克隆有鲑鱼降钙素基因的变铅青链霉菌的构建方法

专利名称：克隆有鲑鱼降钙素基因的变铅青链霉菌的构建方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，特别涉及克隆有鲑鱼降钙素基因的变铅青链霉菌的构建方法鲑鱼降钙素(Samon Calcitonin)SCT是一种由32个氨基酸组成的肽类激素，由鲑鱼后鳃体产生，分子量为3500。到目前为止，已在哺乳动物，鸟类、两栖类、鱼类乃至单细胞生物中都发现有降钙素或降钙素类似物存在。因此许多研究者认为降钙素是一种古老的激素。根据降钙素的一级结构可以分为三类。第一类为偶蹄类动物型如猪、牛、羊，第二类为灵长类和鼠型如人、鼠，第三类为非哺乳型如鲑鱼、鳗鱼和鸡的降钙素。三种类型中以第三类即鲑鱼、鳗鱼和鸡的降钙素活性最高，比第一类高10倍以上。鲑鱼降钙素氨基酸序列为N端→C端1、半胱氨酸，2、丝氨酸，3、天冬酰胺，4、亮氨酸，5、丝氨酸，6、苏氨酸，7、半胱氨酸，8、缬氨酸，9、亮氨酸，10、甘氨酸，11、赖氨酸，12、亮氨酸，13、丝氨酸，14、谷酰胺，15、谷氨酸，16、亮氨酸，17、组氨酸，18、赖氨酸，19、亮氨酸，20、谷酰胺，21、苏氨酸，22、酪氨酸，23、脯氨酸，24、精氨酸，25、苏氨酸，26、天冬酰胺，27、苏氨酸，28、甘氨酸，29、丝氨酸，30、甘氨酸，31、苏氨酸，32、脯氨酸-NH2。
不同来源降钙素在结构上共同特点为(1)降钙素1位和7位半胱氨酸间形成二硫键，使之成为环状结构；(2)在分子中形成一个亲水酯的螺旋；(3)羧基端为脯氨酰胺。其中C端酰胺化对活性影响大，亲水脂螺旋对其活性也十分重要，而1-7位间二硫键对生物活性为非必需的。
降钙素有多种生理功能，主要是调节钙、磷代谢及维持内环境稳定，此外对中枢神经系统的作用已日益引起人们关注。降钙素对骨的作用主要是直接抑制骨吸收，不仅抑制破骨细胞的活性和数量，而且能调节骨细胞的活性而促进骨的生长。因此在临床上主要用于治疗骨质疏松症、高钙血症、Paget’s病，以及癌的骨转移，急性胰腺炎等，降钙素能够抑制肠道对钙离子的吸收，有显著的抑制胃液及胃酸分泌作用，因此在临床上可用于治疗急性消化性溃疡，这一治疗作用正在试用中。此外，由于中枢神经系统中存在有降钙素的特异性受体，因此也可以认为降钙素是一种神经多肽，有较强镇痛效果，因此可以作为镇痛剂使用。
骨质疏松是一种常见病和多发病，据报道欧美发达国家有一亿左右病人，我国达6000万以上，随着人们生活水平提高，寿命不断延长，社会老龄化问题日渐受到重视，防治骨质疏松是其中主要问题之一，目前尽管有多种药物治疗，但50％以上采用降钙素，此外，由于其镇痛效果好，且基本无毒付作用，因此作为镇痛剂也日益受到临床重视。据权威部门估计，到2000年，本药品全球销售额可达十亿美元以上。本品种国内属空白，全靠进口。本发明通过基因工程方法，将鲑鱼降钙素基因克隆至变铅青链霉菌，获得了可以分泌产生鲑鱼降钙素的基因工程菌，如能推向生产，则可以填补国内空白，具有突出社会和经济效益，这是本发明的一个出发点。
当前获得鲑鱼降钙素可以采用下列方法1、从鲑鱼后鳃体进行提取分离1961年，加拿大Copp等人与渔业公司合作，从500,000条鲑鱼中获得了100公斤后鳃体组织，从中分离提纯获得了鲑鱼降钙素，对其进行了氨基酸组分分析，在此基础上美国Pott’s等确定了其结构。据了解目前日本帝国脏器制药和瑞土Ciba-Geigy公司合作，从鲑鱼进行降钙素分离提取，提取品已基本结束临床实验阶段。由于鲑鱼是较名贵的鱼，产量有限，其后鳃体组织极小，降钙素含量低，因此在实际生产中，提取分离有较大困难。
2、化学合成1969年瑞士Guttmann根据天然提取鲑鱼降钙素结构研究的结果，首次成功化学全合成了鲑鱼降钙素，目前临床应用的主要是化学合成的SCT。主要生产厂家有瑞士Sandoz，日本山之内制药及帝国脏器制造公司等。以Sandoz为例1992年销售额已达2.2亿美元。由于固相法合成肽技术难度较大，成本高，因此价格十分昂贵。
