载体-宿主系统的制作方法

载体-宿主系统的制作方法
【专利摘要】本发明涉及包含载体的缺少必需基因的宿主细胞，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞是丝状真菌细胞。本发明还涉及包含载体的缺少必需基因的宿主细胞，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞包含重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸。
【专利说明】载体-宿主系统
【技术领域】
[0001]本发明涉及载体-宿主系统、宿主细胞、用于生产载体-宿主系统的方法、用于生产感兴趣的生物化合物的方法、用于筛选编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸的方法和使用宿主细胞和载体-宿主系统的方法。
技术背景
[0002]在原核生物质粒中，独立于宿主基因组的自主复制的环状DNA分子已经成为基础研究和生物技术研究的工具(workhouses)，所述基础研究和生物技术研究的目的是理解细胞过程或生产商业上感兴趣的产物比如酶、代谢产物等等。但是，和一些天然存在的质粒不同，细菌中构建的质粒天生是不稳定的，并且需要选择(例如营养缺陷型标记、显性生长标记或抗生素抗性标记)来以令人满意的水平保持在细胞中。因此，细胞中质粒的存在对培养基组成提出要求，或需要持续利用(昂贵的)抗生素。该特性不仅适用于原核生物，也适用于有限数目的真核生物，主要是酵母物种和少数的丝状真菌，其中迄今已经以一定程度的成功使用了自主复制的质粒。在出芽酵母Saccharomyces cerevisiae中，质粒载体含有天然存在的2 ii M质粒的复制子，或分离自染色体DNA的自主复制序列(ARS)。天然存在的质粒起始点和生物体-特异性ARS序列在一些其他酵母物种中也已经用作质粒复制子。但是， 在丝状真菌中，用来在酵母中开发自主复制的质粒载体的方法几乎没有成功，如2 y M复制子不在这些生物体中起作用的观察结果所例证的。因此，仅对丝状真菌中的复制质粒进行了有限的利用。
[0003]已经显不也在其他Aspergilli,多种Penicillium物种以及Gibberella fujikuroi 和 Trichoderma reesei 中起作用的子囊菌 Aspergillus nidulans 中最常用的质粒复制子是AMAl复制子(Gems等，1991Gene.98 (I):61-7)。该复制子表示重排的染色体A.nidulans DNA片段,所述DNA片段使得携带营养缺陷型标记(如pyrG-尿喃唳)或显性标记(如amdS-N-源或bleK-腐草霉素)的质粒能够以每个染色多拷贝地复制(Fierro 等，1996Curr Genet.29(5):482-9)。但是，类似于细菌质粒，基于AMAl的载体的有丝分裂非常不稳定，并且在丰富培养基(在PyrG和amdS的情况下)上的生长或无抗生素的培养基(在131#的情况下)上的生长导致质粒从细胞快速丢失。在许多情况下，工业发酵开发出非选择性复合培养基，所述培养基不允许使用这种有丝分裂不稳定的质粒。因此，在利用丝状真菌的大多数生产系统中，表达盒通常被异位整合进宿主基因组或偶尔经靶向整合插 A (例如niaD基因座处，允许针对氯酸盐抗性选择)。缺少参与非同源末端连接(NHEJ)的哺乳动物KU70和KU80蛋白的直向同源基因的突变体最近的可用性使得高效靶向整合策略在许多丝状真菌中可用(Ninomiya `等，2004; Proc Natl Acad Sci U S A.101:12248-53)。 但是，最终的表达仍然是基因座-依赖性的，并且允许有效表达的基因座的鉴定是耗时的。
[0004]因此，如果可提高工业宿主细胞中的自主复制质粒的稳定性，使得可使用非选择性、无抗生素的培养基，这将是非常有优势的。
【发明内容】

[0005]根据本发明，提供了包含载体的缺少必需基因的宿主细胞，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞是丝状真菌细胞。
[0006]本发明还提供了包含载体的缺少必需基因的宿主细胞，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中宿主细胞包含重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸。
[0007]本发明还提供了包含本发明的宿主细胞的载体-宿主系统。
[0008]本发明还提供了用于生产宿主细胞或载体-宿主系统的方法，所述方法包括:
[0009]a.提供宿主细胞和载体，所述载体至少包含自主复制序列和对所述宿主细胞而言必需的基因，
[0010]b.用载体和所述必需基因的破坏构建体共转化宿主细胞以使宿主细胞缺少必需基因。
[0011]本发明还提供了:
[0012]-用于生产感兴趣的生物化合物的方法，其包括在有益于生产感兴趣的生物化合物的条件下培养本发明的载体-宿主系统或宿主细胞，并任选地，从培养发酵液中分离感兴趣的化合物；
[0013]-用于生产感兴趣的生物化合物的方法，其包括生产本发明的宿主细胞或载体-宿主系统，并在有益于生产感兴趣的生物化合物的条件下培养载体-宿主系统或宿主细胞，并任选地，从培养发酵液中分离感兴趣的化合物；
[0014]-用于生产感兴趣的生物化合物的方法，其包括:
[0015]a.提供宿主细胞，所述宿主细胞缺少必需基因，所述宿主细胞包含载体，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中宿主细胞是(i)丝状真菌细胞或(ii)包含下述重组多核苷酸构建体的宿主细胞，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸，
[0016]b.任选地对所述宿主细胞提供重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸，
[0017]c.在有益于生产感兴趣的生物化合物的条件下培养宿主细胞，并任选地
[0018]d.从培养发酵液中分离感兴趣的生物化合物；
[0019]-用于生产感兴趣的生物化合物的方法，其包括:
[0020]a.提供宿主细胞，所述宿主细胞缺少必需基因，所述宿主细胞包含载体，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞是根据本发明的方法制备的，
[0021]b.任选地对所述宿主细胞提供重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸，
[0022]c.在有益于生产感兴趣的生物化合物的条件下培养宿主细胞，并任选地 [0023]d.从培养发酵液中分离感兴趣的生物化合物；
[0024]-用于筛选编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸的方法，其包括:
[0025]a.提供可能含有编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸的多核苷酸文库，
[0026]b.提供大量的个体宿主细胞，所述宿主细胞缺少必需基因并包含载体，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞是(i)丝状真菌细胞或(ii)包含重组多核苷酸构建体的宿主细胞，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸，
[0027]c.筛选用于表达感兴趣的生物化合物的转化体；
[0028]-用于筛选编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸的方法，其包括:
[0029]a.提供可能含有编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸的多核苷酸文库，
[0030]b.提供大量的个体宿主细胞，所述宿主细胞缺少必需基因并包含载体，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞是根据本发明的方法制备的，
[0031]c.筛选用于表达感兴趣的生物化合物的转化体；
[0032]-根据本发明的载体-宿主系统用于生产感兴趣的生物化合物的用途；
[0033]-根据本发明的载体-宿主系统用于表达编码感兴趣的化合物的多核苷酸的用途；
[0034]-缺少必需基因的宿主细胞用来稳定载体的用途，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列；和
[0035]-宿主细胞用来稳定载体-宿主系统的用途，所述宿主细胞是根据本发明的方法制备的宿主细胞。
[0036]附图简沭
[0037]图1P.chrysogenum/E.coli 穿梭质粒 pDSM-JAK-109,其包含如源自 pAMPF21* 的 AMAl区、组成型表达的DsRed.SKL盒和腐草霉素-抗性盒。
[0038]图2质粒pDSM-JA K-105，包含允许P.chrysogenum tif35基因的启动子被硝酸盐-诱导型P.chrysogenum niiA启动子替换的重组盒；以及用作选择标记的 P.chrysogenum niaD 基因。
[0039]图3A)pDSM-JAK_106，包含允许包括其调节区的基因组P.chrysogenum tif35基因被amdS表达盒替换的重组盒。在amdS表达盒侧翼的niaD_Fl和niaD_F2区表示正向重复，其可用来使用氟乙酰胺反选择再次从基因组中去除标记。
[0040]B)质粒 pDSM-JAK-106 的 P.chrysogenum tif35 缺失盒。
[0041]图4质粒pDSM-JAK-108，其包含如源自pAMPF21*的AMAl区、DsRed.SKL表达盒和 P.chrysogenum tif35 表达盒。注意，pDSM-JAK-108 不与 A.niger 和 P.chrysogenum(当缺少tif35基因时)染色体DNA序列显著同源。
[0042]图5质粒pDSM-JAK-116，包含重组盒，所述重组盒使得具有其自身调节序列的 P.chrysogenum tif35基因在P.chrysogenum基因组中的niaD基因座整合。选择基于硝酸盐还原酶活性的缺少进行，所述缺少引起对氯酸盐的抗性。
[0043]图6 质粒 pDSM-JAK-206,含有 A.nidulans tef 启动子和 A.nidulans trpC 终止子区的pD0NR221衍生物。
[0044]图7质粒pDSM-JAK-117，含有合成密码子对优化的T.reesei cbhIcDNA的pMK-RQ 衍生物。
[0045]图 8 质粒 pDSM-JAK-120,其包含质粒 pAMPF21* 的 AMAl 区、P.chrysogenum tif35 表达盒和密码子对优化的T.reesei cbh I表达盒。
[0046]图9A.niger tif35缺失盒。当片段和基因组DNA之间双同源重组(由x图解) 之后，Anig.tif35基因(包括上游启动子区的一部分)有效地被amdS选择标记替换。[0047]图10描绘了 pEBAlOOl载体。部分载体片段结合pEBA1002载体用于双向基因-靶向方法(bipartite gene-targeting method),目的是缺失 Rasamsonia emersonii 中的 ReKu800RF。载体包含2500bp5’上游侧翼区、lox66位点、A.nidulans gpdA启动子驱动的 ble编码序列的5’部分和pUC19的主链(Invitrogen,Breda,荷兰)。在转化R.emersonii 菌株之前，用限制性酶NotI消化去除E.coli DNA。
[0048]图11描绘pEBA1002载体。载体片段的部分结合pEBAlOOl载体用于双向基因-靶向方法，目的是缺失Rasamsonia emersonii中的ReKu800RF。载体包含ble编码区的3’部分、A.nidulans trpC 终止子、lox71 位点、2500bp 的 ReKu800RF 的 3’下游侧翼区，和 pUC19 的骨架(Invitrogen,Breda,荷兰)。在转化R.emersonii菌株之前,通过用限制性酶NotI 消化去除E.coli DNA
[0049]图12描绘用于在真菌中瞬时表达ere重组酶的pEBA513的图。pEBA513是pAMPF21 起源的载体，其含有AMAl区和CAT氯霉素抗性基因。描绘了 ere重组酶基因(ere)表达盒，其含有A.niger glaA启动子(Pgla)、ere重组酶编码区和niaD终止子。另外,指示了由A.nidulansgpdA启动子(PgpdA)、hygB编码区和P.chrysogenum penDE终止子组成的潮 霉素抗性盒。
[0050]图13描绘用来缺失R.emersonii的ReKu80基因的策略。缺失ReKu80的载体包含侧翼有1xP位点和用于靶向的ReKuSO基因的5’和3’同源区的重叠非功能ble选择标记片段(分裂标记)(I)。构建体通过在基因组ReKuSO基因座处和在重叠的同源型非功能 ble选择标记片段处的三次同源重组(X)进行整合(2)，并且替换基因组ReKuSO基因拷贝
(3)。随后，通过ere重组酶的瞬时表达去除选择标记，导致lox66和lox71位点之间的重组，产生ble基因缺失，剩余的双-突变体lox72位点留在基因组中(4)。使用该总体策略， ReKu800RF从基因组中去除。
[0051]图14描绘pEBA1007载体。部分载体片段结合pEBA1008载体用于双向基因-靶向方法，目的是缺失Rasamsonia emersonii中的ReTif350RF。载体包含ReTif350RF的 1500bp5’上游侧翼区、lox66位点、由A.nidulans gpdA启动子驱动的ble编码区的5，部分和pUC19的主链(Invitrogen, Breda,荷兰)。在转化R.emersonii菌株之前,通过用限制性酶NotI消化去除E.coli DNA。
[0052]图15描绘pEBA1008载体。载体片段的一部分结合pEBA1007载体用于双向基因-祀向方法，目的是缺失Rasamsonia emersonii中的ReTif350RF。载体包含ble编码区的3，部分、A.nidulans trpC终止子、lox71位点、ReTif350RF的1500bp3’下游侧翼区， 和pUC19的主链(Invitrogen, Breda,荷兰)。在转化R.emersonii菌株之前,通过用限制性酶NotI消化去除E.coli DNA。
[0053]图16描绘用来缺失R.emersonii的ReTif35基因的策略。缺失ReTif35的载体包含侧翼有1xP位点的重叠非功能ble选择标记片段(分开的标记)和用于靶向的ReTif35 基因5’和3’同源区(I)。构建体通过在基因组ReTif35基因座和在重叠的同源型非功能 ble选择标记片段处的三次同源重组(X)整合(2)，并且替换基因组ReTif35基因拷贝(3)。 必需基因 Pchr ? tif35 从 pDSM_JAK_108 表达(4)。
[0054]图17 描绘 pDSM-JAK-133 载体，E.coli/S.cerevisiae 穿梭载体，其含有 Scer ? HIS3营养缺陷型标记、ARS/CEN复制子和由Scer ? TDH3启动子表达的DsRed.SKL基因。
[0055]图18描绘pDSM-JAK-134载体，其中整个Scer ? HIS3营养缺陷型标记被 Scer ? TIF35基因替换的pDSM-JAK-133的衍生物。
[0056]图19描绘pDSM-JAK-135载体，其中部分Scer ? HIS3营养缺陷型标记被 Scer ? TIF35基因替换的pDSM-JAK-133的衍生物。
[0057]图20 描绘 pDSM-JAK-136 载体，其包含如源自 pAMPF21* 的 AMAl 区、DsRed.SKL 表达盒和具有自身调节序列的A.nidulans tif35基因。注意，pDSM-JAK-136不与A.niger、 P.chrysogenum和R.emersonii染色体DNA序列显著同源(aurl除外)。 [0058]图21描绘pDSM-JAK-139载体，其包含使得能够通过amdS表达盒替换替换基因组 P.chrysogenum aurl基因的重组盒。在amdS表达盒侧翼的niaD-Fl和niaD_F2区表示正向重复序列，其可用来使用氟乙酰胺反选择再次从基因组中去除标记。
[0059]发明详沭
[0060]现已令人吃惊地表明，可生产载体-宿主系统,其中包含自主复制序列的载体的稳定性大大增加。
[0061]因此，本发明在第一方面中涉及载体-宿主系统，其中，宿主缺少必需基因，且其中，载体至少包含所述必需基因和自主复制序列。
[0062]根据本发明的系统的一个大的优势是，本发明提供可靠并通用的系统，在所有相应条件下，即在孢子形成、萌发和工业生产过程期间，其较之现有技术水平的载体宿主系统具有增加的稳定性。另一个优势是可能与一种载体在多种不同的宿主中合作。还有另一优势是其可用于所有种类的培养基，包括复合(也称为非限定性)培养基。所有这些优势使得系统成为非常通用的系统。
[0063]载体可以是可便利地进行重组DNA程序的任何载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常将取决于载体与将引进载体的宿主细胞的相容性。优选地，载体是质粒。载体可以是线性的或闭合的环状质粒。载体可进一步包含允许容易地确定宿主细胞中载体的标记，优选地为非选择性标记。合适的标记包括GFP和DsRed。基因转化或载体整合至宿主基因组的机会必须最小化。本领域技术人员知道怎样构建具有最小整合至基因组的机会的载体。在一种实施方式中，载体缺乏与宿主基因组的显著相似性，以使整合进宿主基因组的机会最小化。这可通过使用源自宿主物种之外的另一物种的控制序列，比如启动子和终止子来实现。在一种实施方式中，来自A.nidulans的控制序列用于下述载体中，所述载体用于真菌的载体-宿主系统中，所述真菌特别是A.nidulansz之外的丝状真菌。此类载体的合适的例子是质粒pDSM-JAK-108，如本申请的图4中表示。本发明也包括本发明的载体-宿主系统的载体。
[0064]宿主细胞的缺乏在本文中被定义为下述表型特征，较之不缺少必需基因的亲本细胞，其中所述细胞生产更少的由必需基因编码的产物、具有降低的表达水平的转录自必需基因的mRNA或具有减少的由必需基因编码的产物的特异性(蛋白)活性，以这些可能性的组合。就必需基因的遗传损伤而言，宿主细胞通常是缺陷型的，导致必需基因的部分或完全没有功能。
[0065]清楚地，不存在完全缺少必需基因的宿主细胞。因而，完全缺少必需基因的本发明的宿主细胞是仅当其包含本发明的载体时可存在的宿主细胞。[0066]本发明的宿主细胞因而在其基因组中具有修饰，使得宿主细胞中的必需基因和包含功能性必需基因和自主复制序列的载体部分或完全没有功能。也就是说，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞的基因组或内源性遗传特性/DNA改变，导致必需基因和包含功能性必需基因和自主复制序列的载体的功能降低或无功能。
[0067]可使用技术人员可用的任何试验测量缺乏程度，比如转录谱、Northern印迹， Southern 印迹和 Western 印迹。
[0068]优选地,相对于不缺少必需基因的亲本细胞测量缺少必需基因的宿主细胞的缺乏程度(deficiency)。优选地，较之不缺少必需基因的亲本细胞，宿主细胞的缺乏程度:其中所述宿主细胞生产减少至少10%的由必需基因编码的产物、转录自必需基因的mRNA的表达水平降低至少10%、或由必需基因编码的产物的特异性(蛋白)活性降低至少10%。更优选地，缺乏程度是至少20%，甚至更优选地至少30%，甚至更优选地至少40%，甚至更优选地至少50%，甚至更优选地至少60%，甚至更优选地至少70%，甚至更优选地至少75%，甚至更优选地至少80%，甚至更优选地至少85%，甚至更优选地至少90%，甚至更优选地至少95%，甚至更优选地至少96%，甚至更优选地至少97%，甚至更优选地至少98%，甚至更优选地至少99%， 甚至更优选地至少99.5%，甚至更优选地至少99.9%和最优选地完全缺乏，即100%。
[0069]根据本发明的载体-宿主系统具有包含自主复制序列的载体的增加的稳定性。优选地，稳定性是相对于其中载体相同但是宿主不缺少必需基因的载体-宿主系统测量的。 优选地，比较在有非选择性固体培养基的平板上的随后的孢子形成和单菌落分离周期的载体的丢失，来测定稳定性。稳定性越高，载体从宿主细胞丢失前的花费时间越长，特别是在非选择性固体培养基，比如复合的或非限定性的培养基上时。在根据本发明的系统中，载体保持至少四个随后的孢子形成周期。优选地，载体保持至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个随后的孢子形成周期。更优选地，载体保持至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少60或至少70个随后的孢子形成周期。如果载体包含非选择性颜色标记比如GFP或DsRed，宿主中载体的存在可容易地通过菌落中存在标记颜色而被观察到。
