Fgfr1基因实时pcr检测方法及其试剂盒和引物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因检测领域，尤其涉及FGFR1基因实时PCR检测方法及其试剂盒和引物。一种FGFR1基因实时PCR检测方法，该方法利用寡聚核苷酸引物对从肿瘤组织或细胞中提取的基因组DNA或者游离于血液或尿液中的为模板进行PCR扩增，所述的寡聚核苷酸引物的序列如下：FP--5’-GCTAGGTGCCGAGGGTGTT-3’RP?5’-ACTGCAGGCTCCTTCAGAAC-3’；上述的方法用于非疾病的诊断和治疗。本发明利用FGFR抑制剂对肿瘤病人进行个性化的靶向治疗，FGFR1基因扩增检测试剂盒的开发将带来极大的社会效益。
【专利说明】FGFR1基因实时PCR检测方法及其试剂盒和引物
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因检测领域，尤其涉及FGFRl基因实时PCR检测方法及其试剂盒和引物。
【背景技术】
[0002]成纤维生长因子受体I(FGFRl)分子靶点是一种新型有效蛋白靶点，近些年发现在部分乳腺癌、膀胱癌、恶性神经胶质瘤、脑膜瘤等肿瘤组织中FGFRl基因高度扩增，同时伴有FGFRl蛋白过度表达，其肿瘤发生机理是成纤维生长因子(FGF)与FGFRl结合，从而激发受体的酪氨酸激酶活性，使结合于激酶区的底物(信号分子)发生磷酸化，引发细胞内的一系列信号传导途径，刺激细胞繁殖、肿瘤生长，FGFRl可以与多种FGF结合。含有FGFRl基因高度扩增的肿瘤细胞对FGFRl信号传导有着依赖性，因此可以应用FGFRl抑制剂来抑制这些肿瘤细胞生长、导致肿瘤细胞凋亡，从而达到治疗癌症的效果。事实上，国际上有十多家公司(包括Boehringer Ingelheim,诺华,施贵宝等等)已经开发了十多种不同的能够抑制FGFRl的药物。
【发明内容】
[0003]本发明的第一个目的是提供一种FGFRl基因实时PCR检测方法，本发明的第二个目的是提供上述方法使用的试剂盒，本发明的第三个目的是提供上述的方法采用的寡聚核苷酸引物。该方法具有稳定性好，灵敏性高的特点。
[0004]为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案:
一种FGFRl基因实时PCR检测方法，该方法利用寡聚核苷酸引物对从肿瘤组织或细胞中提取的基因组DNA或者游离于血液或尿液中的为模板进行PCR扩增，所述的寡聚核苷酸引物的序列如下:
FP 5’ -GCTAGGTGCCGAGGGTGTT-3’
RP 5’ -ACTGCAGGCTCCTTCAGAAC-3’ ；
上述的方法用于非疾病的诊断和治疗。
[0005]作为优选，该方法还包括使用一个荧光标记探针。再优选，所述的荧光标记探针选用TaqMan探针。最优选，所述的荧光标记探针的核苷酸顺序为5’-FAM-CAAAGGTTAGGGAGGCAC-MGB-3，。
[0006]所述肿瘤细胞或组织可以是任何人肿瘤细胞和组织。作为优选，所述的肿瘤细胞或组织为乳腺癌、非细胞肺癌、膀胱癌、口腔鳞癌、食道鳞状细胞癌、卵巢癌或前列腺癌。再优选，所述的肿瘤细胞或组织为乳腺癌或肺鳞癌细胞或组织。
[0007]为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案:
一种用于FGFRl基因实时PCR检测的试剂盒，该试剂盒包括一组寡聚核苷酸引物，所述的寡聚核苷酸引物的序列如下:
FP 5’ -GCTAGGTGCCGAGGGTGTT-3’RP 5’ -ACTGCAGGCTCCTTCAGAAC-3。
[0008] 作为优选,该试剂盒还包括突光标记探针。再优选，所述的突光标记探针选用TaqMan探针。最优选，所述的荧光标记探针的核苷酸顺序为5’-FAM-CAAAGGTTAGGGAGGCAC-MGB-3，。
[0009]为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案:
寡聚核苷酸引物，所述的寡聚核苷酸引物的序列如下:
FP 5’ -GCTAGGTGCCGAGGGTGTT-3’