3、基因工程方法鉴于上述两种方法均存在较突出问题，因此近年来国外众多研究者采用基因工程手段进行SCT的研究。1993年美国Ray等人在大肠杆菌中用谷胱甘肽硫基转移酶和鲑鱼降钙素基因融合，表达了鲑鱼降钙素前体(SCT-Gly)，同时在中国仓鼠细胞(CHO细胞)中获得了酰胺化酶的成功克隆和表达，从而解决了基因工程降钙素C端酰胺化问题；日本相模中央化学所已完成基因工程SCT的研究。据了解目前国外、基因工程SCT尚处于临床研究阶段，在美国尚未获FDA批准。上述大肠杆菌SCT基因工程菌表达的是融合蛋白，因此操作复杂。
基于上述分析状况，本发明的目的在于构建一种可以高效分泌表达SCT的变铅青链霉菌基因工程菌，以期推向工业生产。
本发明的目的是这样达到的根据鲑鱼降钙素基因的编码核苷酸序列，设计了PCR(多聚酶链反应)引物，以鲑鱼DNA为模板，通过PCR扩增得到一个117个碱基对的DNA片段，经ABI公司自动测序仪测定，证明该片段为STC编码基因。根据已知的链霉菌分泌信号肽melc1编码基因核苷酸序列设计了PCR引物，以含有melc1编码基因的质粒PIJ702DNA为模板，通过PCR扩增获得了编码melc1基因的DNA片段。将SCT编码基因和melc1基因DNA片段连接后，插入链霉菌载体质粒，转化至变铅青链霉菌TK-54，挑选出所需转化子，经提取转化子质粒确定为含SCT编码基因的重组质粒，便获得了鲑鱼降钙素(SCT)基因工程菌，即克隆有鲑鱼降钙素基因的变铅青链霉菌。
现结合附图对本发明进行详细说明。


图1为克隆有鲑鱼降钙素基因的变铅青链霉菌构建步骤方框图。
图2为鲑鱼降钙素基因克隆菌株(Streptomyces lividans TK54-MS680)孢子丝。
图3为重组质粒Puc19-mel-SCT限制性内切酶酶切的凝胶电泳图。
图4为重组质粒PMS680限制性内切酶酶切的凝胶电泳图。
图5为重组质粒PMS680的构建示意图。
图6为重组SCT的高压液相图谱。
图7为鲑鱼降钙素基因工程菌(Streptomyces lividans TK54-MS680)降钙素分泌表达活性曲线。
图8为鲑鱼降钙素基因工程菌(Streptomyces lividans TK54-MS680)胞内降钙素水平的时间曲线。
图9为重组SCT的大鼠血清钙降低实验结果。
图1，是本发明克隆有鲑鱼降钙素(SCT)基因的变铅青链霉菌构建步骤方框图。
从图1可见，步骤1，PCR扩增分为两部分，第一部分是以鲑鱼DNA为模板，扩增获得鲑鱼降钙素编码基因，第二部分是以PIJ702DNA为模板，扩增获得分泌信号肽melc1编码基因；第二步骤为连接，加入T4DNA连接酶将SCT基因与melc1基因连接；第三步骤是连接，加入T4DNA连接酶将已连接好的SCT-melc1DNA与链霉菌载体质粒PIJ680进行连接；第四步骤是转化，本发明将上述连接好的DNA转化至变铅青链霉菌TK54(S·lividans TK54)原生质体；第五步骤为挑选转化子和提取重组质粒，选择抗硫链丝菌素转化子，然后提取重组质粒，选出重组质粒PMS680；第六步骤经过测定SCT活性，及高压液相色谱分析，确定得到含有重组质粒PMS680的变铅青链霉菌转化子为鲑鱼降钙素的基因工程菌，得到所需克隆有SCT基因的变铅青链霉菌。
以下对各步骤进行详细说明(一)PCR扩增1、PCR扩增获得鲑鱼降钙素(SCT)基因。
我们根据已知鲑鱼降钙素编码基因序列，设计了两段PCR引物P1和P2P15’TGCACTGCAGCAACCTCAGCACCTGT3’