[0070]优选地，较之其中载体相同但是宿主细胞不缺少必需基因的载体-宿主系统，根据本发明的载体-宿主系统的稳定性的增加至少是两-倍增加，更优选地至少三倍增加， 更优选地至少五倍增加，更优选地至少十倍增加，更优选地至少二十倍增加，更优选地至少五十倍增加，更优选地至少一百倍增加，更优选地至少两百倍增加，更优选地至少五百倍增加和最优选地至少一千倍增加。
[0071]优选地通过修饰亲本宿主细胞基因组中的必需基因获得缺陷型宿主细胞。也就是说，本发明的缺陷型宿主细胞是其基因组被修饰从而必需基因部分`或完全没有功能的细胞。
[0072]宿主细胞基因组中必需基因的所述修饰在本文中被定义为导致细胞基因组中多核苷酸序列的改变或增加的任何事件。修饰解释为一个或多个修饰。修饰可通过引入(插入)、置换或去除(缺失)核苷酸序列中的一个或多个核苷酸来实现。该修饰可在例如多核苷酸转录或翻译需要的编码序列或调节元件中。例如，核苷酸可被插入或去除，以致导致编码序列的终止密码子的引入、起始密码子的去除或开放阅读框的改变或移码。编码序列或其调节元件的修饰可根据本领域中已知的方法，通过下述实现:定点或随机诱变、DNA改组方法、DNA重装配方法、基因合成(见例如Young和Dong, (2004), Nucleic Acids Research32, Gupta 等(1968), Proc.Natl.Acad.Sci USA,60:1338-1344;Scarpulla 等 (1982)，Anal.Biochem.121:356-365; Stemmer 等(1995)，Genel64:49-53)或 PCR 产生的诱变。随机诱变程序的例子是本领域中熟知的，比如例如化学(例如NTG)诱变或物理(例如 UV)诱变。定点诱变程序的例子是Quick Change?定点诱变试剂盒(Stratagene Cloning
Systems, La Jolla, CA)、‘Altered Sites^ II 体外诱变系统’(Promega Corporation)
或使用如 Gene.1989Aprl5;77(l):51-9.(Ho SN, Hunt HD, Horton RM, Pullen JK, Pease LR “Site-directed mutagenesis by overlap extension using thepolymerase chain reaction，，)中描述的PCR或使用如Molecular Biology:Current Innovations and Future Trends.(Eds.A.M.Griffin和 H.G.Griffin。ISBN1-898486-01-8; 1995Horizon Scientific Press, PO Boxl, Wymondham, Norfolk, U.K.)中描述的 PCR 的重叠延伸。
[0073]基因组的修饰可通过Southern印迹或通过将修饰细胞的DNA序列与非修饰细胞的序列进行比较来测定。DNA的测序和基因组测序可使用本领域技术人员已知的标准方法进行，例如使用Sanger测序技术和/或下一代测序技术，比如Illumina GA2, Roche454, 等等，如 Elaine R.Mardis (2008), Next-Generation DNA Sequencing Methods, Annual Review of Genomics and Human Genetics9:387-402 中所综述的。
[0074]优选的修饰方法是基于基因替换、基因缺失或基因破坏的技术。
[0075]例如，在多核苷酸、核酸构建体或表达盒替换的情况下，可在待替换的目标基因座引入适当的DNA序列。适当的DNA序列优选地存在于克隆载体上。优选的整合克隆载体包含这样的DNA片段，其与待替换的基因座侧翼的多核苷酸同源或与其具有同源性，用于将克隆载体靶向整合至该预定的基因座。为了促进靶向整合，克隆载体在细胞转化之前优选地被线性化。优选地，进行线性化使得克隆载体的至少一端但是优选地任一端的侧翼均为与待替换的DNA序列(或侧翼序列)同源的序列。该过程称为同源重组并且该技术还可用于实现(部分)基因缺失或基因破坏。
[0076]例如，为了基因破坏，对应于内源性多核苷酸的多核苷酸可以被缺陷型多核苷酸， 即不能生产(完整功能性)蛋白质的多核苷酸替换。通过同源重组，缺陷型多核苷酸替换内源性多核苷酸。可以期望缺陷型多核苷酸也编码标记，其可以用于选择核酸序列已经被修饰的转化体。
[0077]可以以替代性的方式或与其他提到的技术结合的方式，使用基于E.coli中粘粒体内重组的技术，如:A rapid method for efficient gene in the filamentous Aspergillus nidulans (2000)Chaveroche, M-K., Ghico, J-M,和 d，Enfert C;Nucleic Acids Research,vol28,no22中描述的。可用来失活必需基因的其他技术是技术人员熟知的并且可以使用，包括基因沉默，例如通过RNA干扰(RNAi)或反义策略进行基因沉默，其中 mRNA被降解。
[0078]当根据本发明的载体与必需基因的破坏构建体同时转化时，为了增加必需基因失活的效率，必需基因优选地布置在基因组中1xP位点之间。Cre/LoxP系统已经显示在多种宿主细胞中起作用。当Cre与根据本发明的载体同时引入时，必需基因将通过Cre/loxP系统删除。Cre可例如作为单独载体上的编码多核苷酸，作为活性蛋白引入，或可以作为根据本发明载体上的编码序列存在。可通过本领域中已知的方法，比如基因替换，引入必需基因侧翼的1xP位点。为了便利的基因替换，选择标记与必需基因一起可布置在基因组中1xP 位点之间。当活化Cre时,这种标记将与必需基因一起删除。
[0079]可提高转化效率的另一方式是将必需基因布置在宿主基因组诱导型启动子的控制下。诱导型启动子可以是适合该目的的任何诱导型启动子，如化学或物理诱导的启动子 (比如通过温度或光)。本领域技术人员知道怎样选择这种启动子。在一种实施方式中，使用来自Penicillium chrysogenum的niiA启动子。该启动子被硝酸盐诱导但是被铵抑制。 当在铵作为唯一 N-源的培养基中培养时，宿主缺少必需基因。当在硝酸盐作为唯一 N-源的培养基中培养时，宿主细胞不缺少必需基因。在另一实施方式中，使用来自Aspergillus niger的xlnA启动子。该启动子被木糖诱导但是被葡萄糖抑制。当在葡萄糖培养基中培养时，宿主缺少必需基因。当在木糖培养基中培养时，宿主细胞不缺少必需基因。
[0080]当需要大量的转化体时，高转化频率是特别有用的改进。这种应用的例子是构建表达文库。较之熟知的表达系统比如E.coli，在真菌中是耗时的和劳动密集的技术，因为获得更少的转化体。在期望的生产生物体中制备表达文库的优势是宿主细胞更可靠的规模扩展和更相关的翻译(后)修饰。W02008/000715提供用于高通量转染丝状真菌的有效方法，该方法可结合本发明的方法使用。
[0081]自主复制序列可以是本领域技术人员可用的任何合适的序列，其使得质粒不依赖染色体复制而复制。优选地，自主复制序列是AMAl复制子(Gems等， 1991Gene.98 (I):61-7)。端粒重复序列也可产生自主复制(In vivo linearization and autonomous replication of plasmids containing human telomeric DNA in Aspergillus nidulans, Aleksenko et al.Molecular and General Genetics MGG, 1998-Volume260, Numbers2-3, 159-164，DO1:10.1007/s004380050881, Aleksenko 等 Molecular and General Genetics MGG,1998-Volume260, Numbers2_3,159-164, DO1:10.1007/ s004380050881)。来自酵母的CEN/ARS序列也是合适的。
[0082]必需基因优选是还未显示为非必需的基因。更优选地，必需基因是其缺乏造成宿主细胞无法生存的基因。更优选地，必需基因是其缺乏造成宿主细胞在所有条件下和在任何培养基，特别是复合(非限定性)培养基上无法生存的基因。在本发明的上下文中，必需基因可以是当另一(非必需)基因已经缺少时造成宿主细胞无法生存的基因。优选地， 必需基因也是其他宿主细胞中的必需基因。在一种实施方式中，必需基因是真菌中必需的基因。优选地，必需基因是丝状真菌中必需的，更优选地，必需基因是属于Penicillium、 Aspergillus和Rasamsonia/Talaromyces的丝状真菌中必需的。必需基因类型的合适例子包括，但不限于，参与下述的基因:DNA合成&修饰、RNA合成&修饰、蛋白合成&修饰、蛋白酶体功能、分泌途径、细胞壁生物合成和细胞分裂。在本申请的上下文中，必需基因不是营养缺陷型标记(比如PyrG)、显性生长标记(比如niaD和amdS)和显性抗性标记(比如 ble )。优选的必需基因是编码翻译起始因子3的g亚基的tif35基因，其在所有真核生物中具有直向同源物。在一种实施方式中，编码来自P.chrysogenum的翻译起始因子3的g亚基的tif35基因用作必需基因。进一步优选的必需基因是编码鞘脂合成所需要的酶——磷脂酰肌醇:神经酰胺磷酸肌醇转移酶的A.nidulans aurl基因。因而，在一种实施方式中， 编码来自A.nidulans的酶——磷脂酰肌醇:神经酰胺磷酸肌醇转移酶的aurl基因用作必需基因。[0083]真核细胞具有至少两个分开的路径(一个经同源重组(HR)和一个经非同源重组 (NHR)),通过其核酸(特别是DNA)可整合进宿主基因组。酵母Saccharomyces cerevisiae 是偏好同源重组(HR)的生物体。该生物体非同源重组与同源重组(NHR/HR)的比可从约
0.07 至 0.007 变化。
[0084]W002/052026公开了具有提高的靶向DNA序列进入其基因组的效率的 S.cerevisiae的突变体。这种突变体菌株缺少参与NHR的基因(KU70)。
[0085]与S.cerevisiae相反,大部分高级真核生物，比如丝状真菌细胞至哺乳动物细胞偏好NHR。丝状真菌中，NHR/HR比的范围在I和大于100之间。在这种生物体中，靶向整合频率相当低。
[0086]为了提高基因组中必需基因的靶向缺失，优选在根据本发明的载体-宿主系统的宿主细胞中同源重组(HR)的效率提高。
[0087]因此，优选地在根据本发明的载体-宿主系统中，宿主细胞的同源重组(HR)效率提高，这优选地以诱导型方式进行。宿主细胞的非同源重组(HR)效率优选地降低。在本发明优选的宿主细胞中，非同源重组/同源重组(NHR/HR)的比通常将减小。
[0088]因为NHR和HR路径是互联的，可通过调控一个或两个路径增加HR效率。HR组件表达的增加将提高HR的效率并且减小NHR/HR的比。NHR组件表达的减少也将减小NHR/HR t匕。根据本发明的载体-宿主系统的宿主细胞中的HR效率的增加优选地描绘为NHR/HR比减小，并且优选地相对于其中HR和/或NHR路径未经调控的亲本宿主细胞计算。HR和NHR 二者的效率可通过本领域技术人员可获得的多种方法测量。优选的方法包括测定单个载体构建体在亲本和经调控的宿主细胞二者中靶向整合和异位整合的效率。可然后为两种细胞类型计算NHR/HR比。随后，可计算NHR/HR比的减小值。W02005/095624中，广泛地描述了该优选的方法。
[0089]可以通过提高HR路径的效率和/或通过降低NHR路径的效率修饰亲本真核细胞， 获得较之亲本细胞具有降低的NHR/HR比的宿主细胞。优选地 ，NHR/HR比因而减小至少2 倍，优选地至少4倍，更优选地至少10倍。优选地，根据本发明的载体-宿主系统的宿主细胞中的NHR/HR比，较之亲本宿主细胞降低至少5%，更优选地至少10%，甚至更优选地至少 20%，甚至更优选地至少30%，甚至更优选地至少40%，甚至更优选地至少50%，甚至更优选地至少60%，甚至更优选地至少70%，甚至更优选地至少80%，甚至更优选地至少90%和最优选地至少100%。
[0090]根据一种实施方式，通过提高HR组件的表达水平降低NHR/HR比。本领域技术人员熟知HR组件。HR组件在本文被定义为，参与控制靶向整合多核苷酸进入宿主的基因组的所有基因和元件，所述多核苷酸与整合靶向的宿主基因组的某预定位点具有一定的同源性。
[0091]根据一种实施方式，通过降低NHR组件的表达水平减小NHR/HR比。NHR组件在本文被定义为，参与控制多核苷酸整合进入宿主基因组的所有基因和元件，而不管所述多核苷酸与宿主基因组序列的同源性程度。本领域技术人员熟知NHR组件。优选的NHR组件是选自由用于参与NHR路径的酵母基因的根据本发明的载体-宿主系统的宿主细胞的同源物或直向同源物组成的组的组件:KU70、KU80、RAD50、MRElU XRS2、LIG4、LIFU NEJl 和 SIR4(van den Bosch 等，2002，Biol.Chem.383:873-892 和 Allen 等，2003，Mo 1.CancerRes.1:913-920)。最优选的是KU70、KU80和LIG4之一和KU70和KU80 二者。可使用如本文所述用于获得必需基因的缺乏的方法实现NHR组件表达水平的降低。
[0092]因为可能降低参与NHR的组件的表达可导致不利的表型效果，优选地在根据本发明的载体-宿主系统的宿主细胞中，同源重组效率的提高是诱导型的。这可通过本领域技术人员已知的方法，例如通过使用NHR组件诱导型方法(例如通过将NHR组件布置在诱导型启动子之后)或通过使用NHR组件的瞬时破坏或通过将编码NHR组件的基因返回基因组来实现。
[0093]为了能够进一步改造根据本发明的载体-宿主系统的宿主细胞,根据本发明的载体-宿主系统的宿主细胞的缺乏可以是诱导型缺乏或不是诱导型缺乏。这可通过本领域技术人员已知的方法，例如通过将必需基因布置在宿主细胞基因组中诱导型启动子之后或通过使用必需基因的瞬时破坏或通过将整个的必需基因返回基因组来实现。诱导型启动子可以是适于该目的的任何诱导型启动子，比如化学或物理诱导的启动子(比如通过温度或光)。本领域技术人员知道怎样选择这种启动子。在一种实施方式中，使用来自Penicillium chrysogenum的niiA启动子。该启动子被硝酸盐诱导但是被铵抑制。当在铵作为唯一 N-源的培养基中培养时，宿主缺少必需基因。当在硝酸盐作为唯一 N-源的培养基中培养时，宿主细胞不缺少必需基因。在另一实施方式中，使用来自Aspergillus niger的xlnA启动子。 该启动子被木糖诱导但是被葡萄糖抑制。当在葡萄糖培养基中培养时，宿主缺少必需基因。 当在木糖培养基中培养时，宿主细胞不缺少必需基因。
[0094]宿主细胞可以是任何宿主细胞。宿主细胞可以是真核宿主细胞。优选地，真核生物是哺乳动物、昆虫、植物、真菌或海藻细胞。优选的哺乳动物细胞包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、293细胞、PerC6细胞和杂交瘤。优选的昆虫细胞包括例如Sf9和Sf21细胞和其衍生物。更优选地，真核生物是真菌细胞，例如酵母细胞，比如 Candida、Hansenula、Kluyveromyces、Pichia、Saccharomyces、Schizosaccharomyces 或 Yarrowia 菌株。更优选地 Kluyveromyces lactis>Saccharomyces cerevisiae>Hansenula polymorpha>Yarrowia lipolytica 或 Pichia pastoris 或丝状真菌细胞。最优选地，真核生物是丝状真菌细胞。
[0095]“丝状真菌”包括Eumycota和Oomycota亚门的所有丝状形式(如由 Hawksworth 等，在 Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi,第 8 版，1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK 中定义的)。丝状真菌特征为由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复合多糖组成的菌丝体壁。营养生长通过菌丝伸长进行。丝状真菌菌株包括，但不限于，下述菌株:Acremonium、Agaricus、 Aspergillus、Aureobasidium、Chrysosporium、Coprinus、Cryptococcus、Filibasidium、 Fusarium、Geosmithia、Humicola、Magnaporthe、Mucor、MyceIiophthora、NeocalIimastix、 Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Panerochaete、Pleurotus> Rasamsonia、 Schizophyllum、 Talaromyces、 Thermoascus、 Thermomyces> Thielavia、 Tolypocladium 和 Trichoderma。
[0096]优选的丝状真菌细胞属于下述种:Acremonium、Aspergillus、Chrysosporium、 Myceliophthora、 Penicillium、 Rasamsonia、 Talaromyces、 Thielavia、 Fusarium 或Trichoderma属，和甚至更优选地属于下述种:Aspergillus niger、Acremoniumalabamense、Acremonium chrysogenum、Aspergillus awamor1、Aspergillus foetidus、 Aspergillus sojae、Aspergillus fumigatus、Talaromyces emersoni1、Talaromyces thermophilus、Thermomyces lanuginosus、Thermoascus thermophilus、Thermoascus aurantiacus、 Thermoascus crustaceus、 Rasamsonia emersoni1、 Rasamsonia byssochlamyoides、Rasamsonia argillacea、Rasamsonia brevistipitata、Rasamsonia cyIindrospora、 Aspergillus oryzae、 Chrysosporium lucknowense、 Fusarium oxysporum、Myceliophthora thermophila、Trichoderma reese1、Thielavia terrestris 或 Penicillium chrysogenum。最优选的种是 Aspergillus niger 或 Penicillium chrysogenum。当宿主细胞是Aspergillus宿主细胞时，宿主细胞优选地是CBS513.88、 CBS124.903或其衍生物。当宿主细胞是Penicillimn宿主细胞时，宿主细胞优选地是 Penicillium chrysogenum 菌株 NRRL1951 和 Wisconsin54~l255 和所有工业衍生物， 特别是Penicillium chrysogenum菌株DS54465和DS61187。当宿主细胞属于也称为 Talaromyces的Rasamsonia属时，更优选地宿主细胞属于也称为Rasamsonia emersonii的种Talaromyces emersonii。当根据本发明的宿主细胞是也称为Rasamsonia emersonii的 Talaromyces emersonii宿主细胞时，宿主细胞优选地是CBS124.902或其衍生物。
[0097]本文使用的Rasamsonia emersonii (R.emersonii)菌株源自 ATCC16479，其用作野生型菌株。ATCC16479 之前也称为 Talaromyces emersonii 和 Penicillium geosmithia emersonii。当使用名字 Rasamsonia emersonii 时，也指 Talaromyces emersonii。 R.emersonii ATCC16479 的其他菌株名是 CBS393.64、IF031232 和 MI116815。
[0098]Rasamsonia (Talaromyces) emersonii 菌株 TEC-142 于 2009 年 7 月 I 日保藏在 CENTRAAL BUREAU VOOR SCHIMMELCULTURES，Uppsalalaan8, P.0.Box85167, NL-3508AD Utrecht，荷兰，登录号为CBS124902。TEC-142S是TEC-142的单个隔离群。
[0099]这些菌株适用于本发明。
