12495-3蔗糖(1%)+甘氨酸(5%)1.99135-5蔗糖(3%)+甘氨酸(0.5%)3.14125-6蔗糖(3%)+甘氨酸(5%)1.89805-7蔗糖(0.5%)+甘露醇(4%)2.37035-9蔗糖(1%)+甘露醇(2%)2.0934通过以上试验，从外观上看，这17种配方比较适合，但是结合水份指标，结合成本、辅料来源等等综合因素考虑，最后决定选用糖+甘露醇组合。针对选定的糖+甘露醇组合，对不同比例的组合重新冻干rhTRAIL，并对成品做初步加速试验，加速试验在温度25°C±2°C，相对湿度60%士10%条件下进行6个月考察研究。冻干保护剂配方及结果见下表4。表4蔗糖+甘露醇组合配方及冻干结果，-紀方水分r幻1海藻糖(1%)+甘露醇(4%)1.28022海藻糖(2%)+甘露醇(3%)1.87353海藻糖(3%)+甘露醇(2%)2.01624海藻糖(3%)+甘露醇(1%)1.81305蔗糖(1%)+甘露醇(4%)1.18256蔗糖(2%)+甘露醇(3%)2.45917蔗糖(3%)+甘露醇(2%)2.82938蔗糖(3%)+甘露醇(1%)2.6034对冻干保护剂的初步稳定性进行研究，通过加速(25°C±2°C)试验，3,4,7，8号1个月后出现了严重萎缩现象，从水份、外观、活性而言，1号和5号配方比较适合，即1%糖+4%甘露醇的配方适合rhTRAIL冻干的要求。实施例9重组人可溶性胂瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干制剂制备方法,9页包括1)制备过程称取0.866gNa2HP04、0.538gNaH2P04,加入适量的水融解；加入2.93gNaCl，^f吏其完全溶解；加入40g甘露醇和10g蔗糖，磁力搅拌器搅拌至完全溶解；加入5grhTRAIL，使其完全溶解；然后用量筒定容至1L;测定pH值。2)过滤及分装用0.22um除菌过滤器过滤除菌后分装。3)冷冻干燥预冻制品温度达到-4(TC冻结2~3小时；一次升华干燥一次升华法，抽真空，维持温度至-3G。C，直至观察到制品干燥层和冻结层的交接面达到瓶底并消失，然后继续维持2小时；二次升华按照每两个小时升高5°C,最高温度为25。C;冻干结束关闭中隔阀60s,观察前箱辱力，如果没有明显的压力变化，2小时后即可结束冻干。否则，继续维持25。C，做二次升华。充氮气，加塞，轧盖，全检，包装，入库。由上述方法制得的rhTRAIL冻干制剂具有以下优点1)水份含量低，可以达到3%以下；2)外观为白色疏松体，不萎缩，表面光滑；3)生物学活性可以达到105U以上；4)稳定性好，25。C下6个月活性仍然维持1()SU，保护效果明显。权利要求1、重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂，其特征在于由下列成分组成磷酸盐、氯化钠、甘露醇、糖和水。2、根据权利要求1所述的重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂，其特征在于磷酸盐的终浓度为5mmol/L至100mmol/L，氯化钠的终浓度为20mmol/L至100mmol/L,甘露醇质量与溶液体积的比例为0.5%-6%，糖质量与溶液体积的比例为0.5%-3%,溶剂为水。3、根据权利要求1所述的重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂，其特征在于磷酸盐的终浓度为5mmol/L至20mmol/L,氯化钠的终浓度为20咖ol/L至50mmol/L,甘露醇质量与溶液体积的比例为3%-5%,糖质量与溶液体积的比例为0.5%-2%,溶剂为水。4、根据权利要求1-3中任一项所述的重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂，其特征在于所述糖为蔗糖。5、根据权利要求1-3中任一项所述的重组人可溶性胂瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂，其特征在于所述糖为海藻糖。6、重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂制备方法，包括以下步骤1)称取磷酸盐，加入适量的水溶解；2)加入氯化钠，使其完全溶解；3)加入糖和甘露醇，使其完全溶解，用水定容至一定体积。7、根据权利要求6所述的重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂制备方法，其特征在于所述磷酸盐为磷酸钠，其中磷酸根离子的总浓度为5tmnol/L至100,ol/L，氯化钠的终浓度为20mmol/L至100隱ol/L,甘露醇质量与溶液体积的比例为0.5%-6%,糖质量与溶液体积的比例为0.5%-3%。8、根据权利要求7所述的重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂制备方法，其特征在于所述磷酸根离子的总浓度为5mmol/L至20mmol/L，氯化钠的终浓度为20mmol/L至50mmol/L,甘露醇质量与溶液体积的比例为3-5%,糖质量与溶液体积的比例为0.5-2%。9、根据权利要求6-8中任一项所述的重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂制备方法，其特征在于所述糖为蔗糖。10、根据权利要求6-8中任一项所述的重组人可溶性肺瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂制备方法，其特征在于所述糖为海藻全文摘要本发明涉及生物制品的冷冻干燥领域，尤其涉及一种重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂及其制备方法，重组人可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体冻干保护剂由下列成分组成磷酸盐、氯化钠、甘露醇、糖和水。由此冻干保护剂制得的rhTRAIL冻干制剂具有水份含量低，可以达到3％以下；外观为白色疏松体，不萎缩，表面光滑；生物学活性可以达到10<sup>5</sup>U以上；稳定性好，25℃下6个月活性仍然维持10<sup>5</sup>U，保护效果明显的优点。文档编号A61K9/19GK101306195SQ20081006628公开日2008年11月19日申请日期2008年4月2日优先权日2008年4月2日发明者于玉根,李继东,蒙国基,陈红霞申请人:深圳新鹏生物工程有限公司