PstIP25’GCGGATCCTACTAGCCCGGCGTACCACTTBamHICCCG3’以鲑鱼DNA为模板进行了PCR扩增。50微升反应体积中，含鲑鱼DNA4微克，引物P1、P2分别为40Pmol，1×PCR缓冲液(Mg+2浓度为2-4mM)，dNTPs终浓度为0.2mM，TagDNA聚合酶4单位，96℃变性5-10分，加TagDNA聚合酶，按下列条件进行五次循环90-95℃变性1-3分，40-45℃退火1-2分，70-75℃延伸1-2分；按下述条件进行二十五次循环90-95℃变性1-3分，50-55℃退火1-3分，70-75℃延伸1-2分。最后在70-75℃延伸8-15分。扩增结果经琼脂糖凝胶电泳表明，获得了一个117个碱基对(bP)的DNA片段。采用ABI公司自动核苷酸测序仪测定该DNA片段序列，与鲑鱼降钙素编码基因相符。此外符合引物设计要求，在表达产物C端多一个甘氨酸，这将有利于基因工程降钙素的酰胺化。
2、PCR扩增获得分泌信号肽melc1编码基因。
根据已知melc1编码核苷酸序列设计了两个PCR引物P3和P4P35’GCTGATCACGTCAGTTTTCG3’BclIP45’TGCACTGCAGGCGCGGGCGGCGGGAAG3’PstI以PIJ702DNA为模板，进行了PCR扩增。50微升反应体积中模板DNA1-3微克，引物P3和P4分别为60Pmol，1×PCR缓冲液(Mg+2浓度为2-4mM)，dNTPs终浓度为0.2mM，TagDNA聚合酶4单位。94℃变性5-10分，加TagDNA聚合酶后按下列条件进行五次循环90-95℃变性1-3分，30-40℃退火1-3分，70-75℃延伸1-2分；按下列条件循环二十五次90-95℃变性1-3分，40-45℃退火1-2分，70-75℃延伸1-2分，最后在70-75℃延伸8-15分。扩增结果经琼脂糖凝胶电泳表明获得了一段370碱基对(bP)的DNA片段。采用美国ABI公司自动核苷酸测序仪测定该DNA片段核苷酸序列与melc1信号肽基因相符。
(二)SCT基因和melc1基因片段的连接1、酶切用限性内切酶PstI和BamHI酶切SCT基因片段，用限制性内切酶BclI和PstI对melc1基因片段进行酶切(BclI和BamHI酶切位点可以互补)。大肠杆菌Puc19用ECoRI和BamHI酶切，酶切条件依公司提供条件进行。
2、连接将上述两酶切片段与载体质粒浓度比为3-5∶3-5∶1-2，加入T4DNA连接酶进行连接，连接按常规方法进行。
3、转化大肠杆菌JM109大肠杆菌感受态细胞的制备、转化及质粒提取步骤按Sambrook“分子克隆手册”(1988，美国冷泉港实验室出版)常规方法进行。将上述连接DNA转化至感受态的大肠杆菌JM109，涂布于加有X-gal(50-100微克/微升)和IPTG(50-60微克/毫升)的琼脂平板(还含有氨苄青霉素100微克/毫升)，37℃过夜培养，挑选白色空斑，提取质粒，获得重组质粒Puc19-mel-SCT，为了确定该质粒插入了melc1-SCT DNA片段，分别采用ECoRI和ECoRI-Hind III酶切该质粒，图3是重组质粒Puc19-mel-SCT酶切电泳结果。图中1为HindIII酶切入噬菌体DNA，作为分子量标准，2ECoRI酶切质粒PUC19mel-SCT，3ECoRI-HindIII双酶切PUC19mel-SCT’4ECoRI酶切PUC19。结果表明PUC19mel-SCTDNA片段已插入质粒PUC19，构成了重组质粒PUC19mel-SCT。
(三)SCT-melc1片段与链霉菌载体PIJ680的连接。
1、制备SCT-melc1DNA片段采用限制性内切酶SacI和XbaI酶切重组质粒PUC19mel-SCT’制备获得了melc1-SCT DNA片段。
2、连接上述已制备的melc1-SCT DNA片段与SacI和XbaI酶切的PIJ680质粒，在加入T4DNA连接酶的条件下，按常规方法进行连接，载体与DNA片段浓度比1∶3-5。
(四)转化本发明采用PEG1000处理，除去受体菌细胞壁，在原生质体形成的情况下，直接与DNA接触进行转化，再在特定再生培养基中生长，使细胞壁重新形成，成为转化子。
