一种抗肿瘤的pten-vp22基因的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种抗肿瘤的PTEN-VP22基因。本发明所述抗肿瘤的PTEN-VP22基因具有如下序列之一：（i）具有序列表中SEQ?ID?NO.1所述的核苷酸序列；（ii）具有与（i）限定的核苷酸序列至少95%同源性的序列。本发明所述抗肿瘤的PTEN-VP22基因编码的蛋白质可有效的抑制肿瘤细胞，同时该蛋白质可有效地穿透细胞膜，从而对更多的肿瘤细胞产生抑制效应，对于PTEN基因的临床应用起到积极的作用。
【专利说明】—种抗肿瘤的PTEN-VP22基因
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种抗肿瘤的PTEN-VP22基因。
【背景技术】
[0002]肿瘤是威胁人类健康的重要疾病，其治疗方法的研究一直是医学和生命科学研究的重点。肿瘤的生物治疗已被世界医学界公认为是继手术、放射治疗和化学治疗之后的第四大治疗方法，其中的基因治疗更是目前肿瘤生物治疗中最活跃的研究领域之一。基因治疗的原理是将目的基因用基因转移技术导入靶细胞，使靶细胞表达此基因从而获得特定的功能，继而执行或介导对肿瘤的杀伤和抑制作用，从而达到治疗的目的。
[0003]癌基因激活和抑癌基因失活是目前公认的肿瘤发生的重要分子机制。PTEN基因属于抑癌基因中一种，该基因是于1997年发现的一种与人类多种肿瘤的恶性增值与转移密切相关的抑癌基因。
[0004]PTEN 基因(gene of phosphate and tens1n homology deleted on chromsometen, PTEN)又名 MMACl (mutated in multiple advanced cancerl)和 TEPl (TGF-regulatedand epithelial cell-enriched phosphatase),该基因异常广泛存在于人类各种的恶性肿瘤中，如恶性神经胶质瘤、前列腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、黑色素瘤等。PTEN基因正常表达可以抑制肿瘤细胞侵袭、转移和生长；而该基因异常将导致PTEN蛋白表达下降甚至完全不表达。PTEN基因失活与细胞信号转导、肿瘤发病机理、浸润转移、恶性转化、无限制生长和临床预后等有较为密切的关系。
[0005]PTEN基因定位于人类染色体10q23.3区，全长200kb，有9个外显子和8个内含子，其cDNA序列内包含一个由1203个核苷酸组成的开放阅读框，其编码的PTEN蛋白含有403个氨基酸，分布在人体多处组织的细胞质和细胞核内。PTEN编码的蛋白质的氨基酸序列与蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶和蛋白质酪氨酸磷酸酶催化区的核心基序符合，是迄今为止发现的第一个编码具有双重特异磷酸酶功能的抑制肿瘤基因。同其他抑癌基因一样，PTEN为一高度保守基因，不同来源的PTEN的同源性较高，通常在95%以上，甚至于可以达到99%以上，其在细胞的分化中起着重要的作用。
[0006]PTEN编码一个由403个氨基酸组成的一条肽链，PTEN蛋白没有SH2结构，也没有跨膜信号，其是定位于细胞浆的一种磷酸酯酶。PTEN基因具有双重磷酸酶活性，即蛋白磷酸酶活性和脂质磷酸酶活性。磷脂酰基醇一3，4，5—三磷酸[PtdIns (3，4，5)P3，简称PIP3]是PTEN作用的主要底物，PIP3是细胞生长因子的第二信使，其能够促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。而PTEN可以使其去磷酸，降低细胞内的PIP3水平，阻断其后续的生长因子转导通路，使细胞周期阻断在Gl期和促使细胞凋亡，对细胞的生长起负调节作用。当PTEN基因发生体细胞突变或缺失而失活时，导致细胞内PIP3的水平增高，其后的信号转导加强，细胞无限增殖形成肿瘤。此外，PTEN基因也具有蛋白磷酸酶活性，其可以让磷酸化的酪氨酸和丝氨酸局部粘连激酶(FAK)去磷酸，从而抑制整合素介导的细胞浸润和转移；同时，PTEN基因还可以通过抑制MAPK的途径来抑制肿瘤细胞的生长从而达到抑制肿瘤细胞的目的。