[0100]丝状真菌的若干菌株在许多培养中心容易为公众所得，比如美国标准菌种保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)、Deutsche Sammlung von Mikroorgainicen und Zellkulturen GmbH (DSM)、Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), 和 Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern Regio`nal Research Center (NRRL)AspergiIIus niger CBS513.88, Aspergillus oryzae ATCC20423, IF04177， ATCC101I， ATCC9576， ATCC14488-14491， ATCCl1601, ATCC12892, P.chrysogenum CBS455.95，Penicillium citrinum ATCC38065, Penicillium chrysogenum P2, Talaromyces emersonii CBS124.902, Acremonium chrysogenum ATCC36225 或 ATCC48272， Trichoderma reesei ATCC26921 或 ATCC56765 或 ATCC26921, Aspergillus sojae ATCCl1906, Chrysosporium lucknowense Cl, Garg27K, VKM-F3500D, ATCC44006 和其衍生物。
[0101]优选地，当宿主细胞是丝状真菌宿主细胞时，宿主细胞基因组中额外地包含修饰， 使得其缺少至少以下之一:葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定的a -淀粉酶(amyA)、中性a -淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、毒素，比如赭曲霉毒素和烟曲霉毒素，和蛋白酶转录调节子PrtT。优选地,宿主细胞额外地包含编码主要胞外天冬氨酸蛋白酶PepA的pepA 基因的破坏。[0102]优选地，宿主细胞额外地包含修饰Sec61。优选的Sec61修饰是产生Sec61单向突变体的修饰；即其中重新合成的蛋白质可经Sec61进入ER的突变体，但是蛋白质不能经 Sec61离开。这种修饰在W02005/123763中广泛地描述。最优选地，Sec61修饰是S376W突变，其中丝氨酸376被色氨酸替换。这些和其他可能的宿主修饰也描述在W02012/001169、 W02011/009700、TO2007/062936、TO2006/040312 或 TO2004/070022 中。
[0103]根据本发明的载体-宿主系统可便利地用于生产感兴趣的生物化合物。宿主细胞可以已经能生产感兴趣的生物化合物。还可对宿主细胞提供重组的同源或异源多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体编码参与生产感兴趣的生物化合物的多肽。
[0104]因此，根据本发明的载体-宿主系统的宿主细胞优选地包含重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体包含编码参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸。多核苷酸还可直接编码感兴趣的生物化合物。
[0105]编码感兴趣的化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的多肽的重组多核苷酸构建体可位于根据本发明的载体-宿主系统的载体上。
[0106]根据本发明感兴趣的生物化合物可以是任何生物化合物。生物化合物可以是生物质或任何生物聚合物或代谢产物。生物化合物可以由组成生物合成或代谢路径的单个多核苷酸或一系列多核苷酸编码或可以是单个多核苷酸的直接产物或可以是一系列多核苷酸的产物。生物化合物可以是宿主细胞天然的或异源的。生物化合物可以根据W02010/102982 修饰。
[0107]术语“异源生物化合物”在本文中被定义为不是细胞天然的生物化合物；或天然生物化合物，其中已经进行结构修饰改变天然生物化合物。
[0108]术语“生物聚合物”在本文中被定义为相同的、类似的或不同的亚基(单体)的链 (或聚合物)。生物聚合物可以是任何生物聚合物。生物聚合物可以是例如，但不限于核酸、 多胺、多元醇、多肽(或聚酰胺)或多糖。
[0109]生物聚合物可以是多肽。多肽可以是具有感兴趣的生物活性的任何多肽。术语 “多肽”在本文中意思不是指特定长度的编码产物，并且因而，包括肽、寡肽和蛋白质。多肽进一步包括上述多肽和杂合多肽的天然存在的等位和工程改造的变型。多肽可以是根据 W02010/102982的修饰多肽。多肽对于宿主细胞可以是天然的或可以是异源的。多肽可以是胶原或明胶或其变体或其杂合体。多肽可以是抗体或其部分、抗原、凝血因子、酶、激素或激素变体、受体或其部分、调节蛋白、结构蛋白、报告子(reporter)或转运蛋白、参与分泌过程的蛋白、参与折叠过程的蛋白、分子伴侣、肽氨基酸转 运蛋白、糖基化因子、转录因子、合成肽或寡肽、胞内蛋白。胞内蛋白可以是酶比如，蛋白酶、神经酰胺酶、环氧化物水解酶、氨肽酶、酰基转移酶、醛缩酶、羟化酶、氨肽酶、脂肪酶、非核糖体合酶或聚酮合酶。多肽可以是胞外分泌的酶，比如氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、脱氧核糖核苷酸酶、葡聚糖酶、酯酶。酶可以是糖酶、例如纤维素酶比如内切葡聚糖酶、(6-葡聚糖酶、纤维二糖水解酶或(6-葡萄糖苷酶、GH61-酶、半纤维素酶或果胶分解酶比如木聚糖酶、木聚苷酶、甘露聚糖酶、半乳聚糖酶、半乳糖苷酶、果胶甲基酯酶、果胶裂解酶、果胶酸裂解酶、内切多聚半乳糖醛酸酶、外多聚半乳糖醛酸、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、阿拉伯木糖水解酶、半乳糖醛酸酶、裂解酶或淀粉分解酶；水解酶、异构酶或连接酶、磷酸酶类，比如植酸酶、酯酶，比如脂肪酶、磷脂酶、半乳糖脂酶、蛋白水解酶、乳制品酶和产物(例如凝乳酶、酪蛋白)、氧化还原酶比如氧化酶、转移酶或异构酶。酶可以是植酸酶。酶可以是氨肽酶、天冬酰胺酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、内切-蛋白酶、金属-蛋白酶、丝氨酸-蛋白酶、过氧化氢酶、几丁质酶、角质酶、环糊精葡萄糖基转移酶、脱氧核糖核苷酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、3 -半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡萄糖苷酶、3 -葡萄糖苷酶、卤素过氧化物酶、蛋白脱氨酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、 甘露糖苷酶、变位酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、多酚氧化酶、核糖核酸酶、 谷氨胺转氨酶或葡糖氧化酶、己糖氧化酶、单加氧酶。
[0110]根据本发明，多肽也可以是融合的或杂合的多肽，该多肽或其片段与另一多肽在 N-端或C-端融合。通过将编码一条多肽的核酸序列(或其一部分)融合至编码另一多肽的核酸序列(或其一部分)产生融合多肽。
[0111]生产融合多肽的技术是本领域中已知的，并且包括，连接编码多肽的编码序列，从而使编码序列在阅读框中并且融合多肽的表达受相同启动子(一个或多个)和终止子的控制。杂合多肽可包含得自至少两个不同多肽的部分或全部多肽序列的组合，其中所述两个不同多肽中的一个或多个对于宿主细胞而言是异源的。
[0112]生物聚合物可以是多糖。多糖可以是任何多糖，包括，但不限于，粘多糖(例如，肝素和透明质酸)和含氮多糖(例如，几丁质)。在更优选的选择中，多糖是透明质酸。
[0113]根据本发明感兴趣的多核苷酸可编码参与合成初级或次级代谢产物的酶，所属代谢产物如有机酸、类胡萝卜素、抗生素、抗癌药、颜料类异戊二烯、醇、脂肪酸和维生素。这种代谢产物可认为是根据本发明的生物化合物。
[0114]术语“代谢产物”包括初级和次级代谢产物二者；代谢产物可以是任何代谢产物。 优选的代谢产物是柠檬酸，葡糖酸和丁二酸、抗生素，生物活性药物、生物燃料和生物材料构建单元。
[0115]代谢产物可以比如在生物合成或代谢路径中通过一个或多个基因编码。初级代谢产物是细胞的初级或一般代谢的产物，其涉及能量代谢、生长和结构。次级代谢产物是次级代谢的产物(见，例如，R.B.Herbert, Biosynthesis of secondary Metabolites, Chapman 和 Hall, New York,1981)。
[0116]初级代谢产物可以是，但不限于，氨基酸、羧酸、脂肪酸、核苷、核苷酸、糖、甘油三酯或维生素。
[0117]感兴趣的化合物可以是选自下述的有机化合物:葡糖二酸、葡糖酸、戊二酸、月旨肪酸、丁二酸、酒石酸、草酸、乙酸、乳酸、甲酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、柠檬酸、反式丁烯二酸、衣康酸、乙酰丙酸、木质酸、乌头酸、抗坏血酸、曲酸、香豆酸、多不饱和脂肪酸、乙醇、 1，3-丙二醇、乙烯、甘油、木糖醇、胡萝卜素、虾青素、番茄红素和叶黄素。
[0118]次级代谢产物可以是，但不限于，生物碱、香豆素、类黄酮、聚酮、奎宁、类固醇、肽或萜、3 -内酰胺抗生素比如青霉素G或青霉素V和其发酵衍生物、头孢菌素、环孢素或洛伐他汀。次级代谢产物可以是抗生素、抗饲育剂、引诱剂、杀菌剂、杀真菌剂、激素、杀虫剂或杀鼠剂。优选的抗生素是头孢菌素类和(6-内酰胺类。
[0119]感兴趣的生物化合物还可以是选择标记的产物。选择标记是感兴趣的多核苷酸的产物，该产物提供杀虫剂或病毒抗性、重金属抗性、对营养缺陷型的原养等等。选择标记包括，但不限于，amdS (乙酰胺酶)、argB (鸟氨酸氨甲酰转移酶)、bar (磷化麦黄酮乙酰转移酶)、hygB (潮霉素磷酸转移酶)、niaD (硝酸盐还原酶)、pyrG (乳清苷-5'-磷酸脱羧酶)、SC (硫酸腺苷酰转移酶)、trpC (邻氨基苯甲酸合酶)、ble (腐草霉素抗性蛋白)以及其等同物。
[0120]根据一种实施方式，感兴趣的生物化合物优选地是如本文所述多肽。优选地，所述多肽是如本文所述的酶。
[0121]根据另一实施方式，感兴趣的生物化合物优选地是如本文所述的代谢产物。
[0122]当感兴趣的生物化合物是如本文之前定义的生物聚合物时，宿主细胞可以已经能生产生物聚合物。还可对宿主细胞提供重组的同源或异源多核苷酸构建体，所述构建体编码参与生产感兴趣的生物化合物的多肽。本领域技术人员知道怎样修饰微生物宿主细胞使得其能生产参与生产感兴趣的生物化合物的化合物。
[0123]术语“重组多核苷酸构建体”在本文是指单链的或双链的核酸分子，其分离自天然存在的基因或其已经被修饰以含有以可能自然中不存在的其他方式结合的和并置的核酸区段。当核酸构建体含有表达编码序列需要的所有控制序列、其中所述控制序列可操作地与所述编码序列连接时，术语重组多核苷酸构建体与术语“表达盒”同义。
[0124]术语“可操作地连接”在本文中被定义为下述构型，其中控制序列相对于DNA序列的编码序列适当地放置在一个位置，使得控制序列引导生产mRNA或多肽。
[0125]术语“控制序列”在本文中被定义为包括对于体外或宿主细胞中生产mRNA或多肽而言是必须的或有优势的所有组件。每个控制序列对编码多肽的核酸序列而是可以是天然或外源的。这种控制序列包括，但不限于，前导序列、Shine-Delgarno序列、最优的翻译起始序列(如Kozak, 1991，J.Biol.Chem.266:19867-19870中描述)、多聚腺苷酸化序列、原肽序列、前-原-肽序列(pre-pro-peptide-sequence)、启动子、信号序列，和转录终止子。 至少，控制序列包括启动子和转录终止信号以及翻译开始和终止信号。对于它们特定的目的，控制序列可被最优化。本发明中使用的优选的优化控制序列是W02006/077258中描述的那些。
[0126]为了引入利于控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区连接的特异性限制性位点，可以对控制序列提供接头。
[0127]控制序列可以是合适的启动子序列(启动子)。
[0128]控制序列还可以是合适的转录终止子(终止子)序列、被丝状真菌细胞识别以终止转录的序列。终止子序列可操作地与编码多肽的核酸序列的3’-端连接。细胞中有功能的任何终止子可用在本发明中。
[0129]根据本发明，总是以这种方式选择控制序列，以便基因转换(gene conversion)或载体整合进入宿主基因组的 机会最小化。本领域技术人员知道怎样构建具有最小整合进入基因组的机会的载体。在一种实施方式中，载体缺乏与宿主基因组的显著相似性，以将使整合进宿主基因组的机会最小化。这可通过使用源自另一种宿主物种的控制序列如启动子和终止子来实现。在一种实施方式中，来自A.nidulans的控制序列用于下述载体,所述载体用在真菌中，特别是除了 A.nidulans的丝状真菌载体-宿主系统中。
[0130]取决于宿主，合适的控制序列可以是获得自编码下述的多核苷酸:A.nidulans trpC、A.nidulans gpdA、A.nidulans 核糖体蛋白 S8 (AN0465)、A.nidulans tef (AN4218)、 A.0ryzae TAKA淀粉酶、A.niger葡糖淀粉酶(glaA)、A.nidulans邻氨基苯甲酸合酶、A.niger a -葡萄糖苷酶、trpC和Fusarium oxysporum膜岛素样蛋白酶。
[0131]控制序列还可以是合适的前导序列(多条前导序列)，对于由丝状真菌细胞翻译而言重要的mRNA的非翻译区。前导序列可操作地与编码多肽的核酸序列的5’ -端连接。细胞中有功能的任何前导序列可用在本发明中。
[0132]取决于宿主，合适的前导序列可获得自编码下述的多核苷酸:A.0ryzae TAKA淀粉酶和A.nidulans丙糖憐酸异构酶和A.niger GlaA和植酸酶。
[0133]其他控制序列可分离自Penicillium IPNS基因或pcbC基因、P微管蛋白基因。 WOO1/21779中引用的所有的控制序列通过引用并入本文。
[0134]控制序列还可以是多聚腺苷酸化序列，该序列可操作地与核酸序列的3’ -端连接，并且其当转录时被丝状真菌细胞识别为将多聚腺苷残基添加至转录mRNA的信号。细胞中有作用的任何多聚腺苷酸化序列可用在本发明中。
[0135]术语“启动子”在本文中被定义为下述DNA序列，其结合RNA聚合酶并且将聚合酶引导至编码生物化合物的核酸序列的正确的下游转录起始位点，以启动转录。RNA聚合酶有效地催化与编码区的合适的DNA链互补的信使RNA的组装。术语“启动子”也理解为包括用于在转录成mRNA之后翻译的5’-非编码区(启动子和翻译起点之间)，顺式作用转录控制元件如增强子，和能与转录因子相互作用的其他核苷酸序列。启动子可以是适用于真核或原核宿主细胞的任何适当的启动子序列，其显示转录活性，包括突变的启动子、截短的启动子和杂合的启动子，并且可获得自编码胞外或胞内多肽的多核苷酸，所述多核苷酸对细胞而言是同源的(天然的)或异源的(外源的)。启动子可以是组成型或诱导型启动子。
[0136]可使用的诱导型启动子的例子是化学和物理诱导型启动子，包括淀粉_、纤维素_、半纤维素(比如木聚糖-和/或木糖-诱导型)、铜_、油酸、氧和硝酸盐-诱导型启动子。启动子可选自下述组，该组包括但不限于获得自编码下述的多核苷酸的启动子: P.chrysogenum 硝酸盐或亚硝酸盐还原酶、A.0ryzae TAKA 淀粉酶、Rhizomucor miehei 天冬氨酸蛋白酶、A.niger中性a -淀粉酶、A.niger酸稳定的a -淀粉酶、A.niger或 A.awamori葡糖淀粉酶(glaA)、A.niger或A.awamori木聚糖内切酶(xlnA)或P -木聚苷酶(xlnD)、R.miehei脂肪酶、A.0ryzae碱性蛋白酶、A.0ryzae磷酸丙糖异构酶、A.nidulans 乙酸胺酶、Fusarium venenatum 淀粉葡糖苷酶(W000/56900)、Fusarium venenatum Dania (W000/56900) >Fusarium venenatum Quinn (W000/56900) >Fusarium oxysporum 膜蛋白酶样蛋白酶(W096/00787)、Trichoderma reesei 0 -葡萄糖苷酶、Trichoderma reesei 纤维二糖水解酶1、Trichoderma reesei纤维二糖水解酶I1、Trichoderma reesei内切葡聚糖酶1、Trichoderma reesei内切葡聚糖酶I1、Trichoderma reesei内切葡聚糖酶II1、 Trichoderma reesei 内切葡聚糖酶 IV、Trichoderma reesei 内切葡聚糖酶 V、Trichoderma reesei 木聚糖酶 1、Trichoderma reesei 木聚糖酶 I1、Trichoderma reesei ^ -木聚苷酶、 以及NA2_tpi启动子(来自编码A.niger中性a-淀粉酶和A.0ryzae磷酸丙糖异构酶的多核苷酸的启动子的杂合物)、和其突变体启动子、截短的启动子和杂合的启动子。启动子的其他例子是W02006/092396和W02005/100573中描述的启动子，其通过引用并入本文。使用启动子的另一例子描述在W02008/098933中。诱导型(异源的)启动子的其他例子是醇诱导型启动子alcA、使用四环素-响应启动子的tet系统、雌激素-响应启动子(Pachlinger 等(2005)，Appl&Environmental Microbio1672-678)。[0137]为了促使表达，编码参与生产感兴趣的化合物的多肽的多核苷酸可以是合成的多核苷酸。优选地根据W02006/077258或W02008/000632中描述的方法，合成的多核苷酸可以以密码子使用的形式优化。W02008/000632解决了密码子对优化。密码子对优化是这样的方法，其中编码多肽的核苷酸序列已经就它们的密码子使用，特别是使用的密码子对而言被修饰，以获得编码多肽的核苷酸序列的改进表达和/或所编码的多肽的改进生产。密码子对被定义为在编码序列(CDS)中的一组两个相继的三联体(密码子)。
[0138]进一步地，标准分子克隆技术，比如DNA隔离、凝胶电泳、核酸的酶限制性修饰、Southern分析、细胞的转化等等是技术人员熟知的并且被例如Sambrook等 (1989)“Molecular Cloning:a laboratory manual，，,Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York and Innis 等(1990) 〃PCR protocols, a guide to method and applications〃Academic Press, San Diego 描述。
[0139]可以使用cDNA、mRNA或可选地基因组DNA作为模板和适当的寡核苷酸引物，根据标准PCR扩增技术扩增核酸。如此扩增的核酸可被克隆进适当的载体并且通过DNA序列分析表征。
[0140]宿主细胞
[0141]本发明进一步涉及包含载体的缺少必需基因的宿主细胞，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列。
[0142]根据本发明的宿主细胞优选地是如本文前面“载体-宿主系统”部分中所定义的载体-宿主系统的宿主细胞。
[0143]必需基因优选地是如本文前面“载体-宿主系统”部分中定义的必需基因。
[0144]载体优选地是如本文前面“载体-宿主系统”部分定义的载体。
[0145]缺乏是如在本文前面“载体-宿主系统”部分中所定义的。
[0146]缺乏程度可使用对技术人员而可利用的任何检验，比如转录谱、Northern印迹、 Southern印迹和Western印迹来测量。
[0147]缺少必需基因的宿主细`胞的缺乏程度优选地是相对于不缺少必需基因的亲本细胞来测量的。优选地，较之不缺少必需基因的亲本细胞，宿主细胞的缺乏程度为:其中所述宿主细胞生产的由必需基因编码的产物减少至少10%和/或具有降低至少10%的的转录自必需基因的mRNA的表达水平和/或具有减少至少10%的的由必需基因编码的产物的特异性(蛋白)活性。更优选地，缺乏是至少20%，甚至更优选地至少30%，甚至更优选地至少 40%，甚至更优选地至少50%，甚至更优选地至少60%，甚至更优选地至少70%，甚至更优选地至少75%，甚至更优选地至少80%，甚至更优选地至少85%，甚至更优选地至少90%，甚至更优选地至少95%，甚至更优选地至少96%，甚至更优选地至少97%，甚至更优选地至少98%，甚至更优选地至少99%，甚至更优选地至少99.5%，甚至更优选地至少99.9%和最优选地缺乏是全部的，即100%。