1、原生质体的制备将变铅青链霉菌TK54(Streptomyces lividans TK54)种于25mlYEME培养基中(酵母粉0.3％蛋白胨0.5％，麦芽提取物0.3％，萄葡糖1.0％，蔗糖34％，MgCl2·6H2O 0.1％，PH7.0)，培养基中加入适量玻璃珠。25-30℃振荡培养20-30小时，再以5-15％接种于新鲜YEME中(加入0.5％甘氨酸，适量玻璃珠)。在25-30℃振荡培养35-40小时，2000转-3000转/分离心5-15分钟，去上清。菌丝用10.3％蔗糖溶液洗涤，离心两次，加入2-5ml P缓冲液(Tris 0.3％，MgCl2·6H2O 2.04％，葡萄糖0.1％、CaCl2·2H2O 0.386％，蔗糖10％)，其中含有溶菌酶1-2mg/ml，于25-30℃放置30分钟以上，于相差显微镜下观察原生质体形成率大于90％，于2000转-3000转/分，离心5分钟左右，去上清，用1.2ml P缓冲液洗涤，2000-3000转/分离心5分左右，将所得原生质体悬浮于100微升P缓冲液中。
2、转化操作本发明在转化操作中，采用Hopwood等(Hopwood，D·A etalGenetic Manipulation in Streptomyces.The John Jnnes Foundation，Norwich，P110，1985)方法。取50微升变铅青链霉菌TK54的原生质体和1微克以下，上述已经连接的DNA样品混合，加入25％PEG1000(在P缓冲液中)1毫升，缓慢振荡2-6分钟，立即加入2-5毫升P缓冲液，于2000-3000转/分离心5分钟左右，用P缓冲液洗涤并离心一次，将原生质体悬浮于1ml P缓冲液中，取10-100微升涂布R2琼脂平板(蔗糖10.3％，酵母粉0.4％，CaCO3.2H2O 0.7％，酪蛋白水解0.01％，Tris 0.3％K2SO40.025％，蛋白胨0.3-0.5％，MgCl2·H2O 1％葡萄糖1％，KH2PO40.003％，琼脂1.5％，微量元素溶液0.2％，ZnCl20.004％，Na2B4O7·10H2O0.001％，MnCl2·4H2O 0.001％，CuCl2·2H2O 0.001％，FeCl3·6H2O0.02％，25-30℃培养15-20小时，涂布于加有硫链丝菌素25微克/毫升的R2琼脂平板上，25-30℃培养4-14天，获得抗硫链丝菌素的转化子。
3、挑选抗硫链丝菌的转化子上述琼脂平板于25-30℃培养4-14天后，陆续桃选抗硫链丝菌素的转化子，以未克隆重组DNA的变铅青链霉菌TK54为对照，它在硫链丝菌平板上不生长，因此可以从抗药性的提高判断绝大多数转化子中含有重组质粒。
4、重组质粒的提取采用Katz快速碱变性方法(Katz.E.et al1983 J.Gen·Microbiol1292703)。将转化子种于2mlYEME培养基中，(加适量玻璃珠)，25-30℃培养20-30小时，5-15％接种于新鲜YEME培养基2ml(加适量玻璃珠)中，25-30℃培养30-50小时，2000转-3000转/分离心5-10分钟，去上清，用STE缓冲液洗涤，离心，去上清，加入0.1-0.5ml碱性SDS溶液，置冰浴5-10分钟，加入0.2-0.4ml醋酸钠，于冰浴中放置30-60分钟，10000-15000转/分，离心10-30分钟，取上清，加入2.5倍体积予冷过的无水乙醇，-20℃放置2小时以上，10000-15000转/分离心10-30分钟，去上清，加入200微升TE缓冲液，1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积予冷无水乙醇，-20℃放置2小时以上，于10000-15000转/分，离心10-30分，去上清，减压干燥，溶于50微升TE缓冲液中，取适量进行琼脂糖凝胶水平平板电泳(1％琼脂糖)，电压3.5V/cm，缓冲液为TAE。
