一种基于蛋白表面筛选的酶定向固定化方法
【专利摘要】本发明提供一种全新的酶定向固定化方法，所述方法包括步骤：(1)进行酶表面分析，选取酶上远离催化中心位置的凹陷作为固定腔；(2)筛选对接分子，选取与所述固定腔结合强且与所述催化中心结合弱的小分子；以及(3)定向固定化酶的制备，通过将所述小分子连接载体表面并与酶分子孵育，得到复合定向固定化的酶。本发明的方法所得到的固定化酶催化效能高、稳定性好、优于传统的固定化酶。
【专利说明】一种基于蛋白表面筛选的酶定向固定化方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，特别是酶固定化领域。
【背景技术】
[0002] 酶是一种以蛋白为结构基础的（极少量未RNA、DNA为基础的）生物催化剂。在酶 分子中存在能够直接与底物分子结合，并催化底物化学反应的部位，这一部位就成为酶的 催化中心。酶与化学催化剂相比，它具有反应条件温和、催化效率高、专一性强、污染低等优 点，在工业、农业、医药和食品等各个领域应用广泛。
[0003] 酶的固定化技术（Enzyme immobilization)是指将酶束缚或限制于一定区域内， 但仍保留其催化特性并可回收和重复使用的一类技术。固定化酶与游离酶相比，主要有下 列优点：（1)产物不易被酶污染，简化后续的分离提纯工艺；(2)在大多数情况下，酶在固定 化后稳定性会得到提高并可重复使用，从而便于连续化生产，降低生产成本；(3)固定化酶 具有一定的机械强度，可以采用搅拌或装柱的方式使用，便于生产过程实现管道化、连续化 和自动化。由于这些特性，固定化酶在工业、农业、医药和食品等各个领域被广泛应用。
[0004] 酶定向固定化技术（Enzyme oriented Immobilization)是相对于传统的随机固定 化（Random immobilization)提出的。通常，固定化酶的酶活力要比游离酶的活力低，其主 要原因是固定化过程中产生了对酶蛋白的化学损伤以及酶分子不适宜的空间取向。传统的 酶固定化方法大多数仅停留于酶蛋白随机取向的吸附与固定，往往导致酶在载体上千变万 化的取向，其中那些不佳的空间取向使酶与底物之间的邻近定向效应受阻，造成酶的剩余 活力低下，制作的酶试纸、酶生物传感器灵敏度低，制成的生物膜活性不均一、互换性差。这 些问题依靠现有固定化酶技术不能得到有效的解决，成为目前的技术瓶颈。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有固定化技术存在的缺点和不足，突破性地基于酶蛋白 分子结构的信息，通过分子层面上的设计，采用定向固定化技术，将酶按照同一取向固定在 载体上，使酶的构象达到最适宜，最大限度的保留酶的活性。本发明的固定化酶技术可有效 地提高固定化酶的活性、稳定性和固定效能。
[0006] 因此，在第一方面，本发明提供了一种全新的基于分子对接技术的复合型定向固 定化酶的制备方法，所述方法包括如下步骤：
[0007] (1)进行酶表面分析，选取酶上远离催化中心位置的凹陷作为固定腔；
[0008] (2)筛选对接分子，选取与所述固定腔结合强且与所述催化中心结合弱的小分子； 以及
[0009] (3)定向固定化酶的制备，通过将所述小分子连接载体表面并与酶分子孵育，得到 复合定向固定化的酶。
[0010] 作为示例，本发明的方法的各个步骤可以通过以下方式实现：
[0011] 1、进行酶表面分析，选取酶上远离催化中心位置的凹陷作为固定腔。例如，用分子 模拟软件分析酶蛋白表面结构，在远离其催化中心位置选取固定腔，步骤包括：
[0012] (1)使用分子模拟软件，对已有或构建的酶的三维结构表面和催化中心进行分析， 分析项目包括：疏水性、带电性、氢键供体/受体、酶蛋白表面主要凹陷结构位置和特点、氨 基酸残基种类数量等；
[0013] (2)将以上信息综合分析，选定固定腔；所述固定腔具有以下一项或多项特点：