[0007]PTEN基因仅是抑癌基因中的一种；在人类大多数的恶性肿瘤中，均有抑癌基因的突变，如P53、PTEN、P16、BRCAU BRCA2、Rbl等。PTEN是目前为止发现的第一个具有双重磷酸酶功能的抑癌基因，在人类的恶性肿瘤中广泛存在突变(约25-50%)，如恶性神经胶质细胞瘤、黑色素瘤、头颈瘤、肾癌等，尤其是在留体激素依赖性肿瘤中如前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢子宫内膜样癌、乳腺癌等，而PTEN基因在子宫内膜癌中的突变是所有恶性肿瘤中检出率最高的，同时也是至今在子宫内膜样腺癌中鉴定出的最常见的突变基因，突变率在36%-83%，在子宫内膜癌前病变中也发现有18-55%的突变率。
[0008]虽然目前肿瘤的基因治疗已成为备受瞩目的研究领域并已显示出良好的应用前景，但是基因治疗的过程需要抑癌的外源基因进入细胞的过程，该过程被称为转导。现有直接将PTEN基因运用到载体或质粒中并对肿瘤细胞进行基因治疗的方式，由于PTEN基因的转导效率较低，因此其成为了阻碍肿瘤的PTEN基因治疗在临床应用的原因之一。
[0009]近几年来，一些蛋白和多肽相继被发现能穿越细胞膜从而具有细胞间转运的特性，该类蛋白或多肽被称为细胞穿透肽。利用细胞穿透肽，已有大量的抑癌蛋白被成功转运，并显示出良好的应用价值。
【发明内容】
[0010]有鉴于此，本发明提供一种抗肿瘤的PTEN-VP22基因，该基因编码的蛋白质可有效的抑制肿瘤细胞，同时该蛋白质可有效地穿透细胞膜，从而对更多的肿瘤细胞产生抑制效应，对于PTEN基因的临床应用起到积极的作用。
[0011]为解决以上技术问题，本发明的第一个目的是提供一种抗肿瘤的PTEN-VP2 2基因，该基因具有如下序列之一:
[0012](i)具有序列表中SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列；
[0013](ii)具有与(i)限定的核苷酸序列至少95%同源性的序列。
[0014]本发明的第二个目的是提供一种包含前述抗肿瘤的PTEN-VP22基因即基因序列(i)或基因序列(ii)的表达载体。
[0015]优选的，本发明进一步采用包含前述抗肿瘤的PTEN-VP22基因即基因序列(i)的表达载体。
[0016]本发明的第三个目的是提供一种制备前述抗肿瘤的PTEN-VP22基因即基因序列
(i)或基因序列(ii)的方法，包括有如下步骤:
[0017]I)以PTEN cDNA为模板，进行PCR扩增；扩增中采用引物PTEN-F:GTCGAATTCATGACAGCCATCATC 与 PTEN-R: GAGAGGTCATGACTTTTGTAATTTGTGT ；
[0018]2)以VP22基因为模板进行PCR扩增；扩增中采用引物VP22-F:TACAAAAGTCATGACCTCTCGCC 与 VP22-R:AATGAATTCTCACTCGACGGGC ；
[0019]3)步骤I和步骤2)中得到的PTEN基因与VP22基因按照质量比为1:1进行PCR ；
[0020]4)以步骤3)产物为模板为，PTEN-F与VP22-R为引物进行PCR。
[0021]优选的，所述步骤1)、2)和4)中PCR扩增的条件为:94°C 3min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 30 个循环；72°C 5min。
[0022]优选的，所述步骤3)中PCR扩增的条件为:94°C 3min ；94°C 30sec，55°C 30sec,72°C lmin,共 10 个循环；72°C 5min。
[0023]本发明的第四个目的在于提供一种前述PTEN-VP22基因即基因序列(i)或基因序列(ii)在制备治疗恶性肿瘤方面药物中的应用。
[0024]优选的，所述恶性肿瘤为前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢子宫内膜样癌、乳腺癌。
[0025]优选的，所述恶性肿瘤为乳腺癌。
[0026]本发明的第五个目的在于提供一种前述抗肿瘤PTEN-VP22基因编码的蛋白质，该蛋白质具有如下序列之一:
[0027](i )具有序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列；
[0028](ii)具有与(i)限定的氨基酸序列至少95%同源性的序列。
[0029]本发明的第六个目的在于提供一种前述PTEN-VP22基因编码的蛋白质即氨基酸序列(i )或氨基酸序列(ii )在制备治疗恶性肿瘤方面药物中的应用。