[0148]根据本发明的宿主细胞具有增加的包含自主复制序列的载体的稳定性。稳定性优选地是相对于其中载体相同但是宿主不缺少必需基因的宿主细胞测量的。优选地，比较在有非选择性固体培养基的平板上的随后的孢子形成和单菌落分离周期中载体的丢失，来测定稳定性。稳定性越高，载体从宿主细胞丢失前花费的时间越长，特别是在非选择性固体培养基，比如复合的或非限定性的培养基上时。在根据本发明的系统中，载体保持至少四个随后的孢子形成周期。优选地，载体保持至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个或至少十个随后的孢子形成周期。更优选地，载体保持至少15、至少20、至少25、至少30、 至少40、至少50、至少60或至少70个随后的孢子形成周期。如果载体包含非选择性颜色标记，比如GFP或DsRed，宿主中存在载体可容易地通过菌落中存在标记颜色而被观察到。
[0149]优选地，较之其中载体相同但是宿主细胞不缺少必需基因的宿主细胞，根据本发明的宿主细胞的稳定性增加为至少两倍增加，更优选地至少三倍增加，更优选地至少五倍增加，更优选地至少十倍增加，更优选地至少二十倍增加，更优选地至少五十倍增加，更优选地至少一百倍增加，更优选地至少两百倍增加，更优选地至少五百倍增加和最优选地至少一千倍增加。
[0150]自主复制序列优选地是如本文前面“载体-宿主系统”部分定义的自主复制序列。
[0151]在一种实施方式中，如本文前面“载体-宿主系统”部分定义的，根据本发明的宿主细胞的同源重组(HR)效率增加，这优选地通过诱导型方式进行。宿主细胞优选地其非同源重组(HR)效率降低。非同源重组/同源重组(NHR/HR)的比在本发明的优选的宿主细胞中通常是减小的。 [0152]较之亲本细胞具有减小的NHR/HR比的宿主细胞可通过下述对亲本真核细胞修饰获得:通过增加HR路径的效率和/或通过降低NHR路径的效率。优选地，NHR/HR比因而减少至少两倍，优选地至少4倍，更优选地至少10倍。优选地，较之亲本宿主细胞，根据本发明的载体-宿主系统的宿主细胞中的NHR/HR比减小至少5%，更优选地至少10%，甚至更优选地至少20%，甚至更优选地至少30%，甚至更优选地至少40%，甚至更优选地至少50%，甚至更优选地至少60%，甚至更优选地至少70%，甚至更优选地至少80%，甚至更优选地至少90% 和最优选地至少100%。
[0153]为了能进一步对根据本发明的宿主细胞进行工程改造，所述宿主细胞的缺乏可以是或可以不是诱导型缺乏。这可通过本领域技术人员已知的方法，例如通过将宿主细胞的基因组中的必需基因放在诱导型启动子后面或通过使用必需基因的瞬时破坏或通过将整个必需基因放回基因组中来实现。诱导型启动子可以是适于目的的任何诱导型启动子，可以是化学或物理诱导的启动子(比如通过温度或光)。本领域技术人员知道怎样选择这种启动子。在一种实施方式中，使用了来自Penicillium chrysogenum的niiA启动子。该启动子被硝酸盐niiA启动子但被铵抑制。当在铵作为唯一 N源的培养基中培养时，宿主缺少必需基因。当在硝酸盐作为唯一 N源的培养基中培养时，宿主细胞不缺少必需基因。在另一实施方式中，使用了来自Aspergillus niger的xlnA启动子。该启动子被木糖诱导但被葡萄糖抑制。当在葡萄糖培养基中培养时，宿主缺少必需基因。当在木糖培养基中培养时， 宿主细胞不缺少必需基因。
[0154]根据本发明的宿主细胞可便利地用于生产感兴趣的生物化合物。
[0155]因此，根据本发明的宿主细胞优选地包含重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体包含下述多核苷酸，所述多核苷酸编码参与合成感兴趣的生物化合物的化合物。 多核苷酸还可直接编码感兴趣的生物化合物。
[0156]所述编码感兴趣的化合物的重组多核苷酸构建体可位于根据本发明的载体-宿主系统的载体上，所述重组多核苷酸构建体可位于根据本发明的载体-宿主系统的宿主基因组上或所述重组多核苷酸构建体可位于单独的载体上。[0157]感兴趣的生物化合物优选地是如本文前面“载体-宿主系统”部分定义的生物化合物。
[0158]用于生产载体-宿主系统的方法
[0159]本发明进一步涉及用于生产根据本发明的载体-宿主系统的方法，所述方法，其包括:
[0160]a.提供宿主细胞和载体，所述载体至少包含对所述宿主细胞而言必需的基因和自主复制序列，
[0161]b.用载体和所述必需基因的破坏构建体共转化宿主细胞以使宿主细胞缺少必需基因。
[0162]如果宿主细胞是诱导型地缺少必需基因,包括:
[0163]a.提供宿主细胞和载体，所述载体至少包含对所述宿主细胞而言必需的基因和自主复制序列，
[0164]b.用所述必需基因的破坏构建体转化宿主细胞，以使宿主细胞诱导型地缺少必需基因，
[0165]c.用载体转化宿主细胞；
[0166]的根据本发明的用于生产载体-宿主系统的方法也是本发明的一部分。技术人员知道只要还未用步骤c中的载体转化宿主，步骤b中产生的宿主细胞就不是“缺少的状态”。
[0167]用于转化、共转化和使用破坏构建体的方法的其他改变方法描述于 W02008/000715(高通量转染)、W02009/150195 和 W02008/113847 中。
[0168]宿主细胞、载体、必需基因和自主复制序列优选地是如本文前面“载体-宿主系统”部分定义的那些。缺乏是如本文前面“载体-宿主系统”部 分所定义的。
[0169]缺少必需基因的宿主细胞的缺乏程度优选地是相对于不缺少必需基因的亲本细胞测量的。优选地，较之不缺少必需基因的亲本细胞，宿主细胞的缺乏程度为:其中所述宿主细胞生产由必需基因编码的产物减少至少10%的和/或具有降低至少10%的的转录自必需基因的mRNA的表达水平和/或具有减小至少10%的的由必需基因编码的产物的特异性 (蛋白)活性。更优选地，缺乏是至少20%，甚至更优选地至少30%，甚至更优选地至少40%， 甚至更优选地至少50%,甚至更优选地至少60%,甚至更优选地至少70%,甚至更优选地至少 75%，甚至更优选地至少80%，甚至更优选地至少85%，甚至更优选地至少90%，甚至更优选地至少95%，甚至更优选地至少96%，甚至更优选地至少97%，甚至更优选地至少98%，甚至更优选地至少99%，甚至更优选地至少99.5%，甚至更优选地至少99.9%和最优选地缺乏是全部的，即100%o
[0170]宿主细胞具有包含自主复制序列的载体的增加的稳定性。稳定性优选地是相对于其中载体相同但是宿主不缺少必需基因的宿主细胞测量的。优选地，比较在有非选择性固体培养基的平板上的随后的孢子形成和单菌落分离周期中的载体丢失，来测定稳定性。稳定性越高，载体从宿主细胞丢失前花费的时间越长，特别是在非选择性固体培养基，比如复合的或非限定性的培养基上时。在根据本发明的系统中，载体保持至少四个随后的孢子形成周期。优选地，载体保持至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个或至少十个随后的孢子形成周期。更优选地，载体保持至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少 50、至少60或至少70个随后的孢子形成周期。如果载体包含非选择性颜色标记，比如GFP或DsRed，宿主中存在载体可容易通过菌落中存在标记颜色而被观察到。
[0171]优选地，较之其中载体相同但是宿主细胞不缺少必需基因的宿主细胞，宿主细胞的稳定性增加是至少两倍增加，更优选地至少三倍增加，更优选地至少五倍增加，更优选地至少十倍增加，更优选地至少二十倍增加，更优选地至少五十倍增加，更优选地至少一百倍增加，更优选地至少两百倍增加，更优选地至少五百倍增加和最优选地至少一千倍增加。
[0172]优选地，如本文前面“载体-宿主系统”部分所述的，宿主细胞的同源重组(HR)效率增加，这优选地以诱导型方式进行。优选地，宿主细胞的非同源重组(HR)效率降低。在本发明的优选的宿主细胞中，非同源重组/同源重组(NHR/HR)的比通常会减小。
[0173]根据本文前面“载体-宿主系统”部分所述的方法，可得到缺少必需基因的宿主细胞。在一种实施方式中，用破坏构建体转化宿主细胞。这种破坏构建体优选地包含对应于野生型多核苷酸的多核苷酸，使得野生型多核苷酸被缺陷型多核苷酸，即不能生产(全功能) 蛋白质的多核苷酸替换。通过同源重组，缺陷型多核苷酸替换内源性多核苷酸。
[0174]在一种实施方式中，同时用破坏构建体和至少包含所述宿主细胞的必需基因和自主复制序列的载体进行转化，以同时破坏必需基因的基因组拷贝并用载体引入补充的拷贝。
[0175]至少包含宿主细胞的必需基因和自主复制序列的载体还可包含重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体编码参与合成感兴趣的生物化合物的化合物。感兴趣的生物化合物优选地是本文前面“载体-宿主系统”部分所述的那些。破坏必需基因之前或之后，和/或引入至少包含宿主细胞的必需基因和自主复制序列的载体之前或之后，还可使用单独的转化事件，在单独的载体上将所述编码参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的重组多核苷酸构建体引入宿主细胞。在本发明的一种实施方式中，如本文前面所述的cre/ 1xP系统是用来失活基因组上的必需基因。
[0176]通过将多核苷酸、表达载体或多核苷酸构建体引入细胞而对宿主细胞的转化优选地通过本领域中熟知的技术(见Sambrook&Russell; Ausubel,见上文)进行。转化可包括下述方法，所述方法包括原生质体形成、原生质体转化和以本身已知的方式的细胞壁再生。 用于转化Aspergillus, Penicillium和Rasamsonia细胞的合适的程序描述于EP238023和 Yelton等人，Proceedings of the National Academy of Sciences USA81:1470_1474and Cantoral et al.，1987; Bio/Technol.5:494-497 中。使用 Agrobacterium tumefaciens 转化Aspergillus和其他丝状真菌宿主细胞的合适的程序描述于例如De Groot等人的 Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fung1.Nat Biotechnol.1998，16:839-842 中。误排于 Nat Biotechnoll99816:107 4 中。通过 Malardier 等人，1989，Gene78:147156 或在 W096/00787 中描述了转化 Fusarium 种的合适的方法。可应用其他方法，比如是用如Christiansen et al., Biolistic transformation of the obligate plant pathogenic fungus, Erysiphe graminis f.sp.horde1.1995, Curr Genet.29:100-102中描述的基因枪转化的方法。可使用Becker and Guarente, In Abel son, J.N.and Simon, M.1., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods in Enzymology,Volumel94, ppl82-187,Academic Press, Inc., New York ;Ito 等人，1983，Journal of Bacteriology 153:163 ;和 Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA75:1920 描述的程序转化酵母。
[0177]用于生产感兴趣的生物化合物的方法
[0178]本发明进一步涉及用于生产感兴趣的生物化合物的方法，其包括在有益于生产感兴趣的生物化合物的条件下培养根据“载体-宿主系统”部分的载体-宿主系统或根据“宿主细胞”的宿主细胞，并任选地，从培养发酵液中分离感兴趣的化合物。
[0179]本发明进一步涉及用于生产感兴趣的生物化合物的方法，其包括:
[0180]a.提供宿主细胞，所述宿主细胞缺少必需基因，所述宿主细胞包含载体，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，[0181]b.任选地提供有重组多核苷酸构建体的所述宿主细胞，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸，
[0182]c.在有益于生产感兴趣的生物化合物的条件下培养宿主细胞，和任选地
[0183]d.从培养发酵液中分离感兴趣的生物化合物。
[0184]宿主细胞、载体、必需基因和自主复制序列优选地是如本文前面“载体-宿主系统”部分定义的那些。
[0185]缺乏是如本文前面“载体-宿主系统”部分所定义的。
[0186]缺少必需基因的宿主细胞的缺乏程度优选地是相对于不缺少必需基因的亲本细胞测量的。优选地，较之不缺少必需基因的亲本细胞，宿主细胞的缺乏程度:其中所述宿主细胞生产减少至少10%的由必需基因编码的产物和/或具有降低至少10%的的转录自必需基因的mRNA的表达水平和/或具有减少至少10%的的由必需基因编码的产物的特异性(蛋白)活性。更优选地，缺乏至少20%，甚至更优选地至少30%，甚至更优选地至少40%，甚至更优选地至少50%，甚至更优选地至少60%，甚至更优选地至少70%，甚至更优选地至少75%， 甚至更优选地至少80%，甚至更优选地至少85%，甚至更优选地至少90%，甚至更优选地至少 95%，甚至更优选地至少96%，甚至更优选地至少97%，甚至更优选地至少98%，甚至更优选地至少99%，甚至更优选地至少99.5%，甚至更优选地至少99.9%和最优选地缺乏是完全的，即
100% o
[0187]宿主细胞具有包含自主复制序列的载体的增加的稳定性。优选地，稳定性是相对于其中载体相同但是宿主不缺少必需基因的宿主细胞测量的。优选地，比较在有非选择性固体培养基的平板上的随后的孢子形成和单菌落分离周期中的载体丢失，来测定稳定性。 稳定性越高，载体从宿主细胞丢失前花费的时间越长，特别是在非选择性固体培养基，比如复合的或非限定性的培养基上时。在根据本发明的系统中，载体保持至少四个随后的孢子形成周期。优选地，载体保持至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个或至少十个随后的孢子形成周期。更优选地，载体保持至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少60或至少70个随后的孢子形成周期。如果载体包含非选择性颜色标记，比如 GFP或DsRed，宿主中存在载体可容易通过菌落中存在标记颜色而被观察到。
[0188]优选地，较之其中载体相同但是宿主细胞不缺少必需基因的宿主细胞，宿主细胞的稳定性增加是至少两倍增加，更优选地至少三倍增加，更优选地至少五倍增加，更优选地至少十倍增加，更优选地至少二十倍增加，更优选地至少五十倍增加，更优选地至少一百倍增加，更优选地至少两-百倍增加，更优选地至少五一百倍增加和最优选地至少一千倍增加。[0189]优选地，如本文前面“载体-宿主系统”部分所述的，宿主细胞的同源重组(HR)效率增加，这优选地通过诱导型方式进行。优选地，宿主细胞的非同源重组(HR)效率降低。在本发明的优选的宿主细胞中，非同源重组/同源重组(NHR/HR)的比通常会减小。
[0190]感兴趣的生物化合物优选地是本文前面“载体-宿主系统”部分所述的那些。
[0191]根据本文前面“载体-宿主系统”部分所述的方法，可得到缺少必需基因的宿主细胞。在一种实施方式中，用破坏构建体转化宿主细胞。这种破坏构建体优选地包含对应于野生型多核苷酸的多核苷酸，使得野生型多核苷酸被缺陷型多核苷酸，即不能生产(全功能) 蛋白质的多核苷酸替换。通过同源重组，缺陷型多核苷酸替换内源性多核苷酸。
[0192]在一种实施方式中，同时用破坏构建体和至少包含所述宿主细胞的必需基因和自主复制序列的载体进行转化，以同时破坏必需基因的基因组拷贝并用载体引入补充的拷贝。
[0193]宿主细胞可能已能生产感兴趣的生物化合物。还可对宿主细胞提供具有编码参与生产感兴趣的生物化合物的多肽的重组的同源或异源多核苷酸构建体。
[0194]至少包含宿主细胞的必需基因和自主复制序列的载体可因此包含重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体编码参与合成感兴趣的生物化合物的化合物。还可在破坏必需基因之前或之后，和/或引入至少包含宿主细胞的必需基因和自主复制序列的载体之前或之后，使用单独的转化事件，在单独的载体上，将编码参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的所述重组多核苷酸构建体引入宿主细胞。优选地，编码参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的和包含所述重组多核苷酸构建体的载体是如本文前面“载体-宿主系统”部分定义的那些。
[0195]本文中使用培养时表示使用本领域中已知的方法，将微生物细胞在适于生产感兴趣的生物化合物的营养物培养基中培养。例如，可在合适的培养基中进行的实验室或工业发酵罐中并在允许生产感兴趣的化合物的条件下，通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括持续、分批、分批补料或固体状态发酵)，培养宿主细胞，并任选地将其分离。使用本领域中已知的程序(见，例如，Bennett, J.W.and LaSure, L., eds., More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991),在包含碳源和氮源和有机盐的合适的营养物培养基中进行培养。合适的培养基购自商业供应商或可使用公布的组成制备(例如`，在美国典型培养物收集处的目录中)。根据本发明的系统是足够稳定的和通用的，足够在工业发酵中典型地开发的各种培养基，包括非选择性、复合培养基上保持载体-宿主系统。如果感兴趣的化合物分泌进营养物培养基，化合物可直接分离自培养基。如果感兴趣的化合物不是分泌的，其可分离自细胞裂解产物。
[0196]可通过本领域中已知的方法，分离感兴趣的生物化合物。例如，可通过常规程序从营养物培养基中分离感兴趣的生物化合物，所述常规程序包括但不限于，离心、过滤、提取、 喷雾干燥、蒸发或沉淀。接着，可通过本领域中已知的多种程序进一步纯化分离的感兴趣的生物化合物，所述程序包括但不限于，色谱法(例如，离子交换、亲和性、疏水性、色谱聚焦和尺寸排阻)，电泳程序(例如，制备的等电子聚焦、差别性溶解度(例如，硫酸铵沉淀) 或提取物(见，例如，Protein Purification, J.-C.Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989)。在一些应用中，可使用没有充分从培养发酵液中分离的感兴趣的生物化合物；培养基与生物质的分离可以是充分的。[0197]用于筛选编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸的方法
[0198]本发明还涉及用于筛选编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸的方法，其包括:
[0199]a.提供可能含有编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸的多核苷酸文库，
[0200]b.提供包含载体的大量的个体宿主细胞，所述宿主细胞缺少必需基因，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，
[0201]c.筛选表达感兴趣的生物化合物的转化体。
[0202]鉴定步骤(C)中的包含编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸的经转化的宿主细胞之后，多核苷酸可任选地分离自鉴定过的宿主细胞。随后，分离的多核苷酸可转化进合适的宿主细胞，例如用于工业生产感兴趣的生物化合物。 [0203]可使用特别针对感兴趣的生物化合物的本领域中已知的检测方法，进行筛选。这些检测方法包括，但不限于使用特异性抗体、高效液相色谱、毛细管色谱、电泳、酶产物的形成或酶底物的消失。
[0204]宿主细胞、载体、必需基因和自主复制序列优选地是如本文前面“载体-宿主系统”部分定义的那些。
[0205]缺乏是如本文前面“载体-宿主系统”部分所定义的。
[0206]优选地，缺少必需基因的宿主细胞的缺乏程度是相对于不缺少必需基因的亲本细胞测量的。优选地，较之不缺少必需基因的亲本细胞，宿主细胞的缺乏缺乏程度:其中所述宿主细胞生产减少至少10%的由必需基因编码的产物和/或具有降低至少10%的的转录自必需基因的mRNA的表达水平和/或具有减少至少10%的由必需基因编码的产物的特异性 (蛋白)活性。更优选地，缺乏是至少20%，甚至更优选地至少30%，甚至更优选地至少40%， 甚至更优选地至少50%,甚至更优选地至少60%,甚至更优选地至少70%,甚至更优选地至少 75%，甚至更优选地至少80%，甚至更优选地至少85%，甚至更优选地至少90%，甚至更优选地至少95%，甚至更优选地至少96%，甚至更优选地至少97%，甚至更优选地至少98%，甚至更优选地至少99%，甚至更优选地至少99.5%，甚至更优选地至少99.9%和最优选地缺乏是完全的，即100%o