[0014] a)与催化中心的疏水性、带电性、氢键供体/受体、氨基酸残基种类数量等特点有 显著性差异；
[0015] c)大小介于分子量100-10000Da的分子体积。
[0016] 2、筛选对接分子，选取与所述固定腔结合强且与所述催化中心结合弱的小分子。 例如，使用分子对接软件将小分子与催化中心和固定腔进行分子对接，将与所述固定腔结 合强且与所述催化中心结合弱的小分子，步骤包括：
[0017] (1)使用分子对接软件，将小分子分别与所述催化中心和所述固定腔进行分子对 接，在分子对接过程中获得对接总能量和对接打分；
[0018] (2)选取定向固定化酶的目标小分子，目标小分子作为具有以下特征：
[0019] a)相对于与酶催化中心分子对接，与固定腔分子对接的总能量低，对接打分高；
[0020] b)在常规状态下，不与酶的固定腔外的其他部分发生自发性化学反应。
[0021] 优选地，在不与酶的固定腔外的其他部分发生自发性化学反应的情况下，相对于 与酶催化中心分子对接，目标小分子与固定腔分子对接的总能量一般越低越好，对接打分 越高越好。
[0022] 本发明中，所述常规状态是指在酶在的环境是常规的比如适宜的pH、缓冲液、温 度、等。可改为在正常工作状态，或者在适宜的理化环境中。
[0023] 3、定向固定化酶的制备，通过将所述小分子连接载体表面并与酶分子孵育，得到 复合定向固定化的酶。例如，将所述小分子通过化学方法连接到载体表面，并加入游离酶， 通过小分子与酶的分子间相互作用形成复合定向固定化的酶。
[0024] 在一个具体的实施方案中，所述酶以蛋白质为结构基础；
[0025] 在一个具体的实施方案中，所述小分子的分子量为50_50000Da。
[0026] 在一个具体的实施方案中，所述载体包括一切可固载酶的介质，包括但不限于：聚 合物、电极、介孔材料、纳米材料、无机材料、复合材料等。
[0027] 在一个具体的实施方案中，筛选所得的目标小分子与载体表面连接方式选自直接 的、间接的和复合型的化学连接和物理连接。
[0028] 在一个具体的实施方案中，所述分子模拟软件选自但不限于：Sybyl、Surflex、 AutoDock、D0CK、3D_D0CK、Openeye、FRED、Molecular Operating Environment、HEX、FlexX、 Maestro、Glide、GOLD、ICM、ESCHER、MONTY、HADDOCK、Z-D0CK、FTD0CK、Molegro Virtual Docker、DiscoveryStudio、Amber 和 GaussianAffinity。
[0029] 在一个具体的实施方案中，所述分子对接软件选自但不限于：Dock、3D-D0CK、 AutoDock、Surflex、Glide、Gold、FlexX、Z-D0CK、FTD0CK、Molegro Virtual Docker 和 Affinity。
[0030] 本发明的方法具有下列优点和积极效果：
[0031] 1、可定向控制固定化酶在载体表面的方向；
[0032] 2、固定化酶能保留游离酶很高的活性和专一性；（例如，在实施例中表明，本发明 的方法得到的固定化酶活回收率>60% )
[0033] 3、固定化酶稳定性极大的提高，使用范围更广泛；（例如，在实施例中表明，保存 10天后，本发明的方法得到的固定化酶活可保持90%以上）
[0034] 4、固定化酶可重复使用多次，酶活保持良好；（例如，在实施例中表明，可重复使 用10次以上，本发明的方法得到的固定化酶活保持70%以上）
[0035] 5、酶固载量大，可广泛应用于工业生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0036] 图1是酶结构特征示意图；
[0037] 图2是基于分子对接技术的复合型定向固定酶的结构示意图；
