植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLA1及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLA1及其编码基因与应用。所述蛋白ZmLA1来源于玉米（Zea?mays?L.），由序列表序列1所示的氨基酸序列组成。本发明所提供的蛋白质或所述基因可用于调控目的植物如下四种性状中至少一种的应用：生长素向基极性运输效率、生长素侧向运输效率、茎秆抗倒伏能力和花器官发育；所述花器官发育性状包括雌穗花期、雄穗花期、雄穗分枝数、雌穗穗柄长度、雌穗花丝数目、雌穗鲜重、果穗长度和结实率中的至少一种。本发明所提供的基因和蛋白在植物茎秆抗倒伏性、理想株型、花器官形态等一系列与产量直接相关性状的改良中具有广阔的应用前景。
【专利说明】植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLAI及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLAl及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002]作为最早为人类认识的植物激素，生长素广泛参与植物生长发育过程的各个阶段。生长素的合成主要以两种方式进行:色氨酸依赖途径和非色氨酸依赖途径。其合成部位主要包括植物顶端分生组织、叶原基、萌发的种子及花粉等新形成的组织。相较于生长素局部区域合成这一特性，生长素极性运输( PAT)是引起植物生长素不均一分布的更主要原因。生长素运输不同于其它植物激素，是以一种极性运输的方式进行，即体内运输方向是单向的，只能从植物体形态学上端向形态学下端运输。通过这种极性运输建立起的生长素浓度梯度特异介导了植物一系列生物学反应，如:细胞伸长、细胞分化、根的伸长、向光性、重力性、顶端优势、花分化和果实形成等。这个过程需要两类生长素运输载体:输入载体和输出载体。拟南芥中已鉴定的生长素输入载体主要有四类:AUX1，LAX1，LAX2和LAX3(类AUXl蛋白)。而输出载体主要包括PIN蛋白家族，在拟南芥中现已鉴定出8个PIN基因，它们可分为两类:长PIN蛋白(PIN1，2，3，4和7)主要定位于细胞质膜上，介导生长素细胞间极性运输；短PIN蛋白(PIN5, 6和8)则定位于内膜系统上,介导生长素的胞内运输。
[0003]拟南芥输出载体除了 PIN蛋白家族外，最近研究发现多重抗药性/磷酸糖蛋白家族(multidrug-resistant/P-glycoprotein,MDR/PGP,ABCB)也参与了生长素极性运输。它是ATP结合盒(ATP—binding cassette, ABC)转运蛋白超级家族中的一个亚家族。其中，PGPl (ABCBl)是最早被发现与生长素极性运输相关的PGP家族成员。另外，PGP4 (MDR4)和PGP19 (MDR1/ABCB19)也分别被证明作用于植物生长素的极性运输。
[0004]植物重力性反应体现为地上部正向重力性反应和根负向重力性两部分，正常的重力性反应对根和地上部各器官的形态发育和生物学功能是必需的。早在近一个世纪之前，人们就提出Cholodny-Went假说，认为生长素的不对称分布是导致植物向重性和向光性等向性运动的原因。Li等也证明烟草向性运动相应部位发生了生长素的不对称分布。生长素还参与调节拟南芥根的重力性反应，这些结果都正面支持了 Cholodny-Went假说的正确性。
[0005]近年来对于生长素介导植物根重力性生长的研究报道不断涌现。根中生长素的极性分布依赖于AUXl蛋白，auxl突变体表现为根重力性完全丧失。PGP4也参与拟南芥根中生长素运输，pgp4突变体根中生长素向基运输速度明显降低，根向重性反应也随之钝化。最近root growth factors (RGFs)分泌妝家方矣成员和phosphatidylinositol monophosphate5-kinase 2 (PIP5K)分别被证明通过调控生长素输出载体的胞内循环来调节植物地上和地下多器官的重力性反应。水稻LAZYl负向调控生长素极性运输，相应的水稻和拟南芥Iazyl突变体都表现为地上部重力性反应减弱并伴随分枝角度增大。最近研究者提出一个“tipping point”机制，证明在重力性弯曲生长过程中，一定倾斜角度可作为触发点，引起生长素极性运输流向发生反转，充分证明了生长素极性运输与重力性反应的直接相关性。
[0006]生长素极性运输参与的另外一个重要生物学过程是调控分生组织发育和花器官形态建成。以玉米为例，花器官包含雄穗，发育自顶端分生组织；雌穗，发育自雄穗数个节下的腋生分生组织。除着生位置不同外，雌雄穗表现出不完全相同的发育模式，其中雄穗发育包含四种类型的分生组织:特异的分枝分生原基(branch meristem, BM),小穗对分生原基(spikelet pair meristems, SPMs),小穗分生原基(spikelet meristems, SMs)和小花分生原基(floral meristems, FMs),然而雌穗发育仅包含SPMs, SMs和FMs。通过对一系列玉米雌雄穗生长素运输相关基因的研究，发现特异的生长素浓度梯度对各级分生原基的生长分化都是必不可少的。玉米生长素输出载体ZmPINla和ZmPINlb特异定位于顶端分生组织和腋生组织的表皮细胞层中，预示着生长素极性运输在花器官起始发育中的重要作用。玉米Barren inflorescence2 (Bif2)编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PINOID (PID)同源蛋白，通过调控PIN蛋白亚细胞极性定位控制生长素极性运输，且此作用过程在玉米和拟南芥中是保守的。bif2突变则引起雌穗籽粒数减少且雄穗分枝数和小花数明显减少。另外一个半显性bifl突变体中，腋生分生组织的生长素运输速率降低，造成与bif2相似的表型。basichelix - loop - helix (bHLH)转录因子Barren stalkl (Bal)参与了玉米腋生分生组织的起始过程，且bal突变体表现为雌穗、雄穗分枝、小花完全缺失。BAl特异表达于花器官分生组织的边界处，并介导形成了局部的生长素浓度梯度，但BAl在生长素极性运输调控途径中的上下游位置尚存争议。
