专利名称：一种表达REV env的重组MDV毒株的构建和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种表达REV env的重组MDV毒株的构建和应用，属于兽用生物制品分子生物学领域。
背景技术：
肿瘤是种鸡和商品蛋鸡的常发病，虽然其发病率和死亡率不高，但造成的经济损失很大，主要原因是致肿瘤病毒对鸡体所引起的免疫抑制，并进而导致对各种疫苗免疫应答的下降。近几年来，在我国鸡群中肿瘤病的发生率又有抬头的趋势。鸡群中可引起肿瘤的病毒有三种，即马立克氏病病毒(Marek’ s disease virus，MDV)、鸡白血病病毒(Avian leucosis virus, ALV)和禽网状内皮增生病病毒 (Reticuloendotheliosis viruses, REV)。长期以来，在鸡群中只要一出现肿瘤，就怀疑甚至断言是马立克氏病，而忽视了其它二种病毒的致病性。ALV的A、B、C、D亚型可在蛋用鸡中诱发肿瘤，而ALV的J亚群则主要在肉用型种鸡中诱发肿瘤。REV则在蛋用型和肉用型鸡中均可诱发肿瘤。根据临床病理变化和流行病学特点，虽然可以区别一些典型的马立克氏病或白血病，但近几年来鸡群中实际发生的肿瘤的表现在逐渐变化，已很难仅仅根据病变来鉴别诊断究竟哪一种病毒引发的肿瘤。特别是，在同一鸡群中及同一病鸡中，二种不同病毒共感染的现象非常普遍，这更给鉴别诊断带来了难度。禽网状内皮增生病病毒(REV)，这是另一种反转录病毒，可自然感染多种鸟类，在自然界分布广泛。REV可能通过鸡胚发生垂直感染，垂直感染或早期感染的雏鸡，最易发生矮小综合症和免抑制综合症，同时也会诱发肿瘤。很难根据临床病变与MDV或ALV肿瘤相区另O。目前，我国鸡群中REV感染相当普遍，毫无疑问，有一定比例的肿瘤与REV感染有关。近二、三年中，即使在一些已用MDV CV1988/Rispens株液氮苗(本发明又简称 CV1988疫苗)免疫的鸡群，仍有肿瘤发病率抬头的趋势。由于人们仍把它归罪于MDV，因此许多人都推测，是否出现了特超强毒型的流行株。但迄今为止，国内外尚未能实验证明这一点。然而，从这类鸡场的肿瘤病鸡，通过病毒分离，已发现有相当比例病鸡存在着MDV和REV 的共感染。此外，在用REV和MDV 二种病毒同时作人工感染试验中，也确实能诱发不同细胞类型的肿瘤结节。由于REV感染在我国鸡群上已相当普遍，有分析认为，REV的共感染是造成CV1988 疫苗免疫鸡群中肿瘤发病率升高的重要原因。由于在一些鸡的REV感染造成免疫抑制，也引起了由CV1988疫苗诱发的保护性免疫下降，因而造成免疫鸡群仍有肿瘤发生。本实验室追踪近5年广州地区养殖鸡群中REV的感染情况，结果表明，REV在我省鸡群中的感染率从O到100%，平均约为20%。人工感染实验表明，REV对雏鸡有很强的免疫抑制作用，它既显著抑制中枢性免疫器官胸腺和法氏囊的发育，也显著抑制感染鸡对NDV 和AIV疫苗免疫后的抗体反应，其中，对禽流感(Avian influenza virus,AIV)疫苗免疫的抑制作用更为显著(孙淑红，崔治中等，中国病毒学(英文版)，2006;李延鹏，崔治中等，中国兽医学报，2008)。已有的比较实验表明，相对于其它免疫抑制性病毒，如MDV，CAV, ARV,ALV等，REV对鸡表现出的免疫抑制作用最强(柳凤祥，崔治中等，中国农业科学，2009)。REV 单独感染时可以表现出很强的免疫抑制作用，在与其它病毒共感染时，这种免疫抑制作用还会进一步加强，表现出的免疫抑制更为严重。以对AIV-H5疫苗的免疫反应为例，两种病毒的共感染均显著地抑制对疫苗的免疫反应。已有的研究结果对REV疫苗提出了迫切的要求，然而到目前为止，竟未出现一种 REV疫苗产品问世！由于REV是反转录病毒，使用活疫苗存在转染进宿主细胞基因组的潜在风险；而REV的增殖速度又决定了目前无法通过大量培养REV以满足灭活疫苗的生产需要。因此通过基因工程手段表达REV的免疫保护性基因，制造重组基因工程疫苗是解决这一问题的良好方法。从鸡群中MDV的流行来看，已从以弱病毒株(mMDV)为主，到以强病毒株(vMDV) 为主，以至近20年来超强病毒(vvMDV)株越来越普遍，10年前还出现了特超强病毒株(vv+MDV) (Witter RL. Increased virulenced of Marek' s Disease Viurs field isolates. Avian Pathology, 1997)。