[0207]宿主细胞具有包含自主复制序列的载体的增加的稳定性。优选地，稳定性是相对于其中载体相同但是宿主不缺少必需基因的宿主细胞测量的。优选地，比较在有非选择性固体培养基的平板上的随后的孢子形成和单菌落分离周期中的载体丢失，来测定稳定性。 稳定性越高，载体从宿主细胞丢失前花费的时间越长，特别是在非选择性固体培养基，比如复合的或非限定性的培养基上时。在根据本发明的系统中，载体保持至少四个随后的孢子形成周期。优选地，载体保持至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个或至少十个随后的孢子形成周期。更优选地，载体保持至少15、至少20、至少25、至少30、至少40、至少50、至少60或至少70个随后的孢子形成周期。I如果载体包含非选择性颜色标记，比如 GFP或DsRed，宿主中存在载体可容易通过菌落中存在标记颜色而被观察到。
[0208]优选地，较之其中载体相同但是宿主细胞不缺少必需基因的宿主细胞，宿主细胞的稳定性增加至少两倍增加，更优选地至少三倍增加，更优选地至少五倍增加，更优选地至少十倍增加，更优选地至少二十倍增加，更优选地至少五十倍增加，更优选地至少一百倍增加，更优选地至少两-百倍增加，更优选地至少五百倍增加和最优选地至少一千倍增加。
[0209]优选地，如本文前面“载体-宿主系统”部分所述的，宿主细胞的同源重组(HR)效率增加，这优选地以诱导型方式进行。
[0210]优选地，感兴趣的生物化合物是本文前面“载体-宿主系统”部分所述的那些。
[0211]根据本文前面“载体-宿主系统”部分所述的方法，可得到缺少必需基因的宿主细胞。在一种实施方式中，用破坏构建体转化宿主细胞。这种破坏构建体优选地包含对应于野生型多核苷酸的多核苷酸，使得野生型多核苷酸被缺陷型多核苷酸，即不能生产(全功能) 蛋白质的多核苷酸替换。通过同源重组，缺陷型多核苷酸替换内源性多核苷酸。
[0212]在一种实施方式中，同时用破坏构建体和至少包含所述宿主细胞的必需基因和自主复制序列的载体进行转化，以同时破坏必需基因的基因组拷贝并用载体引入补充的拷贝。
[0213]优选地，转化是如本文前面所述进行的。
[0214]文库可编码对宿主细胞而言是天然的或异源的感兴趣的生物化合物。编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸可源自能生产感兴趣的生物化合物的任何生物体，包括多细胞生物和微生物，例如细菌和真菌。多核苷酸来源还可以是合成的，这表示文库可包含例如经密码子优化的编码相同多肽的变体或文库可包含通过本领域中已知的改组(shuffling)技术或定向进化技术获得的变体。
[0215]根据本发明的载体-宿主系统和宿主细胞可便利地用于生产感兴趣的生物化合物。
[0216]因此，本发明进一步涉及使用根据本发明的载体-宿主系统或宿主细胞用于生产感兴趣的生物化合物的用途。
[0217]优选地，载体-宿主系统和宿主细胞，是如本文前面“载体-宿主系统”和“宿主细胞”部分定义的那些。方法和宿主细胞、载体、感兴趣的生物化合物和其他期望的特性优选地是如本文前面“用于生产感兴趣的生物化合物的方法”部分定义的那些。
[0218]根据本发明的载体-宿主系统和宿主细胞可便利地用于筛选编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸。
[0219]因此，本发明进一步涉及根据本发明的载体-宿主系统或宿主细胞用于筛选编码感兴趣的化合物的多核苷酸的用途。
[0220]优选地，载体-宿主系统和宿主细胞，是如本文前面“载体-宿主系统”和“宿主细胞”部分定义的那些。优选地，方法和宿主细胞、载体、感兴趣的生物化合物、文库和其他期望的特性是如本文前面“用于筛选编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸的方法”部分定义的那些。
[0221]本文描述和限定的本发明不限于本文公开的【具体实施方式】的范围，因为这些实施方式意图作为本发明的若干方面的阐释。本发明的优选的方面的任何等同实施方式和/或其组合意图包括在本发明的范围内。当然，从前面的描述中，除了本发明展示和描述的那些之外的各种改进对本领域技术人员而言是明显的。这种改进也意图落入所附的权利要求的范围内。冲突时，以本发明的公开内容(包括定义)为准。
实施例
[0222]菌株
[0223]P.chrysogenum DS17690, (2008 年 4 月 I5 日保藏于 Centraalbureau voorSchimme I cultures, Utrecht,荷兰,保藏号为CBS122850),是高青霉素生产菌株。
[0224]P.chrysogenum DS54465,DS17690 的衍生物，其中 P.chrysogenum KU70 同源物已被缺失(Snoek 等人(2009) Fungal Genetics and Biology46, 418 - 426)。
[0225]P.chrysogenum DS58274, DS54465 的衍生物，携带失活的 niaD 基因座与 GFP.SKL
表达盒，使得其用作营养缺陷型标记以及转化对照二者。
[0226]P.chrysogenum DS61187，缺少NHEJ的广泛使用的实验室菌株Wis54_1255的衍生物。
[0227]A.niger WTl:该A.niger菌株是包含A.niger KU70同源物(称为hdfA)的基因缺失的CBS513.88菌株。缺失载体的构建和hdfA基因的基因缺失已在W005/095624中详细地描述过。已根据如EP0635574B1中描述的“MARKER-GENE FREE”方法，使用了 W005/095624 中所述的载体pDEL-HDFA。上文所述的程序产生了 hdfA缺陷型重组体A.niger CBS513.88 菌株，最终根本不具有外源DNA序列。就此而言，WTl具有增加的同源重组效率和因而的 NHR/HR 减小。A.niger 菌株 CBS513.88 在 1988 年 8 月 10 日保藏于 Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht,荷兰。
[0228]A.niger WT2是包含编码葡糖淀粉酶(glaA)的基因缺失的WTl菌株。WT2通过使用如EP0635574B1中描述的“MARKER-GENE FREE”方法构建。在这篇专利中，其详尽地描述了怎样缺失CBS513.88基因组中的glaA特异性DNA序列。程序产生了 MARKER-GENE FREE A glaA重组体A.niger CBS513.88菌株，所述菌株最终根本不具有异源DNA序列。
[0229]本文中使用的Rasamsonia emersonii (R.emersonii)菌株源自用作野生型菌株的 ATCC16479。ATCC16479 先前还被称为 Talaromyces emersonii 和 Penicillium geosmithia emersonii。当使用 Rasamsonia emersonii 名称时也表不 Talaromyces emersonii。 R.emersonii ATCC16479 的其他菌株名称是 CBS393.64、IF031232 和 MI116815。
[0230]Rasamsonia (Talaromyces) emersonii 菌株 TEC-142 于 2009 年 7 月 I 日保藏于 CENTRAAL BUREAU V00R SCHIMMELCULTURES, Uppsalalaan8, P.0.Box85167, NL-3508AD Utrecht,荷兰处，具有登录号CBS124902。TEC-142S是TEC-142的单个隔离群。
[0231]培养基
[0232](i)YGG 培养基含有 0.8%KC1、1.6% 葡萄糖、0.67%Difco 酵母氮基(Becton, Dickin son&C0.，Sparks, Md, USA)、0.15% 柠檬酸、0.6%K2HP04、0.2% 酵母提取物，pH6.2，添加 IOOU/ ml青霉素和100 V- g/ml链霉素(Gibco, Invitrogen, Breda,荷兰)。YGG-鹿糖培养基含有另外的34.2%的蔗糖。
[0233]P.chrysogenum原生质体和菌丝体在下述培养基上生长:
[0234](i)腐草霉素选择琼脂，含有:l%Difco酵母氮基、0.225%柠檬酸、0.9%K2HP04、0.1% 酵母提取物(Becton, Dickinson&C0.)、2%葡萄糖、28.7%鹿糖和2%琼脂,和lml/L的痕量元素溶液，pH7,补充有100U/ml青霉素、100 y g/ml链霉素和50 y g/ml腐草霉素(Invivogen, San Diego,美国)。
[0235](ii)氮源选择琼脂，含有:0.3%NaCl、0.05%MgS04 ? 7H20、0.001%FeS04 ? 7H20、1% 葡萄糖、IOmM磷酸钾缓冲液pH6.8和2%琼脂和lml/L的痕量元素溶液，并补充有0.1%乙酰胺和15mM CsCl2 (乙酰胺选择琼脂)>0.1%(NH4) 2S04 (铵选择平板)或0.l%NaN03 (硝酸盐选择平板)。为了原生质体再生,添加34.2%的蔗糖。[0236](iii)氟乙酰胺选择琼脂，含有:0.3%NaCl、0.05%MgS04 ? 7H20、0.001%FeS04 ? 7H20、 1%葡萄糖、0.1%氟乙酰胺、5mM尿素、IOmM磷酸钾缓冲液pH6.8和2%琼脂。
[0237](iv)氯酸盐选择琼脂，含有:0.3%NaCl、0.1%KH2P04、0.05%MgS04 ? 7H20、
0.001%FeS04 ? 7H20、1%葡萄糖、0.185%腺嘌呤1.25%KC103和2%琼脂，和lml/L的痕量元素溶液，pH6.5。为了原生质体再生，添加34.2%的蔗糖。
[0238](V)R琼脂，含有:0.52%v/v甘油、0.75%v/v甜菜糖蜜、0.5%酵母提取物、300mM NaCl.0.2m MgSO4.7H20、0.44mM KH2P04、3.3 y MNH4Fe (SO4) 2 ? 12H20、0.4 y M CuSO4 ? 5H20、
1.45mM CaSO4 ? 2H20和2%琼脂。需要的话，添加NaNO3至终浓度为0.1%。
[0239]A.nidulans FGSC A4孢子分离自R-琼脂平板，并在YGG培养基上培养。
[0240]PDA:Potato Dextrose Agar, Oxoid,非选择性培养基,根据供应商的说明书制备。
[0241]R.emersonii菌丝体在PDA或Rasamsonia琼脂培养基上生长。Rasamsonia琼脂培养基每升含有:15g的盐组分n0.3、30g的纤维素、7.5g的Bacto蛋白胨、15g的谷物粉、5g 的 KH2PO4Ug 的 CaCl2 ? 2H20、20g 的 Bacto 琼脂，pH6.0。盐组分 n0.3 与 W098/37179,表 I 的公开内容一致。从该表的组成中得到CaCl2 CH2Ol.0g/l、KCll.8g/L、柠檬酸IH2O0.45g/ 1^(螯合剂)。对于孢子分批制备，将来自菌种(stocks)的菌株在Rasamsonia琼脂培养基上于直径为IOcm的Petri皿中在40°C下培养5_7天。菌株菌种存储于_80°C下10%甘油中。
[0242]Escherichia coli DH5a用于克隆目的。细胞在37 °C下在补充有50 ii g/ml 卡那霉素、100 V- g/ml氨节西林、100 u g/ml羧节青霉素或15 u g/ml氯霉素的LB培养基 (l%Bacto 胰蛋白胨(Becton，Dickinson&C0.)、0.5% 酵母提取物和 0.5%NaCl)中生长。
[0243]质粒
[0244]pDONR P4_PlR、 pD0NR221 和 pDONR P2R-P3 是多位点 Gateway 载体；KanR CmE 来自 Invitrogen,美国。
[0245]pDEST R4-R3 是多位点 Gateway 载体；AmpR CmR 来自 Invitrogen,美国。
[0246]pENTR221-niaDF1-amdS_niaDF2 是有[niaDF1_PAnid.J5pdA-Anid ? amdS_niaDF2]盒的 PD0NR221衍生物；KanR Anid ? amdS实验室收藏
[0247]pENTR41-niaDL 是具有 Pchr ? niaD 的 5 引导-区的 pDONR P4-PlR;KanE;DSM 实验
室收藏
[0248]pENTR23-niaDE 是具有 Pchr ? niaD 的 3 引导-区的 pDONR P2R-P3; KanE DSM 实验室收藏
[0249]pAMPF21 是有 AMAl 区的 P.chrysogenum/E.coli 穿梭载体；CmRPhleoR ；Fierro 等人,1996Curr Genet.29(5):482-9。
[0250]pAMPF21*是在AMAl区中缺少特异性限制性位点(Hindlll，Asp718i)的 pAMPF2 l;CmE; DSM 实验室收藏。
[0251]pBBK-001 是含有[Ppdir.pcbc-DsRed.SKL-Tpchr.penDE]盒的 E.coli 质粒；AmpK ;Kiel 等人，2009Funct Integr Genomics.9 (2):167-84。
[0252]pBBK-007 是含有[Ptoid.gpdA-DsRed SKL-Tpchr.penDE]盒的质粒；AmpK;Meijer 等人， 201OAppI Environ Microbiol.76(17):5702-9。
[0253]pENTR221-stuffer 是具有 P.chrysogenum ATG15 基因的一部分的 pD0NR221，所述P.chrysogenum ATG15基因侧翼为合适的限制性位点；KanR;实验室收藏
[0254]pUG34-DsRed.SKL 是 E.coli/S.cerevisiae 穿梭载体，其含有 Scer ? HIS3 营养缺陷型标记、ARS/CEN复制子和在Scer ? MET25启动子控制下的DsRed.SKL基因(Kuravi et al, 2006J Cell Sc1.119 (19):3994-4001)。
[0255]标准重组DNA 操作根据 Sambrook 等人(1989Molecular cloning, a Laboratory manual.Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)进行。 P.chrysogenum原生质体的制备及其转化根据既定的方案(Cantoral et al., 1987Bio/ Technol.5, 494-497)进行。总 DNA 基本上如 Kolar 等人(1988) Gene.1988; 62 (I):127-34 所述分离。简而言之，原生质体在TES/SDS缓冲液(IOmM Tris-HCl pH8.0,50mM EDTA, 150mM NaCl，1%SDS)中裂解，随后进行苯酚和氯仿提取以及乙醇沉淀。将混合的DNA用70%乙醇洗涤，风干，溶于 TltlE1 (IOmM Tris-HCl pH7.41mM EDTA)中并用 RNAse (10 y g/ml)处理。根据 Chow 和 Kafer (见 http://www.fgsc.net/fgn/chow, html)分离 A.nidulans 基因组 DNA。
[0256]使用DNeasy植物迷你试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)，从在YGG培养基中在42°C、 250rpm下培养16小时的培养物中分离R.emersonii基因组DNA。
[0257]按照供应商的说明书，使用限制性酶和其他DNA修饰酶(Fermentas Gmbh, St.Leon-Rot,德国；Roche Diagnostics, Mannheim,德国))。为了克隆目的使用 Phusion 聚合酶(Fermentas Gmbh)进行聚合酶链式反应(PCR),对菌落PCR或转化体使用Phire聚合酶(Fermentas Gmbh)进行聚合酶链式反应(PCR)。根据多位点Gateway三-片段载体构建试剂盒(Invitrogen,美国)的说明书，进行DNA重组反应。使用DIG标记和检测系统(RocheDiagnostics),用 Hybond N+ 膜(G.E.Healthcare Limited, Little Chalfont, 英国)、ECL Gold杂交缓冲液(GE Healthcare Limited)和用地高辛标记的DNA片段进行 Southern印迹分析。
[0258]P.chrysogenum、A.nidulans 和 A.niger DNA 序列得自 National Center for Biotechnology Information (NCBI)网站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)，Blast 分析也在此进行。T.reesei cbhl 序列取自 DOE Joint Genome Institute 的网站(http:// www.jg1.doe.gov/)。 使用 Clone Manager5 软件(Scientific and Educational Software, Durham),进行DNA序列的电 子杂交分析和载体图谱的构建。使用Clustal_ X (Thompson 等人，1997Nucleic Acids Res25, 4876-82)进行氨基酸序列比对并用 GeneDoc (http://www.psc.edu/biomed/genedoc)展不。
[0259]Cbhl活性的定性检验:(i)平板检验。用A tif35::niaDF1-amdS_niaDF2缺失盒和pDSM-JAK-120共转化P.chysogenum DS54465的原生质体并在乙酰胺平板上选择。为了测定哪个转化体已接受了质粒pDSM-JAK-120，将随机转化体的菌丝体放在含有100 u g/ ml4_甲基伞形酮P-D纤维二糖糖苷(MUC, Sigma, Saint Louis, Missouri,美国)的乙酰胺平板上。为了抑制内源性纤维二糖水解酶活性的表达，也将平板补充有34.2%的蔗糖。在 25°C 下生长 3-5 天后，使用 Gel Doc? XR+Molecular Manager (Bio-Rad, Hercules, CA,美国)使平板在UV光下显影。能将MUC转化为荧光物质4-甲基伞形酮的转化体显示了清楚的荧光晕状物。它们还通过菌落PCR，显示出具有质粒pDSM-JAK-120。
[0260](ii)液体检验。将稳定保持质粒pDSM-JAK-120的P.chrysogenum A tif35转化体的孢子于25°C下在补充有34.2%蔗糖的YGG培养基上孵育2天，以抑制内源性纤维二糖水解酶活性的表达。随后，将细胞富集，并将多个等分试样的已用培养基在50mM乙酸钠缓冲液PH5.0,300 u g/mlMUC中在25°C下孵育l_16h。接着，通过添加I体积的10%Na2C03 来停止反应。最后，使用Gel Doc? XR+Molecular Imager使反应混合物在UV光下显影。 含有显著量的Cbhl活性的培养基显示了清楚的荧光。作为对照，使用了来自相同培养的 P.chrysogenum DS54465细胞的已用培养基,其没有显示显著的活性。
[0261]通用技术
[0262]如前面所述(Kiel等人,2009)的,制备Penicillium chrysogenum细胞的粗制提取物。使用牛血清白蛋白作为标准物，使用RC/DC蛋白检验(Bio-Rad，美国)或Bio-Rad蛋白检验系统，测定蛋白浓度。根据既定的方案，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western 印迹。
[0263]根据标准程序，例如如EP0635574B中描述的，在乙酰胺培养基上选择 Aspergillus niger转化体并纯化菌落。破坏载体和用于基因过表达的表达载体、转化、使用标记和培养基的通用设计的例子可在W02005/095624和EP0635574B中找到。
[0264]根据如W02011/054899中描述的程序，在腐草霉素培养基上选择Rasamsonia emersonii转化体并对菌落进行纯化和测试。
[0265]根据已知的原理设计基因替换载体，并根据常规克隆程序构建基因替换载体。这些载体大体上包含各自ORF序列的大约1- 2kb侧翼区，以靶向在预定的基因座处进行同源重组。它们可含有用于转化的A.nidulans双向amdS选择标记。在本文所有例子中用于基因替换的方法使用线性DNA，所述线性DNA通过双交换在侧翼序列的同源基因座处整合进基因组，因而通过amdS基因置换将要缺失的基因。amdS标记的丢失可通过在氟-乙酰胺培养基上铺平板来选择。
[0266]菌落和细胞中的荧光分析。使用Night Sea Blue Star高强度LED闪光灯和VGl滤光玻璃(Tektite Industries Inc., Trenton, N.J., USA;http://www.nightsea.com/gfp.htm)，鉴定显示DsRed荧光的菌落。尽管这种灯主要用于GFP荧光，但当荧光强时，其还用于 DsRed。
[0267]使用Zeiss Axioskop显微镜(Carl Zeiss, Gdttingen，德国)，进行突光显微镜研
