专利名称：一种聚乙二醇修饰的降钙素的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种聚乙二醇修饰的降钙素，具体为双端活化的聚乙二醇修饰的降钙
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背景技术：
降钙素(calcitonin)是由甲状腺滤泡旁细胞(又称c细胞)分泌的或非哺乳脊椎动物的腮腺合成分泌的，是一种降低血钙和血磷的激素。是钙代谢过程中的三大调节激素之一。降钙素是多肽类物质，能直接作用于破骨细胞的受体，抑制破骨细胞活性，促进成骨细胞形成、转化为正常代谢。骨质疏松症患者可以通过补充外源性降钙素，来刺激垂体释放促肾上腺皮质激素，达到防止骨质流失、增加骨量、提高骨骼强度的作用，同时还具有明显的对骨骼的镇痛作用。目前应用的药品主要是鲑降钙素和依降钙素。以鲑降钙素(sCT)的活性较好，鲑降钙素(Mlcalcitonin)是由32个氨基酸组成的多肽类物质，是一类具有高度活性的降钙素。目前的主要临床药物有注射剂和喷鼻剂两种剂型。降钙素在体内代谢稳定性较差，体内半衰期短(如sCT的半衰期为Hmin)。给药不方便，造成病人依从性下降，如治疗骨质疏松症需每日给药一次，高钙血症需每日一次或分两次皮下或肌内注射，如果注射的剂量超过ani，采取多个部位注射。对有效治疗骨质疏松症的降钙素类药物的研究和应用已有多年历史，但仍未克服其在体内代谢稳定性差的问题，药物的长效研究已经成为近年来降钙素研究的新热点。大量文献报道，化学修饰是延长蛋白质药物半衰期的一个有效途径。它是一种将分子量小的蛋白质药物共价连接到具有较大分子量的分子上，例如聚乙二醇和白蛋白共价连接到大分子上能减小免疫原性，改善可溶性和生物学利用度，以及增加抗蛋白水解作用， 同时也能够延长半衰期，减少给药次数。其中，聚乙二醇(PEG)是由环氧乙烷聚合而成的大分子聚合物，PEG类修饰剂和其他修饰剂相比，具有无毒性，良好的溶解性，免疫原性低，且相对分子量范围宽，选择余地大等优点。而且PEG可以将它的许多优良特性赋予修饰后的生物分子。经聚乙二醇共价修饰后，蛋白质药物的相对分子质量有所增加，减少了药物排泄，增加其抵抗蛋白酶分解的稳定性，降低免疫原性，这些改变均有利于延长药物在体内的半衰期，从而，蛋白质药物的药代动力学和药效性质得到明显改善。例如，PEG修饰的干扰素α (IFN α)与未修饰的IFN α相比，半衰期延长10 20倍；超氧化物歧化酶PEG修饰前半衰期为5min，PEG修饰后半衰期延长至4.池。PEG修饰剂可以针对sCT肽链中不同的氨基酸残基侧链基团进行修饰，sCT中 N-端Cys1的α -氨基、Lys11和Lys18的ε -氨基均可发生PEG化反应。PEG对sCT修饰产物中存在mono-，di-和tri-PEG三种类型，它们又都表现出了不同的药代动力学特性，同时，mono-, di-修饰的PEG-sCT在药物体内组织分布方面也表现出不同特性。专利US6506730，降钙素修饰位点为N端、Lysll和Lysl8，修饰剂为分子量为 200 20000的聚乙二醇。US 20060063914通过保护剂Fmoc or或Nsc保护蛋白或多肽的某些基团，进行PEG反应，再脱除保护剂。
发明内容
本发明提供一种聚乙二醇修饰的降钙素，其中所用聚乙二醇双端均经过活化，活化后的醛或羰基与降钙素的游离氨基反应形成共价交联的柔性分子，从而提高其稳定性， 延长半衰期，降低给药次数。本发明通过对PEG双端活化，形成一种新的修饰剂ALD-PEG-ALD，方法参考文 献 J. MiltonHarris, Evelyn C.Struck. Synthesis and Characterrization of Poly (ethylene GlycoDDerivatives，采用该新型修饰剂对鲑鱼降钙素进行修饰，获得一种全新的多肽修饰药物。
图.SCT及其修饰物sCT-PEG-sCT的药效学比较(注sCT组动物血钙值在4.5小时时降到最低，下降了 50%左右，30小时时基本恢复至给药前水平，36小时完全恢复正常值，而sCT-PEG-sCT组动物在8. 5小时时降至最低并维持此低水平至20小时，60小时时恢复至正常值，并且下降幅度也达到50%左右，因而可见修饰后的降钙素相对于sCT有长效作用，并且能使血钙维持低水平至少10小时以上。)