科学家利用各种方法构建了各种MDV候选毒株试图改进疫苗的效果，但都不成功。例如，Witter和Kreager等比较了 10株新的疫苗候选株的保护性免疫效果，但结果都不比CVI988/Rispens株好(Witter，R. L. and K. S. Kreager. Serotype lviruses modified by backpassage or insertional mutagenesis approaching the threshold of vaccine efficacy in Marek' s disease. Avian Dis, 2004，48 (4) 768-782.)。看来，面对MDV野毒株致病性增强的趋势，用常规方法改进疫苗似乎已走到了尽头。但是，根据过去40多年中MDV演变规律，其毒力很有可能会在今后几年变得更强。近年来，在我国，即使在一些已用CV1988疫苗免疫的鸡群，仍有肿瘤发生率上升的趋势，虽然国内还没有相关分离到特超强毒株的报道，但MDV的变异却一直在进行着。利用基因工程手段(插入、突变或缺失)失活强毒的致病性基因使病毒致弱是构建MDV疫苗的一个重要策略。美国禽病肿瘤实验室利用粘粒系统分别敲除了超强毒株rMD5 的 pp38、 vIL18 禾口 Meq 基因(Reddy, S. M. ，B. Lupiani, I. M. Gimeno, R. F. Silva, L. F. Lee and R. L. Witter. Rescue of a pathogenic Marek' s disease virus with overlapping cosmid DNAs :use of a pp38 mutant to validate the technology for the study of gene function. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002,99 (10) 7054 ~ 7059. ；Cui， X.， L F. Lee, H. D. Hunt，W. M. Reed, B. Lupiani and S. M. Reddy. A Marek' s disease virus vIL-8 deletion mutant has attenuated virulence and confers protection against challenge with a very virulent plus strain. Avian Dis，2005，49 (2) :199 206.； Cui,X. ,L. F. Lee,W. M. Reed,H. J. Kung and S. M. Reddy. Marekr s disease virus-encoded vIL一Sgeneis involved in early cytolytic infection but dispensable for es tablishment of latency. J Virol, 2004, 78 (9) :4753 4760. ；Lupiani, B.，LF.Lee， X. Cui，I. Gimeno, A. Anderson，R. W. Morgan，R. F. Silva，R. L. Witter, H. J. Kung and S. M. Reddy. Marekr s disease virus-encoded Meq gene is involved in transformation of lymphocytes but is dispensable for replication. Proc Natl Acad Sci USA， 2004,101(32) :11815 11820.；)，结果显示上述基因的敲除均能使MDV的毒力减弱或消失，利用上述基因缺失株作为候选疫苗来免疫鸡，均能对鸡提供一定程度的保护。其中，缺失Meq基因的毒株是最有前景的。