[0038] 图中
[0039] 卜酶；2_目标小分子；3_载体
[0040] a_酶固定位点（固定腔）；b_酶催化中心。
【具体实施方式】
[0041] 本发明通过下述实施例进行详细说明，但本领域技术人员应了解，下述实施例不 是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改进和变化，都在本发明的保护 范围之内。
[0042] 在本发明中，酶的三维结构可以使用INSIGHTii、Modeller等软件进行构建。一些 数据库中公开了蛋白的三维结构的数据，本发明的酶三维结构不限于具体来源，可以从头 构建，也可以来自已有的数据库。
[0043] 在本发明中，催化中心是指酶分子中能够直接与底物分子结合，并催化底物化学 反应的部位。
[0044] 在本发明中，固定腔是指在酶蛋白表面用于连接酶蛋白与固定化载体的部位。在 一个实施方案中，固定腔的大小介于分子量l〇〇-l〇〇〇〇Da的小分子体积（小分子体积通常 是指分子体积小于30000A 3)。凹陷结构是指在酶蛋白表面的周围高中间低的局面盆装结 构。固定腔是蛋白表面一个特殊的具有多种性质的凹陷结构。
[0045] 在本发明中，固定腔远离酶催化中心是指，固定腔与催化中心相连，且不在催化底 物和产物进出催化中心的通道中，固定腔的朝向尽量与催化中心朝向相背，固定腔与催化 中心边缘最近距离大于i〇A。
[0046] 在本发明中，固定腔与催化中心的疏水性、带电性、氢键供体/受体、氨基酸残基 种类数量等特点中的一种或多种（最优选全部）有显著性差异。所述各项显著性差异的含 义如下：
[0047] 疏水性显著差异是指在两个位点中局部或平均亲脂势（Lipophilic Potential) 差值大于酶蛋白表面最大与最小亲脂势差值的30%，优选50%，最优选70% ;
[0048] 带电性显著差异是指在两个位点中局部或平均静电势（Electrostatic Potential)差值大于酶蛋白表面最大与最小静电势差值的30%，优选50%，最优选70% ; [0049] 氢键供体/受体显著差异是指在两个位点中，氢键供体与氢键受体的总数量相差 20%以上、或者氢键供体/氢键供体的数值相差0. 1以上（氢键供体和受体数量都不为Ο 时）、或一个位点中氢键供体或氢键供体为〇而另一个位点不为0。；
[0050] 氨基酸残基种类数量显著差异是指在两个位点中，数量最多的1-5种氨基酸残基 的类型（非极性、芳香性、极性不带电、带正电、带负电）不同，或者一个位点含有另一个位 点不含的某一种或几种氨基酸残基；
[0051] 在本发明中，小分子是指位于固定化载体末端、能与酶蛋白表面发生相互作用、用 于连接酶蛋白与固定化载体的分子或官能团，例如但不限于如下的种类：抗生素类、农药 类、兽药类等、人药类（具体可以是有机磷类、留体化合物、四环素类、酰胺类、低分子量聚 合物类）。
[0052] 在本发明中，小分子与酶的固定腔和催化中心结合的强弱可以通过对接的总能量 高低、并对对接进行打分来衡量。对接总能量和对接打分由分子对接软件直接给出，对接总 能量和对接打分与小分子与位点的结合常数（logKa)直接相关，对接总能量和对接打分所 可换算为对应的结合常数（logKa)。当l 〇gKa>0时，无相互作用；当0〈logKa〈3时，有较弱 相互作用；当l〇gKa>3时，有较强相互作用。
[0053] 实施例1--人红细胞过氧化氢酶