[0030]优选的，所述恶性肿瘤为前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢子宫内膜样癌、乳腺癌。
[0031]优选的，所述恶性肿瘤为乳腺癌。
[0032]本发明与现有技术相比，其详细说明如下:
[0033]本发明采用的技术方案为:一种抗肿瘤的PTEN-VP22基因，该基因具有如下序列之一:
[0034](i)具有序列表中SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列；
[0035](ii)具有与(i)限定的核苷酸序列至少95%同源性的序列。
[0036]本发明所述序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列为采用将现有PTEN基因与现有的细胞穿透肽之一即VP22基因相结合所得。序列表中SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列中第1-1209个核苷酸为PTEN基因，第1210-2115个核苷酸为VP22基因。PTEN基因为现有用于治疗肿瘤的基因之一，VP22基因所编码出来的多肽可以穿透细胞膜；本发明人经过充分的研究发现，将PTEN基因与VP22基因结合后所得的本发明抗肿瘤基因PTEN-VP22编码出的蛋白质不仅没有因为VP22基因的连入而减弱该蛋白质对于肿瘤细胞的抑制作用，反而由于VP22能够穿透细胞膜，促使该蛋白质可以在细胞间传递，从而可以更加有效地抑制肿瘤细胞。
[0037]本发明所述PTEN基因不仅可以选自人源性PTEN基因，甚至于可以采用与人源性PTEN基因有95%以上同源性的任何来源的PTEN基因，包括鼠源性PTEN基因、犬源性PTEN基因等。
[0038]本发明所述PTEN-VP22基因所编码的蛋白质可以用于抑制现有PTEN基因编码出的蛋白质治疗的各种肿瘤细胞，包括有恶性神经胶质细胞瘤、黑色素瘤、头颈瘤、肾癌、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢子宫内膜样癌、乳腺癌等；令人吃惊的是，本发明人发现本发明所述PTEN-VP22基因所编码的蛋白质尤其对于乳腺癌的抑制作用最为明显。
[0039]本发明所述PTEN-VP22基因的制备方法可以采用现有的将两种基因组合的通用制备方法，还可以采用本发明提供的制备方法，本发明制备方法是在多次试验的基础上获得的，其可以有效的提高本发明所述PTEN-VP22基因的扩增效率。
【具体实施方式】
[0040]为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0041]实施例1一采用PCR的方式构建抗肿瘤的PTEN-VP22基因
[0042]对照例I
[0043]I)以人源性PTEN cDNA为模板，采用引物PTEN-F:
[0044]GTCGAATTCATGACAGCCATCATC 与 PTEN-R:
[0045]GAGAGGTCATGACTTTTGTAATTTGTGT，PCR 扩增基因 PTEN cDNA。PCR 参数:94°C 3min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 30 个循环；72°C 5min。
[0046]2)以基因VP22为模板，采用引物VP22-F:
[0047]TACAAAAGTCATGACCTCTCGCC 与 VP22-R:
[0048]AATGAATTCTCACTCGACGGGC 扩增基因 VP22，PCR 扩增基因 VP22。PCR 参数同 I)。
[0049]3)步骤I)和步骤2)中得到的PTEN基因与VP22基因各10ng做模板，30 μ I体系进行 PCR，参数:94°C 3min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 10 个循环；72°C 5min。
[0050]4)以步骤3)产物为模板，PTEN-F与VP22-R为引物，50 μ I体系进行PCR，参数同I)。
[0051]将步骤4)得到的产物经DNA序列测定确定构建成功，即对照例I抗肿瘤PTEN-VP22基因序列构建成序列表中SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列。
[0052]对照例2