最新的研究表明在用超强毒和特超强毒攻击后，Meq基因缺失毒株能够提供比CVI988更好的保护，这也是目前报道的保护效果最好MDV候选疫苗株(Lee, L. F. , B. Lupiani, R. F. Silva, H. -J. Kung and S. Μ. Reddy. Recombinant Marek' s disease virus (MDV) lacking the Meq oncogene confers protection against challenge with a very virulent plus strain of MDV. Vaccine,2008,26(15) :1887 1892. ；Lee, L. F. , K. S. Kreager, J. Arango, A. Paraguassu, B. Beckman, H. Zhang, A. Fadly, B. Lupiani and S.M.Reddy. Comparative evaluation of vaccine efficacy of recombinant Marek' s disease virus vaccine lacking Meq oncogene in commercial chickens. Vaccine,2010,28(5) :1294 1299)。本发明以本发明人2007年从广东某种鸡场分离到的MDV强毒株作为载体，将其基因组构建到细菌人工染色体(BAC)上，利用recE/T介导的同源重组技术，首先缺失其中 1个Meq基因，然后用REV env表达盒替换另一个Meq基因，从而构建成2个Meq基因缺失的，能表达REV env基因的MDV弱毒疫苗株。该重组毒株将同时满足保护MDV和REV的双重需要，而MDV疫苗早期免疫的特性又符合免疫抑制性病毒需要早期进行免疫的要求。重组MDV-REV疫苗的成功研制将为控制MDV、REV以及MDV-REV共感染对家禽养殖业所造成的灾难带来有力的武器。
发明内容
本发明在构建MDV⑶07细菌人工染色体(BAC)的基础上，采用recE/T高效重组技术，通过两次重组，最终缺失了 MDV⑶07基因组中的两个与MDV致肿瘤相关的Meq基因， 并在其中一个Meq的位置插入了禽网状内皮增生症病毒(REV)囊膜蛋白env基因表达框， 使最终获得的重组病毒既失去了 MDV原有的致瘤能力，又保留了良好的免疫原性，同时还对禽网状内皮增生症具有一定的免疫保护效果。是通过利用recE/T介导的突变技术敲除MDV⑶07株病毒中的1个Meq基因，并再次通过Red/ET介导技术，用REV env表达盒替代另一个Meq基因。
具体实施例方式一、马立克氏病疫苗病毒⑶07-env株的的构建1. REV env表达框的构建。(1)通过引物扩增REV env的完整阅读框(ORF)，并将PCR产物用HindIII酶和 XbaI酶消化后克隆进pBudCE4. 1载体质粒中，获得重组质粒pBud-env。F(envl) :5，-CGCCAAGCTTGACAACCAAGAAGAATG-3，(序列 1，含 HindIII 位点)R(envl) :5，-CGTATCTAGACCTAGGGTATCCATCTC-3，(序列 2，含 XbaI 位点)(2) PCR扩增env基因表达框。以pBud-env为模板，设计如下引物进行PCR F (env2)5，-atggccatgtggtctctacggcgcaaatctagcaggagtgtgcaactccgGCGCGCGTT GACATTGATTA-3，(序列3大写字母表示的碱基序列对应于env基因表达框l#_20#bp的位置)。R(env2)5， -ttataagtaggattccccgtctcctgttggcgattcccgaagatttgtcaCCCCAACTT GTTTATTGCAG-3，(序列4大写字母表示的碱基序列对应于env基因表达框2673#_2692#bp 的位置)。
本对引物所扩增出的PCR产物既包含了用于同源重组的马立克病毒基因组Meq 上、下游各50bp的同源臂(小写字母表示)，又包含了 P(。mv)启动子的全部序列，同时也包含了 SV40的早期的mRNApolyA结构。
2. Meq基因的敲除参照已发表的研究(李延鹏马立克氏病病毒meq基因缺失株生物学特性及其免疫效果研究，博士学位论文，2010，中国农业科学院畜牧兽医研究所)，利用卡那霉素抗性基因 (Kanr)取代一个meq基因后，挑取菌落接种于LB液体培养基中摇振培养，待其OD值达到 0. 5时，加10%的阿拉伯糖诱导lh，使宿主菌内的质粒flp重组酶被激活，从而去除Karf基因。诱导后将菌分别涂布于含有30 μ g/mL氯霉素或50 μ g/mL卡那霉素的LB琼脂平板上 32°C过夜培养，筛选只在含有30 μ g/mL氯霉素的LB琼脂平板上生长，但不能在含50 μ g/mL 卡那霉素的LB琼脂平板上生长的菌，即为重组菌。