对琼脂糖凝胶电泳后确定为重组质粒的样品进行酶切。图4是重组质粒PMS680酶切的凝胶电泳图，其中MHindIII酶切入DNA作为分子量标准；1、BstE11酶切PIJ680，2、BstE11酶切No31转化子质粒，3、BstE11酶切No35转化子质粒(PMS680)，4、BstE11酶切No38转化子质粒(PMS680)，5、SalI酶切PIJ680，6、SalI酶切No31转化子质粒，7、SalI酶切No35转化子质粒(PMS680)，8、SalI酶切No38转化子质粒(PMS680)，9、PstI酶切PIJ680，10、PstI酶切No31转化子质粒，11、PstI酶切No35转化子质粒(PMS680)，12、PstI酶切No38转化子质粒(PMS680)，13、SphI酶切PIJ680，14、SphI酶切No31转化子质粒，15、SphI酶切No35转化子质粒(PMS680)，16、SphI酶切No35转化子质粒(PMS680)。
根据电泳结果可以确证melc1-SCT DNA片段已经插人质粒PIJ680，构成了重组质粒PMS680。图5是重组质粒PMS680的构建示意图。
(五)获得克隆有SCT基因的变铅青链霉基因工程菌。
1、S·lividans TK54-MS680克隆菌株的培养。
为了确证克隆菌株是否产生鲑鱼降钙素，将含有重组质粒PMS680的变铅青链霉菌TK54(S·lividans TK54-MS680)培养于YEME培养基中，(并中加有适量玻璃珠)，于25-30℃振荡培养20-30小时，再以5-15％接种于新鲜YEME培养基中(加有适量玻璃珠)，于20-30℃振荡培养24，48，72，96，120小时。
2、S·lividans TK54-MS680克隆菌株上清裂解液的制备。
取上述不同培养时间的发酵液于5000-10000转/分，4℃离心10-20分，去上清，将菌丝悬浮于STE缓冲液中，5000-10000/分4℃离心10-20分，去上清，此洗涤步骤重复一次，将所得菌丝悬浮于一定Tris·HCl(PH7.6)缓冲液中，置于冰浴，以超声波破碎细胞(30W，10秒/次×15～20次，每次间歇5秒)所获破碎细胞悬浮，于120000-15000转/分，4℃离心30分钟，弃沉淀，取上清，分装，保存于4℃测活备用。
3、S.lividans TK54-MS680分泌表达产物的分离纯化按前述条件培养工程菌80-100小时，离心，取上清(2000-4000转/分，10-20分)，弃菌丝，走大孔吸附树脂X5柱层析(发酵液∶树脂(V/V)＝1∶5-20)。柱层毕，用适量蒸馏水洗柱。以水∶丙酮＝1∶1洗脱柱子，分部收集，取EIA检测活性部分合并，挥发去丙酮，冷冻干燥。取适量冷冻干燥样品进行羧甲基纤维素柱层析，上柱前，纤维素以0.01M、PH4.5醋酸铵进行了平衡。柱子以0.03M(PH5.0)-0.13M(PH6.1)醋酸铵进行连续梯度洗脱，分部收集，在235nm进行紫外吸收光谱测定，合并EIA测定活性部分，对分子量1000的超滤膜进行超滤，以达到浓缩、脱盐目的。超滤毕样品再度冷冻干燥，保存于-20℃备用。图6是基因工程SCT的高压液相色谱分析图，柱子为C18EcoNopak分析柱，4.6×150mm(日本产)，流动相∶甲醇∶H2O＝70∶30，流速1ml/分，在215-220nm进行紫外检测。SCT标准品购自美国Sigma公司。此图结果表明，本工程菌分泌表达的产物是鲑鱼降钙素。