[0007]除了生长素极性运输，通过生长素的局部合成建立的生长素浓度梯度也在玉米花器官发育中起重要作用。玉米sparse inflorescencel (spil)编码黄素单氧酶,其介导催化Trp依赖性生长素合成途径中的限速步骤，与拟南芥YUCCA基因同源，参与腋生分生组织和侧生器官的生长分化，最终完成花器官的形态建成。另一个生长素合成基因vanishingtassel2(vt2)同样为花器官的腋生分生组织发育所必需。遗传学分析表明生长素极性运输与局部组织中的生物合成能协同作用于调控玉米花器官发育过程。
[0008]尽管大量研究已明确表明生长素在重力性反应和花器官发育中的重要作用，但还没有同时参与这两个过程调控基因的报道。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是提供一种植物倒伏和花器官发育调控蛋白ZmLAl及其编码基因与应用。
[0010]本发明所述蛋白质ZmLAl,来源于玉米(Zea mays L.),是如下a)或b)的蛋白质:
[0011]a)由序列表序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0012]b)将序列表序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物倒伏和/或花器官发育相关的由(a)衍生的蛋白质。
[0013]序列表序列I所示的氨基酸序列由413个氨基酸残基组成，其中，第70-90位氨基酸肽段为跨膜结构域，第275-298位、第338-345位两段肽段为罗宾逊(Robinson)核定位信号。
[0014]为了使上述(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0015]表1标签的序列
[0016]
【权利要求】
1.一种蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质: a)由序列表序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b)将序列表序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物倒伏和/或花器官发育相关的由(a)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白质的编码基因； 所述基因具体可为如下I)-4)基因中的任意一种: 1)其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子； 2)其核苷酸序列是序列表序列3所示的DNA分子； 3)与I)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子； 4)在严格条件下与I)或2)或3)限定的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。
3.含有权利要求2所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒； 所述重组载体具体可为在pCAMBIA3301-UbiN的BamH I和Kpn I酶切位点之间插入权利要求2所述基因得到的重组载体。
4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的基因在调控目的植物如下四种性状中至少一种的应用:生长素向基极性运输效率、生长素侧向运输效率、茎杆抗倒伏能力和花器官发育； 所述花器官发育性状包括雌穗花期、雄穗花期、雄穗分枝数、雌穗穗柄长度、雌穗花丝数目、雌穗鲜重、果穗长度和结实率中的至少一种。
5.一种获得具有如下至少一种表型植物的方法，包括降低所述植物中权利要求1所述蛋白表达、和/或抑制权利要求2所述基因的转录的步骤:生长素向基极性运输效率提高，生长素侧向运输效率降低，茎杆抗倒伏能力降低，雌穗花期延迟、雄穗花期延迟、雄穗分枝数减少、雌穗穗柄长度降低、花丝鲜重降低、果穗长度降低、结实率降低。
6.一种获得具有如下至少一种表型植物的方法，包括提高所述植物中权利要求1所述蛋白表达、和/或促进权利要求2所述基因的转录的步骤:生长素向基极性运输效率降低，生长素侧向运输效率提高，茎杆抗倒伏能力增强，茎杆受外力倾斜后恢复直立速度的提高，雌穗花期提早、雄穗花期提早、雄穗分枝数增加、雌穗穗柄长度增加、花丝鲜重增加、果穗长度增加、结实率提高。
7.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2所述基因导入目的植物中，得到与所述目的植物相比具有如下至少一种表型的转基因植物: 生长素向基极性运输效率降低，生长素侧向运输效率提高，茎杆抗倒伏能力增强，茎杆受外力倾斜后恢复直立速度的提高，雌穗花期提早、雄穗花期提早、雄穗分枝数增加、雌穗穗柄长度增加、花丝鲜重增加、果穗长度增加、结实率提高。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述导入是通过权利要求4所述重组载体实现的。
9.根据权利要求5—8中任一所述的方法或应用，其特征在于:所述植物和所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物，所述单子叶植物具体可为玉米。
10.如下A) — C)中任一种引物对或引物对组合物及其在玉米育种中的应用:A)引物对M4和引物对M5；B)引物对M4；C)引物对M5；所述引物对M4由序列表序列4所示的单链DNA和序列表序列5所示的单链DNA组成；所述引物对M5由序列表序列6所 示的单链DNA和序列表序列7所示的单链DNA组成。
【文档编号】C12N5/10GK104177481SQ201310189177
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月21日 优先权日:2013年5月21日
【发明者】金危危, 董朝斌, 陈晓阳 申请人:中国农业大学