该重组质粒中在被去掉的第一个Meq基因所在的位置仍保留一个flp重组酶识别的位点(flp recognition target，FRT)。3. REV env表达框替代另一个Meq基因(1)利用Red/ET同源重组将选择标记基因rpsL-neo表达盒替换另一个Meq基因。敲除一个Meq基因并经验证后，参照本实验室前期的研发方法(陈瑞爱.基于BAC 平台表达REV env基因的重组rCVI988-erw的构建及其免疫效果评价.博士学位论文， 2010，中国农业大学)，利用GeneBridge公司试剂盒(Red/ET重组系统Counter-Selection BAC Modification Kit)中的rpsL-neo质粒为PCR模板，扩增两侧带有MDV基因组Meq基因上、下游各50bp大小同源臂的选择标记基因rpsL-neo表达盒。引物设计如下 F(rpsL-neo)5，-atggccatgtggtctctacggcgcaaatctagcaggagtgtgcaactccgGGCCT GGTGATGATGGCGGG-3'(序列 5)。R(rpsL-neo)5， -ttataagtaggattccccgtctcctgttggcgattcccgaagatttgtcaTCAGA AGAACTCGTCAAGAA-3，(序列 6)。引物中的大写字母是用来扩增rpsL-neo的序列，小写字母为MDVMeq基因50bp的
同源重组臂。取回收纯化后的rpsL-neo基因表达盒PCR产物1 2 μ L(约0. 1 0. 2 μ g)加入到30 μ L预先制备好的既包含了 PRedET质粒又包含MDV⑶07 (in BAC)的DH10B感受态细胞中，进行电转化(2000ν，100Ω，25μΡ)。电击完成后，立即加入ImL事先预热至37°C 的LB培养液中混勻，吸入到1. 5mL灭菌的EP管中，37 °C，220r/min,振荡活化70min (此时，在Red α /Red β蛋白的介导下发生同源重组)，取100 μ L细胞悬液涂布于含有氯霉素 (Cmr, 30 μ g/mL)、四环素(Tet，3 μ g/mL)和卡那霉素(Kan，15 μ g/mL)的三种抗生素的固体琼脂平板上，在30°C恒温生化培养箱中培养24h，挑选具有这三种抗性的阳性菌落，接种到同样加入三种抗生素的5mL LB培养液中，30°C，220r/min，避光振荡培养16h左右，取少量菌液划线接种于含有氯霉素(Cmr，30 μ g/mL)、卡那霉素(Kan，15 μ g/mL)和链霉素(Str， 50 μ g/mL)三种抗生素的平板上，37°C恒温生化培养箱中培养24h左右，用以验证选择标记基因rpsL-neo表达盒的表达功能是否能够正常得发挥；同时取0. 5mL菌液按1 %的比例接种到IOOmL同时含有氯霉素(Cmr，30 μ g/mL)、卡那霉素(Kan，15 μ g/mL)和四环素(Tet， 3 μ g/mL)三种抗生素的LB培养液中，37°C，220r/min，避光振荡培养16h左右中量提取并纯化重组质粒，经过凝胶电泳初步观察为大分子DNA的克隆然后进一步做PCR鉴定；鉴定结果表明具有氯霉素、四环素和卡那霉素抗性而不具有链霉素抗性，而且能特异性的扩增到 rpsL-neo基因的细菌克隆即为重组克隆。 (2)利用Red/ET同源重组将env基因表达盒替换掉rpsL-neo表达盒。将鉴定正确的包含rpsL-neo基因的重组阳性克隆划线接种到含有氯霉素(Cmr， SOyg/mL)、四环素(Tetdyg/mL)和卡那霉素(Kan，15 μ g/mL)三种抗生素的LB固体琼脂平板上，30°C恒温培养箱中培养24h左右，挑取阳性单个菌落，将其制备成电转化感受态细胞。取1 2yL env基因表达盒PCR回收产物加入到50 μ L上述新鲜制备的电转化感受态细胞中，混合均勻后，置于冰浴上预冷3 5min，然后转入到冰浴预冷的0. 2cm电转杯中，电转参数设置为200(^，100 0，25 4 1mm。电击完成后立即加入ImL事先预热至37°C 不含抗生素的LB培养液，混勻后立即转入到新的1. 5mL灭菌的EP管中，37°C，220r/min振荡培养70min左右，10000r/min,离心2min，弃去上清，用100 μ L不含抗生素的LB培养液重新悬浮菌体，涂布于含有氯霉素(Cmr，30yg/mL)和链霉素(Str，50 μ g/mL)两种抗生素的固体琼脂平板上，37°C恒温生化培养箱中培养24h左右，待单个菌落长到合适大小时，同一单菌落用两只细小的枪头各挑取一定量菌体，分别接种到含有氯霉素(Cmr，30y μ g/mL) 与链霉素(Str，50 μ g/mL)的两种抗生素的LB培养液和含有氯霉素Cmr，30 μ g/mL)与卡那霉素(Kan，15yg/mL)两种抗生素的LB培养液中，验证选择标记基因rpsL-neo是否被替换掉，具有氯霉素与链霉素两种抗性，但不具备卡那霉素抗性的细菌单克隆为所需克隆，该克隆被命名为⑶07-env。