下列步骤是对S·lividans TK54-MS680基因工程菌活性的确证步骤(1)采用酶免法(EIA)测定实验用EIA检测试剂盒购自美国Penisula Laboratories公司。依公司提供操作步骤进行，分别取50微升待测样品溶液和含不同浓度的SCT标准品溶液，加样至96孔平板不同孔内(平板已包被有蛋白A)，随后依次于每样品孔加入25微升兔抗SCT的抗体和25微升生物素标记的SCT，于4℃放置，过夜。室温下，用300微升/孔实验缓冲液洗涤平板5次，然后于每样品孔加入链(霉)亲和素—辣根过氧化物酶试剂100微升，室温放置1小时，再次以300微升/孔实验缓冲液洗涤平板5次，每样品孔中加入100微升底物溶液(H2O2，TMB)室温下放置1小时后，于各样品孔加入100微升2N盐酸，于半小时内，以酶标比色计450nm比色，测定结果。图7是基因工程菌S·lividans TK54-MS680分泌表达鲑鱼降钙素的时间曲线，其中SCT免疫活性是采用EIA方法测定的。由图可见，菌丝的生长在60-72小时达到稳定期，而鲑鱼降钙素的分泌表达在96小时达到高峰。图8为基因工程菌胞内SCT水平的时间曲线，结果表明，工程菌生长24小时后，采用EIA方法即可测出SCT活性，但活性极低，至72小时后，胞内基本没有SCT活性，这表明本工程菌表达的SCT绝大部分为分泌表达。
(2)降低大鼠血清钙的测定办法SCT的主要生理功能为降低血清游离钙。实验动物为Wistar大鼠，体重60-80克，钙试剂盒为北京中生生物工程高技术公司产品。鲑鱼降钙素标准品为瑞士Sandoz公司产品。待测样品和标准品分别溶于0.1M醋酸盐缓冲液(PH3.6)，(46.3ml 0.2M醋酸+3.7ml 0.2M醋酸钠+0.1克牛血清清蛋白，加蒸馏水稀释至100ml)。实验前大鼠禁食、过夜，不限饮水。实验当天，将待测样品用0.1M醋酸钠缓冲液溶解，尾静脉注射，标准品为SCT，对照为缓冲液，给药后1小时，依次用乙醚麻醉大鼠，腋动脉取血，离心，取血清，用钙试剂盒测定血清钙含量。血清钙浓度(Ca+2)采用各大鼠的平均值。
降钙百分比
采用基因工程SCT提取品进行大鼠血清钙降低试验，样品在少于0.5-0.8mg用量时，可使大鼠血清钙降低28.5％以上。
综上所述，根据高压液相色谱分析，酶免实验，大鼠血清钙降低实验结果可以确证，克隆有重组质粒PMS680的变铅青链霉菌TK54-MS680为鲑鱼降钙素的基因工程菌。
本发明克隆有鲑鱼降钙素(SCT)基因的变铅青链霉菌构造建方法，可以获得能高效分泌表达SCT的基因工程菌S·lividans TK54-MS680)，工艺基本成熟，表达水平在继续提高中，在此基础上进一步改进可以达到工业化生产水平，菌种遗传稳定。
权利要求
1.克隆鲑鱼降钙素(SCT)基因的变铅青链霉菌的构建方法，其中包括PCR扩增；两个连接步骤；转化；挑选转化子，提取重组质粒和经确证后得到所需菌种五个步骤；其特征在于(1)PCR扩增根据已知鲑鱼降钙素基因核苷酸序列设计引物P1和P2，以鲑鱼DNA为模板，扩增获得鲑鱼降钙素基因，扩增反应采取两步不同条件循环方式，前五次循环为90-95℃变性1-3分，40-45℃退火1-2分，70-75℃延伸1-2分；后二十五次循环为90-95℃变性1-3分，50-55℃退火1-3分，70-75℃延伸1-2分。最后在70-75℃延伸8-15分；根据分泌信号肽melc1，核苷酸序列设计了引物P3和P4，以PIJ702DNA为模板，扩增获得了分泌信号肽melc1编码基因；扩增反应采取两步不同条件循环方式，前五次循环为90-95℃变性1-3分，30-40℃退火1-3分，70-75℃延伸1-2分，后二十五次循环为90-95℃变性1-3分，40-45℃退火1-2分，70-75℃延伸1-2分，最后在70-75℃延伸8-15分；(2)SCT-melc1DNA片段的连接PCR扩增后获得的117bP DNA片段(经序列分析确证为SCT编码基因)，用限制性内切酶PstI和BamHI酶切；PCR扩增后获得的370bPmelc1编码基因(经序列分析确证为melc1编码基因)以BclI和PstI进行酶切；以ECoRI-BamHI酶切Puc19质粒，以3-5∶3-5∶1-2浓度比，在加入T4DNA连接酶后进行连接，按Sambrook等人方法将连接的DNA转化至大肠杆菌JMl09，在含有50-100微克氨苄青霉和X-gal，IPTG的琼脂平板上，从白色菌落挑选转化子，提取重组质粒PUC109-mel-SCT，经SaCI-XbaI双酶切，获得一定数量的melc1-SCTDNA片段。