RP 5’ -ACTGCAGGCTCCTTCAGAAC-3’。
[0010]本发明利用FGFR抑制剂对肿瘤病人进行个性化的靶向治疗，首先需要筛选出那些在癌细胞中有FGFRl基因扩增的病人。因此本发明涉及一种基因诊断试剂盒，通过检测肿瘤组织中FGFRl的扩增情况，确定癌症的病变因素和制定有效治疗方案。如果存在FGFRl高度扩增情况，可以推荐患者接受FGFR抑制剂药物治疗，使适宜FGFR靶向治疗的患者获益；如果不存在FGFRl高度扩增，应及时考虑其它治疗药物，避免使患者蒙受药物的潜在毒性作用及不必要的经济负担，并错过最佳治疗时机。FGFRl基因扩增检测试剂盒的开发将带来极大的社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1显示本发明的扩增体系检测FGFRl =GAPDH=1:1基因扩增图。
[0012]图2显示本发明的扩增体系检测FGFRl:GAPDH=2:1基因扩增图。
[0013]图3显示本发明的扩增体系扩增HT29细胞株基因组DNA的结果图。
[0014]图4显示本发明的扩增体系扩增SW480细胞株基因组DNA的结果图。
【具体实施方式】
[0015]实施例1
本发明以构建的质粒为模板，构建FGFRl基因实时荧光PCR扩增反应体系，以FAM为信号检测通道，根据FGFRl基因以及GAPDH持家基因序列分别设计特异性探针和双引物，通过引物和检测体系的优化实现高准确度的特异性检测。检测FGERl基因扩增的方法包括一下步骤:
(1)针对FGFRl基因和GAPDH持家基因序列，应用Premier5.0设计特异性探针和双引物，引物和探针序列如表1所示。
[0016]表1 FGFRl及GAPDH弓丨物及探针信息
【权利要求】
1.一种FGFRl基因实时PCR检测方法，其特征在于:该方法利用寡聚核苷酸引物对从肿瘤组织或细胞中提取的基因组DNA或者游离于血液或尿液中的为模板进行PCR扩增，所述的寡聚核苷酸引物的序列如下:
FP 5’ -GCTAGGTGCCGAGGGTGTT-3’
RP 5’ -ACTGCAGGCTCCTTCAGAAC-3’ ； 上述的方法用于非疾病的诊断和治疗。
2.根据权利要求1所述的一种FGFRl基因实时PCR检测方法，其特征在于:该方法还包括使用一个荧光标记探针。
3.根据权利要求1所述的一种FGFRl基因实时PCR检测方法，其特征在于:荧光标记探针选用TaqMan探针。
4.根据权利要求1所述的一种FGFRl基因实时PCR检测方法，其特征在于:肿瘤细胞或组织为乳腺癌、非细胞肺癌、膀胱癌、口腔鳞癌、食道鳞状细胞癌、卵巢癌或前列腺癌。
5.根据权利要求4所述的一种FGFRl基因实时PCR检测方法，其特征在于:肿瘤细胞或组织为乳腺癌或肺鳞癌细胞或组织。
6.一种用于FGFRl基因实时PCR检测的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括一组寡聚核苷酸引物，所述的寡聚核苷酸引物的序列如下:
FP 5’ -GCTAGGTGCCGAGGGTGTT-3’
RP 5’ -ACTGCAGGCTCCTTCAGAAC-3。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括荧光标记探针。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于荧光标记探针为TaqManMGB探针。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于荧光标记探针的核苷酸顺序为5’-FAM-CAAAGGTTAGGGAGGCAC-MGB-3，。
10.寡聚核苷酸引物，其特征在于:所述的寡聚核苷酸引物的序列如下:
FP 5’ -GCTAGGTGCCGAGGGTGTT-3’
RP 5’ -ACTGCAGGCTCCTTCAGAAC-3’。
【文档编号】C12N15/11GK103966343SQ201410228061
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月26日 优先权日:2014年5月26日
【发明者】池万余 申请人:浙江数问生物技术有限公司