4.重组病毒的拯救根据QIAGEN plasmid Maxi kit试剂盒(QIAGEN公司)的操作说明书，进行重组质粒⑶07-env的大量提取。按照转染试剂LipfectamineTM2000 (Invitrogen公司)的说明书，取QIAGEN plasmid Maxi kit试剂盒提取的经鉴定正确的重组质粒⑶07_env DNA Iyg 于 100μ LDMEM(Gibco 公司)中，取 IOyL Iipfectamine 于 100 μ L DMDM 中，将两者混勻，室温放置20min后，将混合物用DMDM补充至lmL，加入到细胞平铺至90 %的6孔板中，37°C， 5% CO2培养箱中培养6h后，将6孔板中的液体换为含5%犊牛血清的DMEM培养基，继续培养几天，待病毒蚀斑形成后，将细胞消化，传至已长成单层的原代CEF，如此连续传3 4代以扩大病毒量，待扩增到一定量时，用0. 25%胰酶(含0.01%的EDTA)将细胞消化，离心收集细胞，用冻存液(DMS0 小牛血清DMEM为1:3:6)重悬细胞后将其冻存于液氮中保存。该命名为 Marek’ s disease virus GD07/Δ 2Meq_env,简称 Marek’ s disease virus ⑶07-env，或MDV⑶07_env)。该病毒株已于2011年08月29日保藏在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 5169。二、马立克氏病病毒⑶07-env株的鉴别特性该病毒基因组上带有三个位于特定位点的特定序列可作为本病毒的鉴别性标志(1)在Meq基因缺失的位点留下一个34bp的FRT序列(5 ‘ -GAAGTACCTATTCTTTCTAGAGAATAGGAACTTC-3 ‘)(序列 7)；(2)在Meq基因被REV-env替代的位点，有env基因表达框，可用如下引物鉴定
F(env) 5' -GCGCGCGTTGACATTGATTA-3‘(序列 8)R(env) 5' -CCCCAACTTGTTTATTGCAG-3‘(序列 9)。本对引物所扩增出的PCR产物包含了 P(。mv)启动子，env 0RF,以及polyA结构。PCR 产物序列大小为2692bp。三.MDV⑶07-env株病毒对鸡的致病性和保护性免疫作用为了研究重组MDV⑶07-env在实验室条件下对马立克氏病病毒强毒京-1和网状内皮组织增殖症病毒的的免疫保护效果，将1日龄SPF鸡210只随机分为7组，每组30只， 分别饲养于7个带有正压过滤空气的SPF动物饲养隔离罩内。1日龄时第1组鸡以2000PFU/ 只的剂量腹腔接种⑶07-env，第2组鸡以2000PFU/只的剂量腹腔接种CVI988/Rispens疫苗株，第3组为马立克病毒强毒京-1攻毒对照组，第4组鸡以2000PFU/只的剂量腹腔接种 ⑶07-env，第5组为网状内皮组织增殖症病毒攻毒对照组，第6组以2000PFU/只的剂量腹腔接种⑶07-env用来检测REV抗体。第7组为空白对照组。免疫接种7天后，第1、2、3组分别以500PFU/只的剂量攻击MDV京-1株。免疫接种30天后，第4、5组用REV病毒SNV 株(山东农业大学崔治中教授馈赠)以105TCID50/只的剂量进行攻毒，以后每隔IOd无菌采血，以鸡胚成纤维细胞进行血液病毒分离试验并采用间接免疫荧光试验进行检测，用来确定血液中REV病毒是否存在。通过ELISA标准试剂盒(IDEXX公司)检测血清中抗REV 抗体的变化。攻毒后每周观察鸡的生长态势。整个实验期间，⑶07-env免疫组、CVI988/Rispens免疫组以及京_1攻毒对照组鸡只死亡后都进行解剖、观察病变，记录死亡率以及由MD引起的病变情况。MD病变百分数由病变鸡除以存活鸡与死亡鸡的总和乘以100得来。疫苗免疫效力由保护指数(PI)来确定，PI计算方法为攻毒对照组产生MD病变百分数减去免疫组鸡产生MD病变百分数再除以攻毒对照组鸡产生MD病变百分数乘以100，为了增加结果的客观性，实验重复一次。