[0054] 选用人红细胞过氧化氢酶（HUMAN ERYTHROCYTE CATALASE)，使用蛋白质数据库 (Protein Data Bank，TOB)编号为1DGB的人红细胞过氧化氢酶分子三维晶体结构（三维晶 体结构来自 Protein Data Bank http://www. rcsb. org/pdb)，通过 Sybyl 软件对人红细胞 过氧化氢酶表面分析，获得其催化中心位于该酶中心，在以第147位天冬酰胺（Asnl47)和 第74位组氨酸（His74)中点为中心2〇 A范围内。在以第176位亮氨酸（Leul76)为中心 20 A范围内存在显著的人红细胞过氧化氢酶蛋白表面凹陷，此凹陷远离人红细胞过氧化 氢酶催化中心，体积适中，可容纳分子量为100-2000的分子，且凹陷内部较为疏水。由于以 第176位亮氨酸（Leul76)为中心20 A范围内的凹陷具有以上特点，故选定其为固定腔。
[0055] 使用Suf lex-Dock分子对接模块，进行固定腔的小分子筛选。备选小分子 来自常用有机小分子库（Zinc数据库中的Purchasable范围中的小分子化合物数 据库，http://zinc. docking, org/)，共12520个分子。分子对接结果显示，编号为 CB0380940(Cas60-09-3)的分子与人红细胞过氧化氢酶活性中心对接打分为-2. 13,与固 定腔对接打分为5. 26。将CB0380940分子作为目标分子。
[0056] 将10%戊二醛20ml乙醇溶液与2g氨基硅胶混合，30°C搅拌反应30min，沙芯漏斗 抽滤并用20ml乙醇洗涤3次。
[0057] 将上述硅胶加入30ml乙醇，滴加20ml5%的CB0380940乙醇溶液40°C，搅拌反应 60min。抽滤并用20ml乙醇溶液洗涤3次，20ml水洗涤3次，制得固定化载体。
[0058] 将lg固定化载体分散在30ml0. 1M Tris-HCl缓冲溶液（pH7. 4)中。加入2mllOU 的人红细胞过氧化氢酶的0. 1M Tris-HCl溶液。0°C搅拌反应10min，过滤并用0°C 20ml0. 1M Tris-HCl缓冲溶液（pH7. 4)洗涤3次，制备得到定向固定化人红细胞过氧化氢酶。
[0059] 人红细胞过氧化氢酶活性检测方法：a.试剂空白组、样品组、对照组均加入 0. 01mol/L(pH6. 8)H202磷酸缓冲液5mL ;b.分别在25°C水浴中恒温lmin ;c.空白组加入 0. 5mol/LH2S04溶液2mL，样品组加入酶液lmL或等量固定化酶，对照组加入酶液lmL或等量 固定化酶；d.分别在25°C水浴中准确保温3min (混匀）；e.空白组加入酶液lmL，样品组和 对照组分别加入0. 5mol/LH2S04溶液2mL ;f.各组均加入10% ΚΙ溶液0. 5mL ;g.各组均加 入1 % (NH4) 2M〇04溶液1滴；h.分别混匀后放置3min，用0. 005mol/LNa2S203溶液滴定， 达浅黄色时，加淀粉指标剂2?3滴，至蓝色消失。计算获得乙酰胆碱酯酶活性。
[0060] 采用该方法定向固定的人红细胞过氧化氢酶的酶活性回收率为65. 3%。重复10 次使用，酶活性较首次使用的固定化酶活性可以保持75.6%以上。4°C 0. lMTris-HCl溶液 存放10天，酶活性较第一天使用的固定化酶活性可以保持95. 8 %以上。
[0061] 实施例2--过氧化氢酶
[0062] 选用人红细胞过氧化氢酶（HUMAN ERYTHROCYTE CATALASE)，使用蛋白质数据库 (Protein Data Bank，TOB)编号为1DGB的人红细胞过氧化氢酶分子三维晶体结构（三维 晶体结构来自 Protein Data Bank http://www. rcsb. org/pdb)，通过 Sybyl 软件对人红细 胞过氧化氢酶表面分析，获得其催化中心位于该酶中心，在以第147位天冬酰胺（Asnl47) 和第74位组氨酸（His74)附近中点为中心20 A范围内。在以第176位亮氨酸（Leul76) 附近为中心20 A范围内附近存在显著的人红细胞过氧化氢酶蛋白表面凹陷，此凹陷远离 人红细胞过氧化氢酶催化中心，体积适中，可容纳分子量为100-2000的分子，且凹陷内部 较为疏水。