究。`
[0268]实施例1 (比较实施例)
[0269]在该比较实施例中,研究了 AMAl质粒在P.chrysogenum NHEJ-缺陷型细胞中的稳定性。
[0270]为了产生具有组成型表达的DsRed.SKL基因的含有AMAl的对照质粒，用 EcoRV+Notl 从质粒 pBBK-007 中分离包含[PMd.^^-DsRed.SKL-Tpchr.penDE]盒的 2108bp DNA 片段并克隆在质粒PAMPF21*的BglII (通过Klenow处理成平末端)和NotI位点之间，产生质粒 pDSM-JAK-109。
[0271]用质粒pDSM-JAK-109 (图1.)转化 P.chrysogenum DS54465 原生质体，所述质粒pDSM-JAK-109含有显性腐草霉素抗性标记和组成型表达的DsRed.SKL蛋白(SEQ ID.N0.35)，所述DsRed.SKL蛋白可容易地通过荧光技术显现。DsRed.SKL ORF在SEQ ID NO:34中示出。用高强度LED闪光灯照亮后，所有的Phleo+转化体展示了红色的荧光。但是，当使菌丝体在非选择R-琼脂平板上形成孢子且将产生的孢子在非选择培养基上铺板时，产生的大多数菌落已丢失了质粒(>90%的没有荧光的“白色”菌落)。这证实了 AMAl质粒在P.chrysogenum NHEJ-缺陷型细胞中的不稳定性质。
[0272]在下述实施例中，发明人将展示，含有必需基因作为选择标记的复制载体(比如 AMAl质粒)在缺乏这种基因的基因组拷贝的宿主中是完全稳定的。为此，一种方式是共转化，在此期间该必需基因被缺失，而同时其缺失的致死效应通过在复制载体上存在该必需基因来回补。
[0273]实施例2制备有诱导型启动子的表达构建体pDSM-JAK-105。
[0274]发明人选择P.chrysogenum tif35基因(Pc22gl9890)作为将用作新颖载体的标记的推定必需基因，所述基因编码翻译起始因子3的核心复合体的g亚基(eIF3g;Phan et al., 1998Mol Cell Biol.18 (8):4935-46)。Pchr ? tif35 基因、ORF、cDNA 和蛋白分别在 SEQ ID N0.37、38、39和40中示出。使用Gateway技术，如下构建允许产生下述菌株的质粒 pDSM-JAK-105,所述菌株中P.chrysogenum tif35处于诱导型niiA启动子的控制下。 [0275]使用菌株DS17690的基因组DNA作为模板，用下述寡核苷酸扩增包含完整的 P.chrysogenum niaD 基因和 niiA 启动子区(在 Genbank AM920428.1 中为 nt2778005 至 2781898)的 3951bp DNA 片段:
[0276]DSM-JAK-10I5’ -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGATCGAAGGAAGCAGTCC CTACACTC-3’ (SEQ ID NO:1)
[0277]DSM-JAK-102 5’ -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGAGACTGAACAATGTGAAGAC GGAG-3’ (SEQ ID n0.2)，并重组进载体 pD0NR221 中，产生质粒 pDSM-JAK-101。
[0278]使用P.chrysogenum DS54465DNA作为模板，用下述寡核苷酸扩增包含 P.chrysogenum tif35 编码序列的约 1.5kb 上游区(CDS;在 Genbank AM920437.1 中为 nt4686813 至 4688338)的 1576bp DNA 片段:
[0279]DSM-JAK-103a 5’ -GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGAGCATATTCTTTCACTGTTGCAGAT CTGC-3’ (SEQ ID N0.3)
[0280]DSM-JAK-104a5，-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGCTATCCCATCCAGATGAGTGCTTCG-3， (SEQ ID N0.4)，并重组进载体 pDONR P4-P1R 中，产生质粒 pDSM_JAK_102。
[0281]使用P.chrysogenum DS54465DNA作为模板，用下述寡核苷酸扩增包含 P.chrysogenum tif35CDS 和终止子区(在 Genbank AM920437.1 中为 nt4689913 至 4691355)的 1493bp DNA 片段:
[0282]DSM-JAK-1055’ -GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGACACCATGTCTCCAACCGGGA AGTGAG-3’ (SEQ ID N0.5)
[0283]DSM-JAK-106 5’ -GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGGGTGCTTGGGATGTTCCATGGTAGC -3’ (SEQ ID N0.6)，并重组进载体 pDONR P2R-P3 中，产生质粒 pDSM_JAK_103。
[0284]质粒pDSM-JAK-101、pDSM-JAK-102 和 pDSM_JAK_103 与载体 pDEST R4-R3 重组，产生 pDSM-JAK-105 (图? 2)，所述 pDSM-JAK-105 允许产生其中 P.chrysogenum tif35 位于诱导型niiA启动子控制下的菌株。在该构建体中，编码硝酸还原酶的niaD基因作为选择标记起作用。
[0285]实施例3构建有硝酸盐诱导型tif35基因的P.chrysogenum菌株。
[0286]用AatII将实施例2的质粒pDSM-JAK-105在载体区线性化并转化进P.chrysogenum DS58274的原生质体中。在该菌株中，失活的niaD基因座携带允许将其用作营养缺陷型标记以及转化对照二者的GFP.SKL表达盒。使用荧光显微镜，发明人观察到， 在分析的52个硝酸盐原养型转化体中，44个保留了 GFP荧光。使用下述寡核苷酸进行菌落 PCR:
[0287]DSM-JAK-1095，-CAGTTTACACTCAACCCCAATCCAG-3’ (SEQ ID N0.7)
[0288]3-引导-niaD-正向 5’ -AGGTTGGTGGAGAAGCCATTAG-3’ (SEQ ID N0.8)，
[0289]显示，它们中至少一半携带在tif35基因座处正确重组的PniiA_tif35基因座。鉴定了含有[PniiA_tif35]的多个独立的转化体，通过孢子形成进行纯化并进行NO3+选择和进一步的分析。在补充有硝酸盐的R琼脂平板上产生分生孢子，并允许分生孢子在含有铵或硝酸盐作为唯一氮源的平板上萌发。在铵平板上完全没有孢子萌发，但是在硝酸盐平板上是正常的。这暗示Pchr ? tif35的确是必需基因。
[0290]实施例4 构建 P.chrysogenum tif35 缺失盒。
[0291]为了缺失基因组的P.chrysogenum tif35基因拷贝，通过Gateway技术构建质粒 pDSM-JAK-106 (图3)。使用P.chrysogenum DS5446OTNA作为模板,用下述寡核苷酸扩增包含来自 P.chrysogenum tif35 终止子的下游区(在 Genbank AM920437.1 中为 nt4691355 至 4692956)的 1654bp DNA 片段:
[0292]DSM-JAK-107 5’ -GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGATGGGAAACTAACCACGTGCTTGTA CG-3’ (SEQ ID N0.9)
[0293]DSM-JAK-108 5’ -GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGTTCACCCTGTCTCGACTTCCTT GTC-3，(SEQ ID N0.10)，重组进载体 pDONR P2R-P3 中，产生质粒 pDSM-JAK-104。质粒 pDSM-JAK-102，pENTR221-niaDF1-amdS-niaDF2 和 pDSM-JAK-104 与载体 pDESTR4_R3 重组，产生质粒 pDSM-JAK-106 (图 3)。
[0294]实施例 5构建备选的P.chrysogenum tif35缺失盒。
[0295]为了更容易地从载体DNA中分离A tif35盒，构建具有额外的ApaI位点的来自实施例4的质粒pDSM-JAK-106的衍生物。就该质粒的构建而言，使用P.chrysogenum DS5446OTNA作为模板,用下述寡核苷酸扩增包含来自P.chrysogenum tif35终止子的下游区(在 Genbank AM920437.1 中为 nt4691355 至 4692956)的 1660bp DNA 片段:
[0296]DSM-JAK-107 5’ -GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGATGGGAAACTAACCACGTGCTTGT ACG-3’ (SEQ ID N0.9)
[0297]DSM-JAK-123 5’ -GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGTGGGCCCTCACCCTGTCTCGACT TCCTTGTC-3’ (SEQ ID N0.11)，重组进载体 pDONR P2R-P3，产生质粒 pDSM_JAK_121。质粒 pDSM-JAK-102、pENTR221-niaDF1-amdS-niaDF2 和 pDSM-JAK-121 与载体 pDEST R4-R3 重组， 产生质粒 pDSM-JAK-122。
[0298]实施例6构建含有P.chrysogenum tif35和DsRed.SKL标记的AMAl质粒 pDSM-JAK-108。
[0299]如下构建含有P.chrysogenum tif35 的 AMAl 质粒。
[0300]使用来自A.nidulans FGSC A4 (ATCC38163)的基因组DNA作为模板，用下述寡核苷酸扩增包含编码核糖体蛋白S8的Aspergillus nidulans AN0465基因的组成型启动子 (在 Genbank BNOO1308 中为 nt3414332 至 3415681)的 1368bp DNA 片段:[0301]DSM-JAK-201 5’ -AGAGGTACCGAGTTATAGACGGTCCGGCATAGG -3’ (SEQ ID.N0.12)。
[0302]DSM-JAK-202 5，-AGAGGATCCGTTTGCTGTCTATGTGGGGGACTG-3，(SEQ ID.N0.13)。 用Asp718i+BamHI消化PCR片段并克隆在质粒pBBK-001的Asp718i和BamHI位点之间，因而替换P.chrysogenum pcbC启动子。产生的质粒命名为pDSM_JAK_201。
[0303]使用A.nidulans FGSC A4DNA作为模板，用下述寡核苷酸扩增包含编码Y肌动蛋白的 A.nidulans act (AN6542)基因的终止子(在 Genbank BNOO1301 中为 nt2366704 至 2365833n)的 886bp DNA 片段:
[0304]DSM-JAK-203 5，-GGGGTGCTTCTAAGGTATGAGTCGCAA-3’ (SEQ ID.N0.14)。
[0305]DSM-JAK-204 5’ -AGAACGCGTTAACGCAGGGTTTGAGAACTCCGATC -3’ (SEQ ID.N0.15)。
[0306]用MluI消化PCR片段并克隆在质粒pDSM-JAK-201的SmaI和MluI位点之间，因而替换P.chrysogenum penDE终止子。产生的质粒命名为pDSM-JAK-202。
[0307]用HpaI 和 KpnI 从质粒 pDSM-JAK-202 中分离含有[PANQ465-DsRed.SKL-TAnid.act] 表达盒的2971bp片段并克隆进用HindIII (通过Klenow处理成平末端)+KpnI消化的质粒PAMPF21* (通过在AMAl区去除特异性限制性位点(Hindlll，Asp718i)而修饰的质粒 pAMPFf21的衍生物)，因而产生质粒pDSM-JAK-107。
[0308]使用基因组P.chrysogenum DS5446OTNA,用下述寡核苷酸扩增包含tif35编码序列以及其启动子和终止子区(在Genbank AM920 437.1中为nt4688344至4691352)的 3036bp DNA 片段:
[0309]DSM-JAK-1115’ -AGAGGATCCGAGGAAGACGTGATCAGAGTAAGC-3’ (SEQ ID.N0.16)。
[0310]DSM-JAK-112
[0311]5’-GAAAGCGGCCGCGGTACCGTGCTTGGGATGTTCCATGGTAGC-3’ (SEQ ID.N0.17)。
[0312]用NotI and BamHI 消化 PCR 片段，并在质粒 pDSM_JAK_107 的 NotI 和 BglII 位点之间克隆，产生质粒pDSM-JAK-108 (图4)。
[0313]以这种方式，构建了 E.coli/P.chrysogenum穿梭载体，其含有Pchr ? tif35表达盒、用于染色体外复制的AMAl复制子和容易通过荧光技术可见的组成型表达的DsRed.SKL 基因。在质粒 pDSM-JAK-108 上存在的 UsRed.SKL_TAnid.act]和 Pchr ? tif35 表达盒分别在SEQ ID N0.36和37中示出。因为在该质粒上的DsRED.SKL盒的表达信号源自 A.nidulans基因组，因此质粒pDSM-JAK-108与除了 tif35之外的P.chrysogenum菌株的基因组不具有显著的相似性，也与包括Aspergillus niger的大多数其他丝状真菌的基因组不具有显著的相似性。
[0314]实施例7P.chrysogenum中的稳定的载体宿主系统
[0315]将环状形式的质粒pDSM-JAK-108与P.chrysogenum A tif 35盒共转化进 P.chrysogenum DS54465 或 DS61187 的原生质体中。A tif35 盒通过 ApaI+部分 BclI 消化从pDSM-JAK-106 (实施例3)中释放出(产生9119bp DNA片段)或通过ApaI消化从 pDSM-JAK-122 (实施例4)中释放出(产生9224bpDNA片段)，并从琼脂凝胶中纯化。
[0316]在乙酰胺平板上选择转化体。鉴定出高比率(30-50%)的包含DsRed.SKL表达质粒的红色荧光菌落。如使用菌落PCR (使用扩增含有[P-g-DsRed.SKL-1^d.d]表达盒的 2971bp 片段(SEQ ID.N0.36)的寡核苷酸DSM-JAK-201 (SEQ ID.N0.12)和 DSM-JAK-204 (SEQ ID.N0.15))、通过Southern印迹并通过再转化进E.coliDH5 a中随后进行广泛的限制性分析所表明的，在大多数情况下，质粒pDSM-JAK-108以完全完整的形式存在。发明人观察到， 红色荧光表型在非选择培养基上的持续菌丝体生长期间完全是稳定的，并且在非选择培养基上分生孢子形成并萌发至少十个周期后也是完全稳定的。通过使用氟乙酰胺平板对复制滑动事件(replication slippage event)选择来消除菌株的amdS标记，也不会影响质粒的分离和重组稳定性。这暗示在P.chrysogenum细胞中存在完全稳定的复制型质粒。
[0317]使用下述寡核苷酸组合，通过菌落PCR来证明转化体中的tif35基因组拷贝的缺失:
[0318]DSM-JAK-109:5，-CAGTTTACACTCAACCCCAATCCAG-3，(SEQ ID.N0.7) +
[0319]5-引导-niaD-反向:5’ -CACGTAGCATACAACCGTGTCG-3’ (SEQ ID.N0.18)(预期的 1647bp)
[0320]和
[0321 ] 3-引导-niaD-正向 5 ’ -AGGTTGGTGGAGAAGCCATTAG- ‘ 3 (SEQ ID.N0.8) +
[0322]DSM-JAK-1105 ’ -GATGCCTTGTGGGAAATTAACCAG- ‘ 3 (SEQ ID.N0.19)(预期的 1776bp)
[0323]它们应该在tif35基因座处正确重组后仅扩增出所示大小的DNA片段。鉴定出多个独立的PCR阳性转化体，通过孢子形成并在乙酰胺选择平板上选择单个孢子来纯化。 Southern印迹分析显示了 tif35的正确缺失。鉴定出了携带有回补的tif35基因的复制型质粒的多个独立的Atif35菌株。
[0324]实施例8构建没有标记的菌株
[0325]在Atif35 菌株中，Anid ? amdS 标记的侧翼是包含 P.chrysogenum niaD(Fl and F2)的一部分的1.5kb重复区，允许其通过复制滑动而丢失标记。为了获得无标记的菌株， 将四个独立地分离的A tif35菌株放在孢子形成琼脂上并在氟乙酰胺平板上完全地划线成单个孢子。从每个平板中选择两个独立的菌落，通过另一轮孢子形成和在氟乙酰胺平板上再次选择单个孢子来纯化。Southern印迹分析显示了从tif35基因座中正确去除amdS
[0326]实施例9携带tif35表达盒的AMAl质粒pDSM-JAK-108的稳定性取决于tif35基因的基因组拷贝的缺失。
[0327]为了证明质粒pDSM-JAK-108的稳定性是由tif35基因的基因组拷贝缺失决定的而不是由与基因组重组引起的，将P.chrysogenum tif35的额外的拷贝放置于niaD基因座处。为此，通过Gateway技术如下构建质粒pDSM_JAK_116:
[0328]使用P.chrysogenum DS54465基因组DNA作为模板,用下述寡核苷酸扩增包含 tif35CDS以及其启动子和终止子区(在Genbank AM920437.1中为nt4688343至4691352) 的 3070bp DNA 片段:
[0329]DSM-JAK-1195，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGAGAGGAAGACGTGATCAGAGTAAGC -3’ (SEQ ID.N0.20)
[0330]DSM-JAK-1205，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGTGCTTGGGATGTTCCATGGTAGC-3’ (SEQ ID.N0.21)，并重组进质粒 pD0NR221，产生质粒 pDSM-JAK-115。[0331]质粒pENTR41-niaDL、pDSM_JAK_115 和 pENTR23_niaDK 与载体 pDEST R4-R3 重组， 产生质粒 pDSM-JAK-116 (图 5)。
[0332]通过Notl+Kpnl 消化，[niaDL_tif35-niaDj 整合盒从质粒 pDSM-JAK-116 中释放， 从琼脂凝胶中纯化(作为6778bp DNA片段)，并转化进pDSM-JAK-108 ( A tif35::niaDF1-a mdS-niaDF2)的两个独立地分离的菌株的原生质体中。在氯酸盐平板上选择转化体，随后使用寡核苷酸
[0333]DSM-JAK-1265’-GTTCTTGAATAGCCGAGGACTCAC-3，(SEQ ID.N0.22)
[0334]DSM-JAK-127 ‘5，-CATCCTCCCCTTCTGTTGGCATAG-3’(SEQ ID.N0.23)
[0335]进行菌落PCR，所述菌落PCR应该在niaD基因座处正确整合tif 35基因后仅扩增出1923bp的DNA片段。鉴定出多个独立的PCR阳性转化体。所有这些转化体已丢失红色荧光表型，这表示复制型质粒pDSM-JAK-108的丢失。通过Southern印迹进一步分析八个转化体，并证明了在niaD基因座处的tif35正确整合、存在原始的 Atif35::niaDF1-amdS-niaDF2基因座且不存在复制型质粒pDSM-JAK-108。因而，质粒 pDSM-JAK-108在缺少tif35的菌株是高稳定的，但是当染色体tif35表达恢复时，其在有丝分裂方面再次变得不稳定，这证实了其染色体外性质。
[0336]实施例10 表达 Trichoderma reesei cbhl 基因和 P.chrysogenum tif35 基因的含有AMAl的质粒的构建。
[0337]为了证明新开发的稳定的宿主/载体系统可用于生物技术目的，发明人从携带 Pchr *tif35作为选择标记的复制型质粒表达了 Trichoderma reesei cbhl基因,其编码分泌型纤维二糖水解酶。如下构建侧翼有非同源A.nidulans表达信号的包含密码子对优化的T.reesei cbhl基因的表达盒。