[0053]I)以鼠源性PTEN cDNA为模板，采用引物PTEN-F:
[0054]GTCGAATTCATGACAGCCATCATC 与 PTEN-R:
[0055]GAGAGGTCATGACTTTTGTAATTTGTGT，PCR 扩增基因 PTEN cDNA。PCR 参数:94°C 3min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 30 个循环；72°C 5min。
[0056]2)以基因VP22为模板，采用引物VP22-F:
[0057]TACAAAAGTCATGACCTCTCGCC 与 VP22-R:
[0058]AATGAATTCTCACTCGACGGGC 扩增基因 VP22，PCR 扩增基因 VP22。PCR 参数同 I)。
[0059]3)步骤I)和步骤2)中得到的PTEN基因与VP22基因各10ng做模板，30 μ I体系进行 PCR，参数:94°C 3min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 10 个循环；72°C 5min。
[0060]4)以步骤3)产物为模板，PTEN-F与VP22-R为引物，50 μ I体系进行PCR，参数同I)。
[0061]将步骤4)得到的产物经DNA序列测定确定构建成功，即对照例2抗肿瘤PTEN-VP22基因序列构建成具有与序列表中SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列95%以上同源性的序列。
[0062]对照例3
[0063]I)以犬源性PTEN cDNA为模板，采用引物PTEN-F:
[0064]GTCGAATTCATGACAGCCATCATC 与 PTEN-R:
[0065]GAGAGGTCATGACTTTTGTAATTTGTGT，PCR 扩增基因 PTEN cDNA。PCR 参数:94°C 3min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 30 个循环；72°C 5min。
[0066]2)以基因VP22为模板，采用引物VP22-F:
[0067]TACAAAAGTCATGACCTCTCGCC 与 VP22-R:
[0068]AATGAATTCTCACTCGACGGGC 扩增基因 VP22，PCR 扩增基因 VP22。PCR 参数同 I)。
[0069]3)步骤I)和步骤2)中得到的PTEN基因与VP22基因各10ng做模板，30 μ I体系进行 PCR，参数:94°C 3min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 10 个循环；72°C 5min。
[0070]4)以步骤3)产物为模板，PTEN-F与VP22-R为引物，50 μ I体系进行PCR，参数同I)。
[0071]将步骤4)得到的产物经DNA序列测定确定构建成功，即对照例3抗肿瘤PTEN-VP22基因序列构建成具有与序列表中SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列95%以上同源性的序列。
[0072]实施例2—实施例1中所得对照例1-3的PTEN-VP22基因对于肿瘤细胞的细胞体外实验
[0073]将对照例1-3的PTEN-VP22基因、以及PTEN、VP22基因连入真核表达质粒pcDNA3，分别构建成 pcDNA3-PTEN-VP22、pcDNA3_PTEN、pcDNA3_VP22 表达载体。
[0074]细胞实验一:对乳腺癌细胞BT549的抑制效应
[0075]A、时间效应关系:分另丨」将 Iyg pcDNA3、pcDNA3-PTEN、pcDNA3-VP22、pcDNA3-PTEN-VP22质粒转染24孔板培养的BT549细胞，另设未转染的BT549细胞阴性对照组，每组设8个复孔。转染后细胞继续培养4h，96孔培养板每孔加入细胞悬液100 μ I(IXlO3个细胞)，于37°C，5%C02条件下培养;分别于24h、48h、72h、84h、96h后，每孔加入10 μ I CCK-8溶液，370C，5%C02孵育2h，酶联免疫检测仪测定A450值。将阴性对照组A450值视为I，按下式计算各组细胞的增殖力。
[0076]细胞增殖力=实验组OD A450值/阴性对照组OD A450值