具体实施例实施例1双端活化聚乙二醇获得ALD-PEG-ALD以分子量为2000的药用级聚乙二醇为底物，加入草酰氯，DMSO在-60 V 到-70°C Swern反应，反应结束后用三乙胺淬灭，二氯甲烷萃取，饱和的氯化钠清洗，浓缩至干，加乙醚析出固体，抽滤干燥生成双端活化的聚乙二醇ALD PEG-ALD。实施例2ALD-PEG-ALD修饰鲑鱼降钙素sCT纯品浓度调节至3. Omg/ml，加入20mM氢硼氰化钠，充分溶解，按摩尔比 sCT ALD-PEG-ALD2000 = 1 1,1 5,1 10 加入 ALD-PEG-ALD，4°C反应 24hr，以确定两种试剂的最佳比例。用非还原电泳检测，结果发现主要为双修饰产物，扫描分析修饰率达到80%。利用S-100分子筛层析将修饰物sCT-PEG-sCT与其他多修饰分子及未修饰的sCT 分离。目标物质可用非还原电泳检测，分离后纯品冻干保存。实施例3修饰位点的鉴定分别对sCT-PEG-sCT和sCT进行胰蛋白酶酶切，采用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行检测。结果发现sCT-PEG-sCT比sCT质谱图铺中缺失N-端的 Cys1-Lys11,可以确定PEG应该修饰在N端的Cysl位。实施例4药效学评价sCT-PEG-sCT的降钙活性测定主要依据sCT的效价测定方法。健康雌性大白鼠(体重40 150g，每次实验各鼠体重相差不超过20g)，禁食18 个小时(同时喂蒸馏水)，在随机分成4组，每组不少于5只，称重，编号，按体重和顺序自腹部皮下每组注射一种浓度的标准品或供试品稀释液，注射体积按每IOOg鼠0. 4ml计算， 给药后准确1小时按给药顺序自眼眶静脉丛采血，使血液滴入小试管中，每鼠约取血10 15滴，3000r/min离心15 20min。取血清50 μ 1，加钙显色剂4. 0ml，摇勻，立即在570nm 波长处测定吸收度。每次实验同时取各种浓度的钙标准液与血清样品同条件操作做标准曲线，求得血清样品的钙值。结果见附图，sCT组动物血钙值在4. 5小时时降到最低，下降了 50%左右，30小时时基本恢复至给药前水平，36小时完全恢复正常值，而sCT-PEG-sCT组动物在8. 5小时时降至最低并维持此低水平至20小时，60小时时恢复至正常值，并且下降幅度也达到50%左右，因而可见修饰后的降钙素相对于sCT有长效作用，并且能使血钙维持低水平至少10小时以上。实施例5全身过敏反应检验豚鼠60只，雌雄各半，体重250_300g，均分为三组，将sCT与sCT-PEG-sCT按人用剂量的三倍腹腔给药，隔日一次，给药三次，使其致敏，将sCT与sCT-PEG-sCT按人用剂量的六倍与致敏后的第14天，21天分别于豚鼠小腿胫静脉注射激发，30min内观察并记录结果。表1豚鼠全身过敏试验级数判断标准
权利要求
1.一种聚乙二醇修饰的降钙素，其特征在于该聚乙二醇化降钙素是以聚乙二醇为连接物的两个降钙素分子的串联体。
2.权利要求1所述的聚乙二醇修饰的降钙素，其特征在于所用降钙素可以是鲑鱼降钙素、鳗鱼降钙素，也可以是人降钙素，优选鲑鱼降钙素。
3.权利要求1-2所述的聚乙二醇修饰的降钙素，其特征在于所用的聚乙二醇双端均经过活化，并且都能与降钙素共价交联。
4.权利要求1-3所述的聚乙二醇修饰的降钙素，其特征在于聚乙二醇两端被活化成醛或酮结构，优选为醛结构。
5.权利要求1-4所述的聚乙二醇修饰的降钙素，其特征在于所用聚乙二醇分子量从 200-200000道尔顿，优选2000-10000道尔顿，更优选为2000道尔顿。
6.含有如权利要求1-5所述的聚乙二醇修饰的降钙素的药物制剂在制备用于治疗骨质疏松症的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种聚乙二醇修饰的降钙素，旨在提供一种免疫原性低、活性高、半衰期长、给药次数少、稳定的蛋白质药物。其中的聚乙二醇双端活化，通过与多肽的游离氨基连接将两个降钙素连接成一个柔性分子。
文档编号C07K14/585GK102190719SQ201010117318
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月3日 优先权日2010年3月3日
发明者吴彦卓, 徐明波, 杨仲璠, 王俊玲, 赵晶晶 申请人:北京双鹭立生医药科技有限公司, 北京双鹭药业股份有限公司