由于以第176位亮氨酸（Leul76)为中心20 A:范围内附近的凹陷具有以上特 点，故选定其为固定腔。使用Suflex-Dock分子对接模块，进行固定腔的小分子筛选。备 选小分子来自常用有机小分子库（Zinc数据库中的Purchasable范围中的小分子化合 物数据库，http://zinc. docking, org/)，共12520个分子。分子对接结果显示，编号为 CB2768793 (Cas538-41-0)的分子与人红细胞过氧化氢酶活性中心对接打分为-3. 63,与固 定腔对接打分为5. 57。将CB2768793分子作为目标分子。
[0063] 将10%戊二醛20ml乙醇溶液与2g氨基硅胶混合，30°C搅拌反应30min，沙芯漏斗 抽滤并用20ml乙醇洗涤3次。
[0064] 将上述硅胶加入30ml乙醇，滴加20ml5%的CB2768793乙醇溶液40°C，搅拌反应 60min。抽滤并用20ml乙醇溶液洗涤3次，20ml水洗涤3次，制得固定化载体。
[0065] 将lg固定化载体分散在30ml0. lMTris-HCl缓冲溶液（pH= 7. 4)中。加入2mllOU 的人红细胞过氧化氢酶的0. 1M Tris-HCl溶液。0°C搅拌反应10min，过滤并用0°C 20ml0. 1M Tris-HCl缓冲溶液（pH = 7. 4)洗涤3次，制备得到定向固定化人红细胞过氧化氢酶。
[0066] 人红细胞过氧化氢酶活性检测方法：a.试剂空白组、样品组、对照组均加入 0. 01mol/L(pH6. 8)H202磷酸缓冲液5mL ;b.分别在25°C水浴中恒温lmin ;c.空白组加入 0. 5mol/LH2S04溶液2mL，样品组加入酶液lmL或等量固定化酶，对照组加入酶液lmL或等量 固定化酶；d.分别在25°C水浴中准确保温3min (混匀）；e.空白组加入酶液lmL，样品组和 对照组分别加入〇. 5mol/LH2S04溶液2mL ;f.各组均加入10% KI溶液0. 5mL ;g.各组均加 入1 % (NH4) 2M〇04溶液1滴；h.分别混匀后放置3min，用0. 005mol/LNa2S203溶液滴定，达浅 黄色时，加淀粉指标剂2?3滴，至蓝色消失。计算获得乙酰胆碱酯酶活性。
[0067] 采用该方法定向固定的人红细胞过氧化氢酶的酶活性回收率为72. 9%。重复10 次使用，酶活性较首次使用的固定化酶活性可以保持73. 2%以上。4°C 0. lMTris-HCl溶液 存放10天，酶活性较第一天使用的固定化酶活性可以保持97. 3 %以上。
[0068] 实施例3--乙酰胆碱酯酶
[0069] 选用乙醜胆喊酯酶（Acetylcholine Esterase，AChE)，使用PDB编号为1F8U的人 体乙酰胆碱酯酶分子三维晶体结构（三维晶体结构来自Protein Data Bank http://www. rcsb. org/pdb)，通过Sybyl软件对乙酰胆碱酯酶表面分析，获得其催化中心位于该酶中 心，以第203位丝氨酸（Ser203)为中心20 A:范围内。在以第400位天冬氨酸（Asp400)为 中心20 A范围内存在显著的乙酰胆碱酯酶酶蛋白表面凹陷，此凹陷远离乙酰胆碱酯酶催 化中心，体积适中，可容纳分子量为100-2500的分子，且凹陷内部较为疏水。由于第400位 天冬氨酸（Asp400)附近的凹陷具有以上特点，故选定其为固定腔。
[0070] 使用Suf lex-Dock分子对接模块，进行固定腔的小分子筛选。备选小分子 来自常用有机小分子库（Zinc数据库中的Purchasable范围中的小分子化合物数 据库，http://zinc. docking, org/)，共12520个分子。分子对接结果显示，编号为 ZINC01893945(Cas224445-12-9)的分子与乙酰胆碱酯酶活性中心对接打分为-0. 897,与 固定腔对接打分为8. 723。将ZINC01893945分子作为目标分子。