[0077]实验数据用平均值土标准差表示，采用单因素方差分析和Student Newman Keuls进行统计分析，结果显示转染后24h，各组细胞间的增殖力无显著差异；转染后48h、72h、84h、96h，pcDNA3-PTEN-VP22组与其它各组间细胞增殖力差异均具有统计学意义。结果表明，在转染一定时间后，PTEN-VP22对BT549细胞增殖的抑制效应显著强于PTEN。
[0078]表1一转染BT549细胞后不同时间的细胞增值力(人源性PTEN)
[0079]
质粒
\pcDNA3- pcDNA3- pcDNA3-
转染\pcDNA3
\PTENVP22 PTEN-VP22
后时间 \\
24h 0.147 ±0,00416 0.147 ±0.00623 0.142 + 0.0117 0.155 ±0,0144
48h 0.532 ±0.0124 0.446 ±0.0170 0.349 ± 0.0200 0.250 ± 0.0539
72h 0.747 ± 0.0811 0.604 ± 0.0257 0.634 ± 0.0466 0.281 土 0.0264
84h 0.739 + 0.0401 0,645 ± 0,0685 0,703 ±0.0440 0.569 ± 0.0247
96h 0.337 ±0.0286 0.225 ±0.0118 0317 ±0.0285 0.153 ±0.0119
[0080]表2—转染BT549细胞后不同时间的细胞增值力(鼠源性PTEN)
[0081]
【权利要求】
1.一种抗肿瘤的PTEN-VP22基因，该基因具有如下序列之一: (i)具有序列表中SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列； (?)具有与(i)限定的核苷酸序列至少95%同源性的序列。
2.包含权利要求1所述的抗肿瘤的PTEN-VP22基因的表达载体。
3.制备权利要求1所述的抗肿瘤的PTEN-VP22基因的方法，包括有如下步骤: 1)以PTENcDNA为模板，进行PCR扩增；扩增中采用的引物PTEN-F: GTCGAATTCATGACAGCCATCATC 与 PTEN-R:
GAGAGGTCATGACTTTTGTAATTTGTGT ； 2)以VP22基因为模板进行PCR扩增；扩增中采用引物VP22-F: TACAAAAGTCATGACCTCTCGCC 与 VP22-R:
AATGAATTCTCACTCGACGGGC ；3)步骤I和步骤2)中得到的PTEN基因与VP22基因按照质量比为1:1进行PCR ； 4)以步骤3)产物为模板为，PTEN-F与VP22-R为引物进行PCR。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:所述步骤1)、2)和4)中PCR扩增的条件为:94°C 3min ；9 4°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 30 个循环；72°C 5min。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:所述步骤3)中PCR扩增的条件为:940C 3min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，共 10 个循环；72°C 5min。
6.权利要求1所述的PTEN-VP22基因在制备治疗恶性肿瘤方面药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述恶性肿瘤为乳腺癌。
8.权利要求1所述的抗肿瘤PTEN-VP22基因编码的蛋白质，该蛋白质具有如下序列之 (i)具有序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列； (?)具有与(i)限定的氨基酸序列至少95%同源性的序列。
9.权利要求8所述的PTEN-VP22基因编码的蛋白质在制备治疗恶性肿瘤方面药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述恶性肿瘤为乳腺癌。
【文档编号】C12N15/12GK104178488SQ201310190582
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月21日 优先权日:2013年5月21日
【发明者】雷军, 余娴, 胥正敏, 李婷婷 申请人:川北医学院