[0338]使用A.nidulans FGSC A4基因组DNA作为模板，用下述寡核苷酸扩增包编码翻译延伸因子a的A.nidulans tef基因(AN4218)的组成型启动子(在Genbank BN001302.1 中为 ntl654144 至 1655266)的 1157bp DNA 片段:
[0339]DSM-JAK-205 5’ -AGAAAGCTTGGTACCGTTGCACCAATCGCCGTTTAGG -3， (SEQ ID.N0.24)
[0340]DSM-JAK-2065，`-AGAAGATCTGTCGACGAATTCGGTGAAGGTTGTGTTATG nTTGTGG-3’ (SEQ ID.N0.25)。用 Hindlll+Bglll 消化PCR片段并克隆在质粒pENTR221_填充序列的HindIII和BglII位点之间，产生质粒pDSM-JAK-203。
[0341]使用A.nidulans FGSC A4DNA作为模板，用下述寡核苷酸扩增包含编码邻氨基苯甲酸合酶组分2的A.nidulans trpC基因(AN0648)的终止子(在Genbank BN001308.1中为 nt2848474 至 2849165)的 705bp DNA 片段:
[0342]DSM-JAK-210 5’-AGAAGATCTGATCGTTGGTGTCGATGTCAGCTC-3’ (SEQ ID.N0.26)
[0343]DSM-JAK-211 5，-GGGGTACACAGTACACGAGGACTTCTAG-3’ (SEQ ID.N0.27)。用 BglII消化PCR片段并克隆在质粒pDSM-JAK-203的BglII和SmaI位点之间，产生质粒 pDSM-JAK-206 (图 6)。
[0344]野生型T.reesei cbhIcDNA (SEQ ID.N0.28)获得自 DOE Joint Genome Institute 的网站并针对在P.chrysogenum和A.niger中的表达进行优化。
[0345]在GeneArt AG (Regensburg,德国)处合成包含密码子对优化的Tree ? cbhIcDNA序列的1583bp DNA片段，用Sfil消化并克隆进用Sfil线性化的载体pMK-RQ (Gene Art) 中。产生的质粒命名为pDSM-JAK-117(图7)。
[0346]用EcoRI+BamHI，从 pDSM-JAK-117 中分离包含密码子对优化的 Tree ? cbhIcDNA 序列的1564bp DNA片段，并克隆在质粒pDSM-JAK-206的EcoRI和BglII位点之间，产生 pDSM-JAK-118。
[0347]用KpnI+Smal,从 pDSM-JAK-118 中分离包含 PAnid.tef_Tree ? cbhlopt-TAnid.trpC 表达盒的3387bp片段，并克隆在质粒pAMPF21*的KpnI和HindIII (通过Klenow处理成平末端)位点之间，产生质粒pDSM-JAK-119。 [0348]使用基因组P.chrysogenum DS54465DNA,用寡核苷酸 DSM-JAK-111 (SEQ ID.N0.16)和DSM-JAK-112 (SEQ ID.N0.17)扩增包含tif35编码序列以及其启动子和终止子区(在 Genbank AM920437.1 中为 nt4688344 至 4691352)的 3036bp DNA 片段。用 NotI 和BamHI消化PCR片段并克隆在质粒pDSM_JAK_119的NotI和BglII位点之间，产生质粒 pDSM-JAK-120(图 8)。
[0349]实施例11从P.chrysogenum中稳定的AMAl-质粒中生产异源蛋白。
[0350]将质粒pDSM-JAK-120以环状形式和来自pDSM-JAK-122 (实施例5)的P.chry sogenum A tif35::niaDF1-amdS_niaDF2 盒共转化进 P.chrysogenum DS54465 的原生质体中。在乙酰胺平板上选择转化体。使用扩增[PAnid.tef_Tree ? Cbhrpt-TAnid.tapC]盒的寡核苷酸 DSM-JAK-205 (SEQ ID.N0.24)和 DSM-JAK-211 (SEQ ID.N0.27)，通过菌落 PCR，以高频率(30-40%)鉴定出包含Tree ? cbhl°pt表达质粒的多个独立的转化体。进一步地，在补充有4-甲基伞形酮3-D-纤维二糖苷(MUC)的乙酰胺选择平板上分析这些菌落的活性 Tree ? cbhl°pt酶的生产。如通过质谱法(Mass Spec)和活性测量测定的,含有质粒的转化体的确分泌纤维二糖水解酶。如下证实转化体的稳定性:在非选择性R-琼脂平板上至少四个周期的成功的孢子形成/萌发和随后单个孢子在乙酰胺平板上形成菌落，这是一种不针对质粒进行选择的程序。
[0351]实施例12A.niger中的AMAl质粒稳定化。
[0352]将在前述实施例中用于转化Penicillium的相同的AMAl质粒随后用来在生物技术上重要的丝状真菌A.niger中测试本发明的系统。首先,通过比对(Anl6g05260)鉴定 A.niger tif35 基因。Anig ? tif35 基因、ORF、cDNA 和蛋白质分别在 SEQ ID N0.29,30,31 和32中示出。通过在Anig *tif35的5’和3’侧翼区之间克隆从A.nidulans gpdA启动子表达的功能性amdS盒来构建Anig *tif35::Anid ^amdS缺失盒(SEQ ID N0.33),其中所述功能性amdS盒包含A.nidulans amdS ORF和终止子。为此，使用引物从WT2的基因组DNA 中通过PCR扩增侧翼区，所述引物包含特有的限制性位点(NotUAscI和Fsel，如图9中所示的)以促使克隆进合适的E.coli载体中。接着，根据常规程序用含有DsRed.SKL标记和 Pchr *tif35 同源物的 AMAl 质粒 pDSM-JAK-108 (图 4)以及含有 Anig *tif35::Anid.amdS 缺失盒的线性NotI片段转化A.niger菌株WT2。通过双同源重组的正确整合会导致 Anig ^tifSSORF(包括其启动子的一部分)被amdS置换。通过在乙酰胺培养基上选择获得大约350个转化体，并且当用蓝光照射时约90%是红色的。未转化的WT2的菌落不显示红色，而是具有正常的“白色”的颜色。对40个红色转化体的一个亚组详细检查。
[0353]如下对这些转化体进行菌落纯化:在非选择性(PDA)培养基(Potato Dextrose琼月旨，Oxoid)上培养，之后将孢子在PDA平板上再划线，以获得单个菌落。来自每一转化体的实际上所有单个菌落隔离群保持了红色。甚至如上所述的在PDA培养基上五个随后的孢子形成和单菌落分离周期之后，红色继续存在。这显示，即使在非选择性培养基上延长的培养之后，DsRed.SKL标记仍稳定地存在。在这种情况下，发明人对10个随后的孢子形成和单菌落分离周期进行测试。PCR诊断证实了，在所有测试的40个转化体中，amdS盒置换了基因组Anig ? tif35。用来自这些相同转化体的总DNA进行的Southern印记和E.coli转化证实存在完整的附加体pDSM-JAK-108。这显示，即使在非选择性培养基上延长的培养之后， 质粒pDSM-JAK-108仍稳定地存在。这些数据暗示，质粒pDSM-JAK-108是用于构建可在多种丝状子囊菌中稳定保持的多目的载体的合适基础。
[0354]实施例13鉴定Rasamsonia emersonii的ReKu80基因并构建缺失载体。
[0355]对Rasamsonia emersonii菌株CBS393.64的基因组DNA测序并分析。鉴定所翻译的蛋白质被注解为已知的ReKu80基因的同源物的基因。
[0356]R.emersonii ReKu80基因序列(包含开放阅读框(ORF)(有内含子)的基因组序列和大约2500bp的5’和3’侧翼区)、cDNA序列和蛋白序列分别在SEQ ID NOs: 41至43中示出。根据常规克隆程序，构建ReKu80的两个替换载体，pEBAlOOl和pEBA1002(见图10和 11)。两个载体的插入片段可一起用在所谓的“双向基因-靶向”方法(Nielsen等人，2006， 43:54-64)中。该方法使用重叠的选择标记的两个非功能性DNA片段(也见关于双向方法的进一步详细内容的W02008113847)以及基因-靶向序列。正确同源重组后，选择标记通过在同源目标基因座处整合变得有功能。如W02008113847中描述的，设计缺失载体pEBAlOOl 和pEBA1002，以能提供用于双向基因-靶向的两个重叠的DNA分子。
[0357]pEBAlOOl载体包含用于在ReKu80基因座中靶向的ReKu800RF的2500bp5’侧翼区、lox66位点和通过A.nidulans gpdA启动子驱动的ble编码区的5’部分(图10)。 pEBA1002载体包含ble编码区的3’部分、A.nidulans trpC终止子、lox71位点和用于在 ReKu80基因座中靶向的ReKu800RF的2500bp3’侧翼区(图11)。
[0358]实施例14克隆用于瞬时表达cre重组酶的pEBA513。
[0359]通过DNA2.0 (Menlo Park，美国)构建pEBA513，所述pEBA513含有下述组件:含有 A.niger glaA启动子、ORF编码cre-重组酶(AAY56380)和A.nidulans niaD终止子的表达盒；含有A.nidulans gpdA启动子、编码潮霉素B抗性蛋白的ORF和P.chrysogenum penDE 终止子(Genbank: M31454.1，核苷酸1750-2219)的表达盒；含有AMAl区和CAT氯霉素抗性基因的得自PAMPF21的载体。图12表示pEBA513的图谱。
[0360]实施例15 失活 Rasamsonia emersonii 中的 ReKu80 基因。
[0361]分离缺失构建体pEBAlOOl和pEBA1002的线性DNA，并使用前面如W02011\054899 中所述的方法，用所述线性DNA转化Rasamsonia emersonii CBS393.64。这些线性DNA可在ReKu80基因座处整合进基因组，因而如图13中所示通过ble基因置换ReKu80基因。根据如W02011/054899中描述的程序，在腐草霉素培养基上选择转化体，纯化并测试菌落。使用缺失盒的gpdA启动子中的引物和针对5’靶向区的基因组序列直接上游的引物，通过PCR 诊断在ReKu80基因座处整合的生长的菌落。在大约250转化体的池中，4个菌株显示了基因组ReKu80基因的去除。
[0362]随后，将3个候选的ReKu80敲除菌株用pEBA513转化，以通过cre重组酶的瞬时表达去除ble选择标记。将pEBA513转化体覆盖地在含有50 u g/ml潮霉素B的再生培养基上铺平板。潮霉素-抗性转化体在含有50 u g/ml的潮霉素B的PDA上生长，以允许cre 重组酶表达。将单个菌落在非选择性Rasamsonia琼脂培养基上铺平板，以获得纯化的孢子批次。通过在有和没有10 u g/ml腐草霉素的培养基上培养转化体，通过表型测试ble标记的去除。用pEBA513(有cre重组酶)转化之后的多数(>90%)转化体是腐草霉素敏感的， 这表示基于pEBAlOOl和pEBA1002的ble标记的去除。随后，通过在有和没有50 u g/ml潮霉素的培养基上培养转化体，在表型上诊断ble-阴性菌株中的PEBA513构建体的去除。大约50%的转化体丢失了潮霉素抗性，这归因于PEBA513质粒的自发的丢失。缺失ReKu80基因和不存在pEBA513质粒通过PCR分析和Soutern印迹证实。
[0363]选择菌株8 Ku80-2作为有失活的Ku80基因的代表菌株。
[0364]实施例16 构建 R.emersonii ReTif35 缺失盒
[0365]对Rasamsonia emersonii菌株CBS393.64的基因组DNA测序并分析。鉴定了所翻译的蛋白质被表示为ReTif35的基因。R.emersonii ReTif35基因的序列(包含ORF的基因组序列和大约1500bp的5’和3’侧翼区)、cDNA序列和蛋白序列在序列表44至46中示出。
[0366]使用双向基因-祀向方法设计并根据常规克隆程序构建R.emersoniic ReTif35 基因的基因替换载体(见图14和15)。pEBA1007构建体包含用于在ReTif35基因座中靶向的ReTif350RF的1500bp5’侧翼区、lox66位点和通过A.nidulans gpdA启动子驱动的ble 编码区5’部分(图14)。pEBA1008构建体包含ble编码区的3’部分、A.nidulans trpC终止子、lox71位点和用于靶向ReTif35基因座的ReTif350RF的1500bp3’下游侧翼区(图 15)。
[0367]实施例17R.emersonii中的稳定的载体宿主_系统
[0368]使用前面在专利W02011054899中所述的方法，用环状质粒pDSM-JAK-108和 ReTif35 缺失构建体 pEBA1007 和 pEBA1008 的线性 DNA 共转化 Rasamsonia emersonii CBS393.64菌株。ReTif35缺失构建体在ReTif35基因座处整合，因而如图16中所示通过 ble基因置换ReTif35基因。为了补偿缺失的必需基因ReTif35，共转化携带P.chrysogenum tif35表达盒的pDSM-JAK-108。为了容易地检测pDSM-JAK-108质粒的存在，质粒还含有 DsRed.SKL表达盒。如W02011054899中描述的，在腐草霉素培养基上选择转化体。
[0369]以高频率(~30%)鉴定出包含tif35_和DsRed.SKL-表达质粒的红色荧光菌落。 如下如下对红色转化体进行菌落纯化:在非选择性Rasamsonia琼脂培养基上培养，之后将孢子在Rasamsonia琼脂培养基平板上再划线以获得单个菌落。来自每一转化体的所有单个菌落隔离群保持红色。即使如上所述的在Rasamsonia琼脂培养基上九个随后的孢子形成和单菌落分离周期之后，红色继续存在。这显示，即使在非选择性培养基上延长的培养后，DsRed.SKL标记仍稳定地存在。
[0370]相对地，在用pDSM-JAK-108和pAN8共转化的其基因组中仍含有必需基因ReTif35 的转化体中，转化后4天观察到一些红色菌落，但是7天之后，根本观察不到红色菌落。这些数据表明，没有使用必需基因tif35的选择时,在Rasamsonia emersonii繁殖期间AMAl 质粒迅速丢失。
[0371]PCR诊断和Southern印迹证实了在所有测试的红色荧光转化体中，基因组R.emersonii ReTif35基因被ble盒置换。为了测定pDSM-JAK-108是否仍是细胞中的附加体，使用pDSM-JAK-108质粒作为探针，进行Southern印迹。为了测定pDSM-JAK-108是否在细胞中是完整的，从红色荧光转化体中分离总DNA，来转化E.coli，针对存在完整的 pDSM-JAK-108,分析E.coli菌落。分离自E.coli转化体的DNA的Southern印迹分析和限制性酶分析二者证实，在红色荧光R.emersonii转化体中存在完整的附加体pDSM-JAK-108。 这表示，即使在非选择性培养基上延长的培养之后，质粒pDSM-JAK-108仍稳定地存在。
[0372]总之，这些发现表明，在其中必需基因ReTif35被缺失的R.emersonii菌株中，表达Pchr ? tif35基因的附加体AMAl质粒pDSM-JAK-108在有丝分裂上是稳定的。
[0373]实施例18 构建 P.chrysogenum aurl 缺失盒。
[0374]为了表明必需基因用作工具来稳定丝状真菌中复制型质粒的用途不限于tif35 基因，发明人利用了备选的必需基因来稳定P.chrysogenum中的AMAl质粒。为此,发明人选择使用编码对于鞘脂合成而言需要的酶一磷脂酰肌醇:神经酰胺肌醇磷脂转移酶的 A.nidulans aurl基因。已表明该基因在多种真菌种中是必需的。为了缺失P.chrysogenum aurl(Pcl2gl5520)基因的基因组拷贝，通过Gateway技术构建质粒pDSM-JAK-139 (图21)。 使用P.chrysogenum DS54465DNA作为模板,分别用下述寡核苷酸组合扩增分别包含来自 P.chrysogenum aurl 基因上游区和下游区(在 Genbank AM920427.1 中为 nt3709510 至 3710991 和 3712509 至 3713859)的 1538bp 和 1406bp 的两个 DNA 片段: [0375]DSM-JAK-164
[0376]5’ -GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGGCCCAACGCATGTGTACGAGAGTCAAGG-3’ (SEQ ID NO:47) +
[0377]DSM-JAK-165
[0378]5，-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGAGACGGAAGGAGATCGCGTAACAG-3，
[0379](SEQ ID NO:48)和
[0380]DSM-JAK-166
[0381 ] 5，-GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGGGCGCAGTCCATTCTTGCATCTAC-3，
[0382](SEQ ID NO:49) +
[0383]DSM-JAK-167
[0384]5，-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGGGCCCAGCCACTTCTTGTATCACGGAT-3，
[0385](SEQ ID NO: 50)，分别重组进载体 pDONR P4-P1R 和 pDONR P2R-P，产生质粒 pDSM-JAK-137 和 pDSM-JAK-138。 将 pDSM-JAK-137、pENTR221-niaDF1-amdS_niaDF2 和 pDSM-JAK-138 与载体 pDEST R4-R3 重组，产生质粒 pDSM-JAK-139 (图 21)。
[0386]实施例19 构建含有 Aspergillus nidulans aurl 和 DsRed.SKL 标记的 AMAl 质粒 pDSM-JAK-136。
[0387]如下构建含有A.nidulans aurl的AMAl质粒。
[0388]使用基因组A.nidulans FGSC A4DNA作为模板，用下述寡核苷酸扩增包含aurl 编码序列及其启动子和终止子区(在Genbank BN001303.1中为nt351475至348062)的 3438bp DNA 片段:
[0389]DSM-JAK-162
[0390]5，-AGAGAGGATCCGAGTTGGCCAGTTGACAACCTGAG-3’ (SEQID.NO:51)和[0391]DSM-JAK-163
[0392]5，-AGAGAGCGGCCGCGAGTATGAGCGATCGACACGAATG-3’ (SEQ ID N0.52)。用 NotI 和 BamHI消化PCR片段并在质粒pDSM-JAK-107的NotI和BglII位点之间克隆，产生质粒 pDSM-JAK-136 (图20)。以这种方式构建含有Anid ? aurl表达盒、AMAl复制子和DsRed.SKL基因的E.coli/P.chrysogenum穿梭载体。除了 aurl编码序列，质粒pDSM-JAK-136与 P.chrysogenum菌株的基因组不具有显著的相似性，也与包括Aspergillus niger的大多数其他丝状真菌不具有显著的相似性。
[0393]实施例20使用aurl的P.chrysogenum中的稳定的载体宿主_系统
[0394]将质粒pDSM-JAK-136 (实施例20)以环状形式与P.chrysogenum A aurl盒共转化进P.chrysogenum DS54465的原生质体中。通过ApaI消化从pDSM-JAK-139 (实施例21) 中释放出P.chrysogenum A aurl盒,产生9145bp片段,并从琼脂凝胶中纯化。
[0395]转化体在乙酰胺平板上选择。如上文所述的(实施例7)，以高频率鉴定出包含DsRed.SKL-表达质粒的红色荧光菌落。如通过菌落PCR、通过Southern印迹、和通过再转化进E.coli DH5a随后通过广泛的限制性分析所表明的，在大多数情况下质粒 pDSM-JAK-136以完全完整的形式存在，所述菌落PCR使用寡核苷酸DSM-JAK-162 (SEQ ID.NO: 51)和 DSM-JAK-163 (SEQ ID.NO: 52)扩增含有 Anid ? aurl 表达盒的 3438bp 片段 (SEQ ID.NO:53)。发明人观察到，在非选择性培养基上连续的菌丝体生长期间和在非选择性培养基上的分生孢子形成和萌发后，红色荧光表型充分稳定至少两个周期。这再次暗示 P.chrysogenum细胞中存在充分稳定的复制型质粒。
[0396]通过菌落PCR使用下述寡核苷酸组合来表明转化体中aurl的基因组拷贝的缺失:
[0397]DSM-JAK-168
[0398]5，-AGCTTT GACGCTAGATTGGAGATG-3’ (SEQ ID.NO:54) +