[0071] 将20%对苯二醛151111乙醇溶液与28氨基硅胶混合，301：搅拌反应301^11，沙芯将 上述硅胶加入30ml乙醇，滴加20ml5 %的ZINC01893945乙醇溶液40°C，搅拌反应60min。 抽滤并用20ml乙醇溶液洗涤3次，20ml水洗涤3次，制得固定化载体。
[0072] 漏斗抽滤并用20ml乙醇洗涤3次。
[0073] 将lg固定化载体分散在30ml0. 1M Tris-HCl缓冲溶液（pH = 7.4)中。加入 lml30U的乙酰胆碱酯酶的0. 1M Tris-HCl溶液。0°C搅拌反应15min，过滤并用0°C 20ml0. 1M Tris-HCl缓冲溶液（pH = 7. 4)洗涤3次，制备得到定向固定化乙酰胆碱酯酶。
[0074] 乙酰胆碱酯酶活性检测方法：反应体系终体积0. 2ml，100 μ 10. 07mol/L，pH8. 0的 磷酸盐缓冲液，50 μ 10. 75mmol/L底物（碘化硫代乙酰胆碱），50 μ 1酶源（调整蛋白含量 在40?80μ g/ml)或等酶量的固定化酶，在30°C情况下反应15min，加入1. 8ml DTNB-磷酸 盐-乙醇试剂，在412nm波长下进行比色测定，调透光度到100%的空白管加入显色剂后再 加入与测定管等量的酶液，以消除酶液本身对光吸收的影响。计算获得乙酰胆碱酯酶活性。 [0075] 采用该方法定向固定的乙酰胆碱酯酶的酶活性回收率为79. 8%。重复10次使用， 酶活性较首次使用的固定化酶活性可以保持76. 2%以上。-18°C 0. 1M Tris-HCl溶液存放 10天，酶活性较第一天使用的固定化酶活性可以保持93. 0 %以上。
[0076] 实施例4--乙酰胆碱酯酶
[0077] 选用乙酰胆碱酯酶（Acetylcholine Esterase，AChE)，使用PDB编号为1F8U的人 体乙酰胆碱酯酶分子三维晶体结构（三维晶体结构来自Protein Data Bank http://www. rcsb. org/pdb)，通过Sybyl软件对乙酰胆碱酯酶表面分析，获得其催化中心位于该酶中 心，第203位丝氨酸（Ser203)附近。在第400位天冬氨酸（Asp400)附近存在显著的乙酰 胆碱酯酶蛋白表面凹陷，此凹陷远离乙酰胆碱酯酶催化中心，体积适中，可容纳分子量为 100-2500的分子，且凹陷内部较为疏水。由于第400位天冬氨酸（Asp400)附近的凹陷具有 以上特点，故选定其为固定腔。
[0078] 使用Suf lex-Dock分子对接模块，进行固定腔的小分子筛选。备选小分子 来自常用有机小分子库（Zinc数据库中的Purchasable范围中的小分子化合物数 据库，http://zinc. docking, org/)，共12520个分子。分子对接结果显示，编号为 ZINC05273799(Casl08608-63-5)的分子与乙酰胆碱酯酶活性中心对接打分为-0. 897,与 固定腔对接打分为8. 723。将ZINC05273799分子作为目标分子。
[0079] 将5g石英滤膜在3mol/L的盐酸中100°C搅拌反应8h，过滤，120°C干燥活化12h。 活化后的5g石英滤，加入100ml无水甲苯，5ml3-氨丙基三乙氧基硅烷，110°C回流24h，过 滤，并用20ml甲苯清洗3次。室温真空干燥6h，制成氨基石英滤膜。
[0080] 将20%对苯二醛2〇1111乙醇溶液与38氨基石英滤膜混合，3〇1：搅拌反应3〇1^11，沙 芯将上述石英滤膜加入30ml乙醇，滴加20ml5%的ZINC05273799乙醇溶液40°C，搅拌反应 90min。抽滤并用20ml乙醇溶液洗涤3次，20ml水洗涤3次，制得固定化载体。
[0081] 漏斗抽滤并用20ml乙醇洗涤3次。