与空白对照组相比，攻毒对照组感染京-1后鸡群个体小且大小不均，生长发育状况差，羽毛粗乱、无光泽，共济失调，一肢或双肢的不对称性、进行性不全麻痹。⑶07-env与 CVI988/Rispens免疫组鸡感染京_1后大小均一，长势正常，其中⑶07_env组有6鸡只死亡，CVI988/Rispens组有7只鸡死亡。⑶07_env组鸡群个体大小均勻，长势正常。在攻毒后90天把所有存活鸡处死并剖检，进行肉眼观察。与空白对照组相比，攻毒对照组肝脏、脾脏、心脏肿瘤明显，CVI988/Rispens免疫鸡有极个别表现轻微的MDV症状外(无肉眼可见明显病变)，其余鸡均正常，而MDV⑶07-env免疫后感染京-1组有3只鸡表现轻微的MDV 症状外(无肉眼可见明显病变)，其余鸡均正常。与空白对照组相比，REV攻毒对照组羽毛发育异常，体重明显偏低，个体矮小，剖检发现，胸腺和法氏囊严重萎缩，外周神经肿大，腺胃出现慢性溃疡性炎症。⑶07-env免疫组鸡群个体大小均勻，长势正常。剖检并没有发现脏器的病变。通过观察在SPF鸡群中攻强毒京-1后产生的保护效果，比较了 MDV⑶07-env和 MDVCVI988/Rispens疫苗(简称CVI988)的保护率。未免疫SPF鸡群表现出97%的马立克氏病的特有的死亡和损伤现象(表1)，MDV⑶07-env免疫感染京-1组的全部鸡和CVI988/ Rispens免疫后感染京-1的SPF鸡群与空白对照组相比，大小均一，长势正常。与CVI988/ Rispens免疫组表现出11%的MD轻微症状相比，MDV⑶07_env免疫组表现出8. 5%的MD 轻微症状。因此，⑶07-env和CVI988/Rispens对强毒京_1的保护指数分别为91. 5%和89%。表IMDV GD07-env与MDV CVI988疫苗对SPF鸡的免疫保护比较
权利要求
1.一种表达REV env的重组MDV毒株，其特征在于(1)该重组病毒既失去了MDV原有的致瘤能力，保留了良好的免疫原性，同时能表达禽网状内皮增生症病毒Reticuloendotheliosis virus囊膜蛋白env基因，对禽网状内皮增生症具有一定的免疫保护效果；(2)该重组病毒MDV⑶07-env株已于2011年8月29日保藏在北京市朝阳区北辰西路 1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为 CGMCC No. 5169 ；(3)该病毒基因组上带有二个位于特定位点的特定序列可作为本病毒的鉴别性标志1)在原有的二个Meq基因位点，在敲除Meq基因后，在其中一个Meq基因的位置上留下一个 34bp 的序列 FRT 该序列为5，-GAAGTACCTATTCTTTCTAGAGAATAGGAACTTC-3，；2)在另一个Meq基因的位置上，含有REVenv基因表达框。
2.如权利要求1所述的一种表达REVenv的重组MDV毒株，其特征在于该重组病毒的构建是通过利用recE/T介导的突变技术敲除MDV⑶07株病毒中的1个Meq基因，并再次通过Red/ET介导技术，用REV env表达盒替代另一个Meq基因。
3.一种根据权利要求1所述的一种表达REV env的重组MDV毒株在制备用于预防鸡马立克氏病或/和鸡网状内皮增生症的鸡马立克氏病-网状内皮增生症活疫苗中的用途。
4.一种预防鸡马立克氏病或/和鸡网状内皮增生症的方法，其中向鸡给予预防有效剂量的鸡马立克氏病_网状内皮增生症活疫苗，所述的疫苗包含权利要求1所述的表达REV env 的重组 MDV GD07_env 株。
全文摘要
本发明涉及一种表达REV env的重组MDV毒株的构建和应用。本发明所涉及毒株一株以鸡马立克氏病疫苗病毒(MDV)广东分离株(GD07)为载体，重组进禽网状内皮增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus，REV)囊膜蛋白基因env的构建和应用。本发明所获得的重组病毒MDV GD07-env株用作生产毒株所制备的疫苗，免疫1日龄雏鸡，能够预防超强毒株MDV诱发的鸡马立克氏病，其保护性免疫效果优越于目前国内外市场上应用最广泛的MDVCVI988/Rispens株疫苗；该重组病毒同时还能对REV病毒具有良好的免疫保护作用。
文档编号A61P31/14GK102344914SQ20111026302
公开日2012年2月8日 申请日期2011年9月7日 优先权日2011年9月7日
发明者陈瑞爱 申请人:广东大华农动物保健品股份有限公司, 肇庆大华农生物药品有限公司