[0399]5-引导-niaD-反向(SEQ ID.N0.18)(预期的 1647bp)和
[0400]DSM-JAK-169
[0401 ] 5，-CAAGCAAGCCATCTCAACAAGTGC-3，(SEQ ID.NO:55) +
[0402]3-引导-niaD-正向(SEQ ID.N0.8)(预期的 1531bp)。
[0403]在aurl基因座处正确重组后，这些应该仅扩增出指示大小的扩增DNA片段。鉴定出多个独立的PCR阳性转化体，并通过孢子形成和在乙酰胺选择平板上选择单个孢子来纯化。Southern印迹分析显示了 aurl的正确的缺失。鉴定出携带具有补充的Anid *aurl表达盒的复制型质粒的多个独立的Aaurl菌株。
[0404]实施例21 构建 Saccharomyces cerevisiae TIF35 缺失盒。
[0405]为了表明在稳定的复制型质粒中使用AMAl复制子对本文所述的方法对而言不是必要的，发明人利用了备选的复制子来稳定真菌中的质粒。因为除了 AMAl之外，没有其他复制子对丝状真菌而言是可利用的，发明人选择利用含有低拷贝CEN/ARS的质粒，面包酵母Saccharomyces cerevisiae作为宿主。选择S.cerevisiae TIF35基因作为必需基因来稳定复制型质粒。
[0406]为了缺失S.cerevisiae TIF35 (YDR429C)基因的基因组拷贝，使用质粒pUG6作为模板，用下述寡核苷酸通过PCR制备1715bp的A tif35:: loxP-KanMX4-loxP缺失盒:[0407]DSM-JAK-139
[0408]5， -TACTCGCTGTATTGAAAGGATCAAAAGACCAAAGACCACCAGGAATAATGCCAGCTGAAGCTTCGT ACGC-3，(SEQ ID NO:56)和
[0409]DSM-JAK-140
[0410]5，-ATGAGAAGAGTAACATTAGAAAACAAGTGCAGAGCATATTCTGTGCATCTAGCATAGGCCACTAGT GGATCTG-3’(SEQ ID N0:57)。缺失盒的序列在SEQ ID.N0:58中给出。在使用之前，从琼脂凝胶中纯化PCR片段。
[0411]实施例22 构建含有 Saccharomyces cerevisiae TIF35 和 DsRed.SKL 标记的 CEN/ ARS 质粒 pDSM-JAK-134 和 pDSM-JAK-135。
[0412]如下构建含有S.cerevisiae TIF35 的 CEN/ARS 质粒。
[0413]首先，发明人通过用S.cerevisiae TDH3 (YGR192C)启动子替换 S.cerevisiae MET25启动子，为质粒pUG34-DsRed.SKL提供了组成型表达的DsRed.SKL基因。使用基因组
S.cerevisiae BY4742DNA作为模板，用下述寡核苷酸扩增包含Scer ? TDH3启动子区(在 Genbank BK006941.2 中为 nt884500 至 883790)的 728bp DNA 片段:
[0414]DSM-JAK-148
[0415]5’-GAATAAAAAAGAGCTCACGCTTTTTCAGTTCGAGTTTATC-3’ (SEQ ID.NO:59)
[0416]和DSM-JAK-149
[0417]5，-GTTAATAGCAACTCTAACCATGGTTTGTTTGTTTATGTGTG-3，
[0418](SEQ ID.NO: 60)。用 SacI 和 NcoI 消化PCR片段并在质粒pUG34_DsRed.SKL 的 SacI 和NcoI位点之间克隆，产生质粒pDSM-JAK-133 (图17)。以这种方式，构建含有Scer *HIS3 营养缺陷型标记、ARS/CEN复制子和DsRed.SKL基因的E.coli/S.cerevisiae穿梭载体。该质粒用作稳定性实验(实施例23)期间的对照质粒。随后,通过S.cerevisiae TIF35基因替换 pDSM-JAK-133 的 Scer *HIS3 标记。使用基因组 S.cerevisiae BY4742DNA 作为模板， 用下述寡核苷酸扩增包含Scer ? TIF35基因和其启动子区(在Genbank BK006938.2中为 ntl325908 至 1324469)的 1449bp DNA 片段:
[0419]DSM-JAK-137
[0420]5， -GCTTATGGTGGTGGTGCTTCTTATAG-3’
[0421](SEQ ID.NO:61)
[0422]和DSM-JAK-138
[0423]5’ -AGAGGGTACCTGTGCATCTATTCCTTAACCTTAGG-3’
[0424](SEQ ID.NO:62)。用 KpnI 或 Acc65I 消化 PCR 片段并分别在质粒 pDSM-JAK-133 的 Eco47III+KpnI 或 Eco47III+BsiWI 位点之间克隆，产生质粒 pDSM-JAK-134 (图 18)和 pDSM-JAK-135(图 19)。
[0425]实施例23 酵母 Saccharomyces cerevisiae 中 CEN/ARS 质粒的稳定化
[0426]将质粒pDSM-JAK-134 和 pDSM-JAK-135 (实施例 22)以环状形式的与 Scer *tif35 缺失盒(实施例21)共转化进S.cerevisiae BY4742的感受态细胞中。在遗传霉素(G418) 平板上选择转化体。使用led灯，以高频率(>50%)鉴定出有包含DsRed.SKL-表达质粒的红色荧光菌落。如通过再转化进E.coli DH5a随后通过广泛的限制性分析所表明的，在大多数情况下，质粒pDSM-JAK-134或pDSM-JAK-135以完全完整的形式存在。作为对照，发明人将质粒pDSM-JAK-133转化进具有对组氨酸原养型选择的S.cerevisiae BY4742的感受态细胞中。使用荧光辅助的细胞分选(FACS)，发明人观察到，具有pDSM-JAK-134或 pDSM-JAK-135的细胞的红色荧光表型在非选择性培养基上连续生长至少38代期间是充分稳定的。这暗示，在S.cerevisiae细胞中存在充分稳定的复制型质粒。相对地,当在补充有组氨酸的培养基中培养时，含有pDSM-JAK-133的S.cerevisiae细胞丢失了红色荧光(每代约1%)。
[0427]使用下述寡核苷酸，通过菌落PCR表明转化体中TIF35的基因组拷贝的缺失:
[0428]DSM-JAK-146
[0429]5， -AGTACGGTCATTGGACCTGGAATC-3’
[0430](SEQ ID.NO:63)
[0431]和DSM-JAK-147
[0432]5， -CGTTCCATGCACCTCCATGAATGT- ‘3
[0433](SEQ ID.NO:64)
[0434]在TIF35基因座处正确重组，这些应该仅扩增出2249bp的DNA片段，或当存在野生型基因座时，仅扩增1454bp的DNA片段。鉴定出多个独立的PCR阳性转化体。
[0435]实施例24通过定量PCR分析测定P.chrysogenum中的稳定
[0436]的质粒的拷贝数目。
[0437]为了分析P.chrysogenum共转化体中的稳定的复制型质粒的的拷贝数目，发明人使用总基因组DNA进行定量PCR(qPCR)。使用其中通过回归自动测定C(t)值的Bio Rad CFX manager 软件,用 Miniopticon? 系统(Bio Rad),测定基因拷贝数目。SensiMix? SYB`Rmix(Bioline, Alphen aan den Ri jn,荷兰)用 qPCR 的作混合液(master mix),所述 qPCR在25iil反应体积中有0.4 ii M引物和IOOng总DNA。从一式两份实验中计算拷贝数目。
[0438]使用扩增P.chrysogenum tif35 的 178bp DNA 片段的引物 DSM-JAK-174
[0439]5，-CCACCGTTGTCCGCGAACAT-3，(SEQ ID NO:65)
[0440]和DSM-JAK-175
[0441 ] 5，-TCCTTCTCGGCCTCCTTAGC-3，(SEQ ID NO: 66)，进行在 P.chrysogenum 共转化体中的携带必需的tif35基因的稳定的复制型质粒pDSM-JAK-108和pDSM-JAK-120 (分别是实施例7和11)的拷贝数目测定。作为参照，使用扩增在基因组中以一个拷贝存在的编码 P.chrysogenum Y -肌动蛋白(Genbank登录号AF056975)的300bp片段基因的两种引物:
[0442]Act-F3
[0443]5，- CTGGCGGTATCCACGTCACC - 3，(SEQ ID NO:67)
[0444]和Act_R3
[0445]5 ’ - AGGCCAGAATGGATCCACCG - 3 ’ (SEQ ID NO: 68)。未转化的菌株 DS54465 和 DS61187用作对照，每一种在其基因组中携带单拷贝的tif35。
[0446]在两个独立的P.chrysogenum DS54465 A tif35::niaD-amdS-niaD[pDSM-JA K-108]菌株(实施例7)中，质粒pDSM-JAK-108以大约8个拷贝在每一基因组中存在， 而在 P.chrysogenum DS61187 A tif35:: niaD-amdS-niaD [pDSM-JAK-108](实施例 7)和 P.chrysogenum DS54465 A tif35:: niaD-amdS-niaD [pDSM-JAK-120]共转化体(实施例 11)中，每个基因组的质粒的拷贝数目分别为4和3-4个。
[0447]为了测定 P.chrysogenum DS54465 A aurl:: niaD-amdS-niaD [pDSM-JAK-136]转化体(实施例20)中携带A.nidulans aurl基因的质粒pDSM-JAK-136的拷贝数目，发明人使用引物:DSM-JAK-178
[0448]5’ -GGCTGGCTGTTAGTCAACTG-3，(SEQ ID NO:69)和
[0449]DSM-JAK-179
[0450] 5’ - AGGAGGCTGACCTCGATTGT - 3’ (SEQ ID NO: 70)，所述引物扩增包含 A.nidulans AN0465启动子的质粒pDSM-JAK-136 (实施例6)的181bp DNA片段区。编码、肌动蛋白的基因再次用作参照。因为在P.chrysogenum基因组中缺少Panci465DNA片段，在这种情况下， 每基因组携带4个拷贝的Panci465区的菌株——DS61187 Atif35::niaD-amdS-niaD[pDSM-J AK-108](实施例7)被用作参照，而携带0拷贝/基因组的菌株DS54465被用作阴性对照。 发明人观察到，每一基因组中pDSM-JAK-136以10至11个拷贝存在。发明人推测，较之质粒pDSM-JAK-108和pDSM-JAK-120，该质粒的更高的拷贝数目是通过使用异源aurl基因引起的，所述异源aurl基因比同源P.chrysogenum aurl基因更少地表达，因而驱使拷贝数目增加。
【权利要求】
1.包含载体的缺少必需基因的宿主细胞，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞是丝状真菌细胞。
2.根据权利要求1所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞包含重组多核苷酸构建体,所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸。
3.其包含载体的缺少必需基因的宿主细胞，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞包含重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸。
4.根据权利要求3所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
5.根据权利要求3或4所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真菌细胞，优选地是丝状真菌细胞。
6.根据前述任一项权利要求所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞的同源重组(HR)效率增加，非同源重组(HR)效率降低或非同源重组/同源重组(NHR/HR)的比率降低，这优选地以诱导型方式实现。
7.根据前述任一项权利要求所述的宿主细胞，其中宿主细胞对所述必需基因的缺少是诱导型的。
8.根据前述任一项 权利要求所述的宿主细胞，其中所述必需基因是真菌中的必需基因。
9.根据前述任一项权利要求所述的宿主细胞，其中所述必需基因是tif35或aurl基因。
10.根据前述任一项权利要求所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是Aspergillus、 Chrysosporium、PeniciIlium、Rasamsonia、Talaromyces 或 Trichoderma。
11.根据权利要求10所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞是Aspergillusniger、 Penicillium chrysogenum 或 Rasamsonia emersonii。
12.根据前述任一项权利要求所述的宿主细胞，其中所述载体含有来自除了所述宿主物种之外的物种的控制序列。
13.包含根据前述任一项权利要求所述的宿主细胞的载体-宿主系统。
14.用于生产宿主细胞或载体-宿主系统的方法，所述方法包括:a.提供宿主细胞和载体,所述载体至少包含自主复制序列和对所述宿主细胞而言必需的基因，b.用所述载体和所述必需基因的破坏构建体共转化所述宿主细胞，以使所述宿主细胞缺少所述必需基因。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述宿主细胞的同源重组(HR)效率增加，非同源重组(HR)效率降低或非同源重组/同源重组(NHR/HR)的比率降低，这优选地以诱导型方式实现。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中宿主细胞对所述必需基因的缺少是诱导型的。
17.根据权利要求14至16任一项所述的方法，其中所述宿主细胞包含重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸。
18.根据权利要求14至17任一项所述的方法，其中所述必需基因是真菌中的必需基因。
19.根据权利要求14至18任一项所述的方法，其中所述必需基因是tif35或aurl基因。
20.根据权利要求14至19任一项所述的方法,其中所述宿主细胞是Aspergillus、 Chrysosporium、PeniciIlium、Saccharomyces、Rasamsonia、Talaromyces 或 Trichoderma。
21.根据权利要求14至20任一项所述的方法,其中所述宿主细胞是Aspergillus niger、Penicillium chrysogenum、Saccharomyces cerevisiae或Rasamsonia emersonii。
22.根据权利要求14至21任一项所述的方法，其中所述载体含有除了所述宿主物种之外的物种的控制序列。
23.用于生产感兴趣的生物化合物的方法，其包括在有益于生产所述感兴趣的生物化合物的条件下培养权利要求13所述的载体-宿主系统或根据权利要求1至12任一项所述的宿主细胞和任选地从培养发酵液分离所述感兴趣的化合物。
24.用于生产感兴趣的生物化合物的方法，其包括根据权利要求14至23任一项所述的方法生产宿主细胞或载体-宿主系统，和在有益于生产所述感兴趣的生物化合物的条件下培养这种载体-宿主系统或宿主细胞，和任选地从所述培养发酵液分离所述感兴趣的化合物。
25.用于生产感兴趣的生物化合物的方法，其包括:a.提供宿主细胞，所述宿主细胞缺少必需基因，所述宿主细胞包含载体，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞是(i)丝状真菌细胞或(ii)包含下述重组多核苷酸构建体的宿主细胞，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸，b.任选地，对所述宿主细胞提供重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸，c.在有益于生产所述感兴趣的生物化合物的条件下培养所述宿主细胞，并任选地d.从培养发酵液分离所述感兴趣的生物化合物。
26.用于生产感兴趣的生物化合物的方法，其包括:a.提供宿主细胞，所述宿主细胞缺少必需基因，所述宿主细胞包含载体，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞是根据权利要求14至24任一项所述的方法制备的，b.任选地，对所述宿主细胞提供重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸，c.在有益于生产所述感兴趣的生物化合物的条件下培养所述宿主细胞，并任选地d.从培养发酵液分离所述感兴趣的生物化合物。
27.筛选编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸的方法，其包括:a. 提供可能含有编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸的多核苷酸文库，b.提供大量的个体宿主细胞,所述宿主细胞缺少必需基因并包含载体,所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞是(i)丝状真菌细胞或(ii)包含重组多核苷酸构建体的宿主细胞，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸，C.筛选用于表达所述感兴趣的生物化合物的转化体。
28.用于筛选编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸的方法，其包括:a.提供可能含有编码感兴趣的生物化合物的多核苷酸的多核苷酸文库，b.提供大量的个体宿主细胞,所述宿主细胞缺少必需基因并包含载体,所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列，其中所述宿主细胞是根据权利要求14至24任一项所述的方法制备的，c.筛选用于表达所述感兴趣的生物化合物的转化体。
29.根据权利要求13所述的载体-宿主系统或根据权利要求1至12所述的宿主细胞用于生产感兴趣的生物化合物的用途。
30.根据权利要求13所述的载体-宿主系统或根据权利要求1至12所述的宿主细胞用于表达编码感兴趣的化合物的多核苷酸的用途。
31.缺少必需基因的宿主细胞来稳定载体的用途，所述载体至少包含所述必需基因和自主复制序列。
32.根据权利要求29至31任一项所述的用途，其中所述宿主细胞的同源重组(HR)效率增加，非同源重组(HR)效率降低或非同源重组/同源重组(NHR/HR)的比率降低，这优选地以诱导型方式实现。
33.根据权利要求29至32任一项所述的用途，其中宿主细胞对所述必需基因的缺少是诱导型的。
34.根据权利要求29至 33任一项所述的用途，其中所述宿主细胞包含重组多核苷酸构建体，所述重组多核苷酸构建体包含编码感兴趣的生物化合物或参与合成感兴趣的生物化合物的化合物的多核苷酸。
35.根据权利要求29至34任一项所述的用途，其中所述必需基因是真菌中的必需基因。
36.根据权利要求29至35任一项所述的用途，其中所述必需基因是tif35或aurl基因。
37.根据权利要求29至36任一项所述的用途,其中所述宿主细胞是Aspergillus、 Chrysosporium、PeniciIlium、Saccharomyces、Rasamsonia、Talaromyces 或 Trichoderma。
38.根据权利要求29至37任一项所述的用途，其中所述宿主细胞是Aspergillus niger、Penicillium chrysogenum、Saccharomyces cerevisiae或Rasamsonia emersonii。
39.根据权利要求29至38任一项所述的用途，其中所述载体含有来自除了所述宿主种之外的种的控制序列。
40.宿主细胞用来稳定载体-宿主系统的用途，所述宿主细胞是如权利要求29至39中任一项所定义的宿主细胞。
【文档编号】C07K14/385GK103596970SQ201280022798
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年3月12日 优先权日:2011年3月11日
【发明者】鲁洛夫·阿利·兰斯·伯韦比格, 简·安德烈斯·科尼里斯·威廉·基尔, 蒂鲍特·乔斯·维恩策尔, 埃里克·皮特·洛斯 申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司