[0082] 将lg固定化载体放入在30ml0. 1M Tris-HCl缓冲溶液（pH = 7. 4)中。加入 lml25U的乙酰胆碱酯酶的0. 1M Tris-HCl溶液。0°C搅拌反应15min，过滤并用0°C 20ml0. 1M Tris-HCl缓冲溶液（pH = 7. 4)洗涤3次，制备得到定向固定化乙酰胆碱酯酶。
[0083] 乙酰胆碱酯酶活性检测方法：反应体系终体积0. 2ml，100 μ 10. 07mol/L，pH8. 0的 磷酸盐缓冲液，50 μ 10. 75mmol/L底物（碘化硫代乙酰胆碱），50 μ 1酶源（调整蛋白含量 在40?80 μ g/ml)或等酶量的固定化酶，在30°C情况下反应15min，加入1. 8ml DTNB-磷酸 盐-乙醇试剂，在412nm波长下进行比色测定，调透光度到100%的空白管加入显色剂后再 加入与测定管等量的酶液，以消除酶液本身对光吸收的影响。
[0084] 采用该方法定向固定的乙酰胆碱酯酶的酶活性回收率为81. 7%。重复10次使用， 酶活性较首次使用的固定化酶活性可以保持78. 1 %以上。-18°C 0. 1M Tris-HCl溶液存放 10天，酶活性较第一天使用的固定化酶活性可以保持95. 6 %以上。
【权利要求】
1. 一种基于分子模拟技术的复合定向固定化酶的方法，包括如下步骤： (1) 选取酶上远离催化中心位置的凹陷作为固定腔； (2) 选取与所述固定腔结合强且与所述催化中心结合弱的小分子； (3) 通过将所述小分子连接载体表面并与酶分子孵育，得到复合定向固定化的酶。
2. 按权利要求1所述的方法，其中所述酶以蛋白质为结构基础。
3. 按权利要求1所述的方法，其中所述小分子的分子量为50-50000Da。
4. 按权利要求1所述的方法，其中所述载体选自：聚合物、电极、介孔材料、纳米材料、 无机材料、复合材料。
5. 按权利要求1所述的方法，所述固定腔还具有以下特点： a) 固定腔与催化中心在疏水性、带电性、氢键供体/受体、氨基酸残基种类数量中的一 种或多种方面有显著性差异； b) 所述固定腔的大小介于分子量100-10000Da的分子体积。
6. 按权利要求5所述的方法，其选取所述固定腔步骤包括： (1) 使用分子模拟软件，对已有或构建的酶的三维结构表面和催化中心进行分析，分析 项目包括：疏水性、带电性、氢键供体/受体、酶蛋白表面主要凹陷结构位置和特点、氨基酸 残基种类数量； (2) 根据以上信息选定固定腔。
7. 按权利要求1所述的方法，其中分子对接筛选小分子包括以下步骤： (1) 使用分子对接软件，将小分子分别与所述催化中心和所述固定腔进行分子对接，在 分子对接过程中获得对接总能量和对接打分； (2) 选取定向固定化酶的目标小分子，目标小分子作为具有以下特征： a) 相对于与酶催化中心分子对接，与固定腔分子对接的总能量低，对接打分高； b) 在常规状态下，不与酶的固定腔外的其他部分发生自发性化学反应。
8. 按权利要求1所述的方法，其中筛选所得的目标小分子与载体表面连接方式选自直 接的、间接的和复合型的化学连接和物理连接。
9. 按权利要求6所述的方法，其中所述分子模拟软件选自：Sybyl、Surflex、AutoDock、 D0CK、3D_D0CK、Openeye、FRED、Molecular Operating Environment、HEX、FlexX、Maestro、 Glide、GOLD、ICM、ESCHER、MONTY、HADDOCK、Z-DOCK、FTDOCK、MolegroVirtualDocker、 DiscoveryStudio、Amber、Gaussian 和 Affinity 分子模拟软件、模块及程序。
【文档编号】C12N11/14GK104046610SQ201410228185
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】孙英, 刁剑雄 申请人:中国农业大学