(3)SCT-melc1DNA片段与链霉菌载体PIJ680的连接；将上述SCT-melc1DNA片段与SaCI-XbaI酶切的链霉菌载体质粒PIJ680以3-5∶1的浓度比例在T4DNA连接酶切作用下，按常规方法进行连接；(4)转化采用(3)步骤中连接的重组DNA，以变铅青链霉菌(4)转化采用(3)步骤中连接的重组DNA，以变铅青链霉菌TK54的原生质体为受体，按照Hopwood等报道的方法，将连接的DNA转化至该受体菌中；(5)挑选转化子及提取重组质粒以含25mg/ml硫链丝菌素的R2琼脂平板桃选含重组质粒的转化子，采用Katz的快速碱变性方法提取含重组质粒的转化子，将经琼脂糖凝胶电泳确定为重组质粒的DNA用限性内切酶BstE11，PstI，SalI和SphI分别进行酶切后，经琼脂糖凝胶电泳确证为插入SCT-melc1DNA片段的重组质粒PMS680，其表达产物经高压液相色谱分析；酶免实验；大鼠血清钙降低等实验确证，含有重组质粒PMS680的变铅青链霉菌TK54-MS680(Streptomyces lividans TK54-MS680)为鲑鱼降钙素的基因工程菌。
2.按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于在(1)PCR扩增步骤中，对SCT基因及melc1基因扩增条件中均采用了两步不同条件的循环方式，根据所设计的P1、P2引物，扩增获得的SCT基因编码产物鲑鱼降钙素C端多一个甘氨酸，这将有利于基因工程降钙素的酰胺化。
3.按照权利要求l所述的构建方法，其特征在于在(2)步骤SCT-melc1DNA片段连接中，以DNA浓度比为SCT DNA片段melc1DNA片段PUC19(ECoRI-BamHI)＝3-5∶3-5∶1，按常规方法连接，依Sambrook方法转化至大肠杆菌JM-109，提取获得重组重组质粒PUC19mel-SCT经SaCI-XbaI双酶切制备获得SCT-melc1DNA片段。
4.按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于在(3)步骤SCT-melc1DNA片段与链霉菌载体PIJ680的连接中，依常规方法进行，SCT-melc1DNA与载体SaCI-XbaI双酶切的链霉菌载体PIJ680以3-5∶1的DNA浓度比进行。
5.按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于在(4)步骤转化操作中，培养变铅青链霉菌TK54过程中，培养基要适量加入玻璃珠。
6.按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于在(4)步骤转化操作中，琼脂平板要加入硫链丝菌素，浓度为20-40微克/毫升，原生质体再生平板在25-30℃条件下培养4-14天。
7.按照权利要求1所述的构建方法，其特征在于在(5)步骤挑选转化子提取重组质粒中，采用Katz方法，含有重组质粒PMS680的重组子S·lividans TK54-MS680为鲑鱼降钙素的基因工程菌，在25-30℃振荡培养下80-96小时鲑鱼降钙素可达到分泌表达高峰。
全文摘要
本发明涉及克隆有鲑鱼降钙素(SCT)基因的变铅青链霉菌的构建方法。本发明采用基因工程技术，以质粒P
文档编号C12N15/16GK1165858SQ96105118
公开日1997年11月26日 申请日期1996年5月16日 优先权日1996年5月16日
发明者李元, 洪斌, 李嗣英, 陈松森, 刘伯英, 郭强, 王醒, 郭连宏, 高萍 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所